1.4.7  反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测  应用PCR扩增仪(Biometra，德国)检测肺组织中Fasl mRNA的表达：取左肺下极1 cm³制备10%肺组织匀浆，Trizol法(Invitrogen，美国)抽提总RNA，反转录合成cDNA，然后应用PCR扩增仪进行扩增，Fasl mRNA引物[宝生物工程(大连)有限公司]序列如表1。Fasl mRNA反应条件：94 ℃预变性2 min；95 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。β-actin反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸     5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，凝胶成像仪成像。采用Scion Image图像分析系统分析仪目的产物与β-actin灰度值的比值反映Fasl mRNA表达水平。

2.2  各组肺组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β生化指标及血氧分压的比较  与假手术组比较，模型组肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平升高，血氧分压下降(P < 0.05)；与模型组比较，依托咪酯后处理组中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平下降，血氧分压升高(P < 0.05)；与依托咪酯后处理组比较，地塞米松0.5 mg/kg组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和血氧分压变化差异无显著性意义(P > 0.05)，而地塞米松0.2 mg/kg组和地塞米松1.0 mg/kg组中各指标变化差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.3  各组肺免疫组织化学染色形态  在光学显微镜下可见，假手术组肺细胞条索排列整齐，肺泡内可见少量白细胞浸润；模型组可见肺泡内有大量炎性细胞浸润，视野内呈棕黄色浓染的坏死细胞增多；依托咪酯后处理组视野内可见少量散在点状浓染坏死灶以及肺间质内少量炎性细胞浸润；在地塞米松干预的3组中，随着地塞米松剂量的增加，肺泡和肺间质内炎性细胞及坏死细胞逐渐减少，见图1。

2.4  各组肺细胞Hoechst 33258染色、凋亡指数及肺湿/干质量比的比较  与假手术组比较，模型组凋亡指数、肺湿/干质量比升高(P < 0.05)；与模型组比较，依托咪酯后处理组凋亡指数及肺湿/干质量比下降(P < 0.05)；与依托咪酯后处理组比较，地塞米松0.5 mg/kg组凋亡指数及肺 湿/干质量比变化无显著性差异(P > 0.05)，而地塞米松  0.2 mg/kg组中凋亡指数及肺湿/干质量比变化有显著性差异(P < 0.05)，见图2及表3。

2.4  各组肺细胞Hoechst 33258染色、凋亡指数及肺湿/干质量比的比较  与假手术组比较，模型组凋亡指数、肺湿/干质量比升高(P < 0.05)；与模型组比较，依托咪酯后处理组凋亡指数及肺湿/干质量比下降(P < 0.05)；与依托咪酯后处理组比较，地塞米松0.5 mg/kg组凋亡指数及肺 湿/干质量比变化无显著性差异(P > 0.05)，而地塞米松  0.2 mg/kg组中凋亡指数及肺湿/干质量比变化有显著性差异(P < 0.05)，见图2及表3。

2.5  各组肺组织Fas蛋白表达的比较  与假手术组比较，模型组肺组织Fas蛋白升高(P < 0.05)；与模型组比较，依托咪酯后处理组Fas蛋白下降(P < 0.05)；与依托咪酯后处理组比较，地塞米松0.5 mg/kg组Fas变化无显著性差异(P > 0.05)，而地塞米松0.2，1.0 mg/kg组中Fas蛋白表达变化有显著性差异(P < 0.05)，见表4及图3。

2.5  各组肺组织Fas蛋白表达的比较  与假手术组比较，模型组肺组织Fas蛋白升高(P < 0.05)；与模型组比较，依托咪酯后处理组Fas蛋白下降(P < 0.05)；与依托咪酯后处理组比较，地塞米松0.5 mg/kg组Fas变化无显著性差异(P > 0.05)，而地塞米松0.2，1.0 mg/kg组中Fas蛋白表达变化有显著性差异(P < 0.05)，见表4及图3。

2.6  各组Fasl mRNA的比较  与假手术组比较，模型组Fasl mRNA表达明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，依托咪酯后处理组Fasl mRNA表达降低(P < 0.05)；与依托咪酯后处理组比较，地塞米松0.5 mg/kg组Fasl mRNA无显著性差异(P > 0.05)，见表4及图4。

肢体缺血再灌注肺损伤是目前临床工作中非常热议的话题。随着对缺血再灌注领域的深入研究，发现除了缺血再灌注的脏器本身被损伤外，其远隔脏器也可能受累。有研究表明，缺血再灌注损伤机制与复杂的信号传导通路关系十分密切，例如：前期研究证实，大鼠肢体缺血再灌注肺损伤与MMP-9/TIMP-1信号通路和Toll-样受体4/核转录因子κB信号通路有关等^[1-2]。在近期文献报道的诸多损伤机制的研究中，Fas/Fasl信号通路的研究逐渐引起缺血再灌注领域的关注，Fas及其配体FasL是近年来研究最为深入的有关细胞凋亡的膜表面分子，阐明它们在凋亡中作用机制，对深入了解细胞凋亡的机制产生了深远的影响^[3]。有研究表明，依托咪酯可以通过下调Fas/Fasl减轻大鼠脑缺血再灌注损伤^[4]。

根据上述文献研究结果可以猜想，依托咪酯是否通过Fas/Fasl影响肺损伤，目前在该领域还没有相关报道。实验以大鼠为研究对象，探讨依托咪酯后处理对肢体缺血再灌注肺损伤影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods 

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2019年1月在沈阳医学院附属中心医院(动物实验室)完成。

1.3  材料  成年雄性6-8月龄SD大鼠180只，由中国医科大学实验室中心提供，许可证号：SYXK (辽) 2018-0007，体质量280-320 g。动物饲养室温(24±1) ℃，湿度(45-55)%；采用透明、保温的材质制成的保温箱，以保证饲养箱内24 h自然昼夜交替，自由饮水。

1.4  实验方法

1.4.1  分组和建模  采用随机数字表法将180只SD大鼠分为6组(n=30)：假手术组、模型组、依托咪酯后处理组、地塞米松0.2，0.5，1.0 mg/kg组。按参考文献[7]方法制作大鼠肢体缺血再灌注肺损伤模型。造模前12 h禁食，自由饮水。腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，右颈外静脉置管建立静脉通路。于大鼠双后肢股三角区切开肤，分离股动脉和股静脉，采用无创微动脉夹于近腹股沟韧带处夹闭股动脉，使双后肢缺血2 h，随后松开无创微动脉夹，再灌注3 h。应用ES-1000 SPM超声血流仪(Hayashi Denki，大阪，日本)监测血流，以未监测到血流为缺血成功标志，监测到血流为再灌注成功标准。所有实验大鼠在实验过程中静脉输注生理盐水1.5 mL/(kg•h)以补充生理需要量。假手术组仅常规开腹手术以及分离股动脉和股静脉，但不夹闭；模型组制备肢体缺血再灌注模型；依托咪酯后处理组于缺血后2 h即刻尾静脉注射依托咪酯(江苏恩华股份有限公司，徐州，中国)1.0 mg/kg(稀释在2 mL生理盐水中)，再灌注3 h；地塞米松0.2，0.5，1.0组于缺血后2 h即刻尾静脉分别注射地塞米松 0.2，0.5，1.0 mg/kg(均稀释在2 mL生理盐水中)；其他各组以等量生理盐水2 mL经尾静脉注射替代。

1.4.2  血气分析  于大鼠肢体再灌注3 h时即刻颈动脉取血3 mL，应用Gem Premier3000型血气分析仪(南京利艾成贸易有限公司，南京，中国)立即行动脉血气分析，并记录血氧分压。随后麻醉处死大鼠。

1.4.3  大鼠肺组织生化指标及湿/干质量比的检测  采用ELISA法检测肺组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平。于大鼠肢体再灌注3 h时取左肺上极组织1 cm³，制成10%肺组织匀浆，每组取5孔，将肿瘤坏死因子α标准品按倍比梯度稀释，然后分别加入检测孔(100 μL /孔)。收集上清液，依次加入带测孔(100 μL/孔)，封板，37 ℃温箱避光孵育2 h。洗涤，加入生物素化抗体工作液100 μL/孔，封板，室温孵育1 h。洗涤。加入HRP工作液100 μL/孔，室温孵育20 min。洗涤，加入显色剂100 μL/孔，避光孵育   20 min。加入终止液50 μL/孔，轻轻摇匀后置于酶标仪上测450 nm处吸光度值作为测量值。计算与空白孔吸光度值，并取平均值作为测量值，采用Curve Expert软件做出标准曲线，并输入相应的吸光度值计算出肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β浓度。

取右肺下极组织1 cm³，用4 ℃生理盐水冲洗，去除残留血液，再用滤纸吸干表面水分后测量湿质量(W)，随后将肺组织样本放置于80 ℃环境下烘干48 h，测量干质量(D)，最终计算肺湿质量/干质量比值(W/D)。

1.4.4  免疫组织化学染色  取右肺中极肺组织1 cm³，采用SABC法，实验步骤按试剂盒说明书进行，二抗在室温(37 ℃)孵育30 min，一抗在室温(37 ℃)孵育60 min(一抗、二抗；Santa Cruz，美国)，DAB显色。应用BX-41型显微镜(Olympus，日本)进行镜检，胞浆着色呈棕黄色者为阳性表达的坏死细胞，观察坏死细胞形态。

1.4.5  Hoechst 33258染色  取右肺上极肺组织1 cm³，常规包埋、切片，应用磷酸盐缓冲液进行洗涤；随后添加Hoechst 33258染色液0.5 mL，染色5 min后再用磷酸盐缓冲液重新进行洗涤；将切片放置于载玻片，添加抗淬灭封固液，封盖玻片，在200倍视野荧光显微镜下观察。镜下可观察到正常细胞核呈椭圆形或类圆形、颜色呈暗蓝色；而凋亡细胞的染色质发生固缩，细胞核呈散在的致密浓染或呈碎块状致密浓染，镜下可见发亮、变白。每张切片随机取5个视野，每个视野计数100个细胞。以凋亡细胞数占肺细胞总数的比例作为凋亡指数(Apoptotic Index，AI)，表示肺细胞凋亡情况。

1.4.6  Western Blot检测  采用Western Blot法检测肺组织Fas蛋白表达。取右肺下极肺组织1 cm³，用4 ℃生理盐水冲去残血，滤纸吸干水分，制备10%组织匀浆，离心提取总蛋白，应用DYY-6B型电泳仪(北京六一仪表厂，中国)进行蛋白测定。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转模、封闭后，分别加入兔抗大鼠Fas蛋白多克隆抗体(Santa Cruz，美国)、兔抗大鼠β-actin多克隆抗体(Santa Cruz)，4 ℃孵育过夜；加入碱性磷酸酶标记二抗1∶2 000(Santa Cruz)，室温孵育2 h，酶法显色，扫描。采用Scion Image图像分析系统分析，目的产物与β-actin灰度值的比值分别反映Fas蛋白表达水平。

1.4.7  反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测  应用PCR扩增仪(Biometra，德国)检测肺组织中Fasl mRNA的表达：取左肺下极1 cm³制备10%肺组织匀浆，Trizol法(Invitrogen，美国)抽提总RNA，反转录合成cDNA，然后应用PCR扩增仪进行扩增，Fasl mRNA引物[宝生物工程(大连)有限公司]序列如表1。Fasl mRNA反应条件：94 ℃预变性2 min；95 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。β-actin反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸     5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，凝胶成像仪成像。采用Scion Image图像分析系统分析仪目的产物与β-actin灰度值的比值反映Fasl mRNA表达水平。

1.5  主要观察指标  Fas蛋白和FasL mRNA的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 13.0软件进行分析，正态分布的计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

器官缺血再灌注以及远隔脏器的损伤机制，是临床工作中研究热议的话题。随着外科手术向微创转型，显微镜的应用越来越频繁，清晰的术野便成为微创手术必须满足的最基本要求^[8-9]。在手足外科手术中，止血带的应用可以很好的满足外科医生对术野清晰度的要求，但是接踵而至的便是肢体缺血再灌注所带来的副损伤^[10-11]。早期研究证明，大鼠后肢缺血再灌注可以导致远隔的肺和肾损伤，其损伤机制具有多样性，目前尚无统一定论^[12-13]。Fas蛋白是目前研究很深入的凋亡细胞的膜表面分子蛋白，在细胞凋亡领域日趋备受瞩目^[14-15]。在大鼠肢体缺血再灌注肺损伤发生后，Fas蛋白及其配体Fasl是否参与了损伤过程，目前尚无相关研究报道。实验以大鼠为研究对象，深入探讨肢体缺血再灌注肺损伤过程中，依托咪酯对Fas/Fasl的影响，为肢体缺血再灌注损伤和保护机制领域填补空白。

Fas/FasL信号通路是目前器官损伤领域研究的焦点。FasL可在T淋巴细胞发育进程中，介导细胞毒性诱导的细胞凋亡^[16-17]。Fas及其配体FasL是近年来研究得最为透彻的与细胞凋亡相关的膜表面分子，也是研究细胞凋亡的新靶点，对进一步了解细胞凋亡的发生机制起到了意义深远的影响^[18-19]。

依托咪酯可以通过多种途径影响细胞损伤的过程。依托咪酯是咪唑类衍生物，安全性高，是麻醉诱导常用的药物，对神经中枢有很强的抑制作用，但无镇痛作用，麻醉诱导起效快，失效也快，在肝脏和血浆内可被酯酶迅速水解而失去活性，其主要代谢产物为羧酸，单剂量使用时可以使肾上腺对外界刺激的反应迟钝，依托咪酯临床应用已有30年的历史^[20-21]。有研究显示，依托咪酯预处理可降低大鼠全肺缺血再灌注损伤过程中促凋亡基因Bax的表达，对肺缺血再灌注损伤有保护作用^[22-23]。依托咪酯发挥再灌注损伤保护作用的机制，可能与激活了细胞膜上的GABA受体，使细胞膜对Cl^-通透性增加，从而形成Cl^-平衡电位，从膜电位水平对缺血再灌注诱发的细胞膜去极化^[24-25]。另外，NMDA受体和Ca²⁺通道具有电压依赖性，细胞膜的去极化被抑制，会导致Ca²⁺内流趋势减弱，减少细胞的耗氧量，因此在缺血再灌注损伤发生时，依托咪酯可以增加细胞对缺血再灌注损伤的耐受性^[26-28]。依托咪酯广泛应用于临床实验性研究和动物实验性研究，有研究表明依托咪酯可用于高血压患者手术、冠心病非心脏手术的患者等，但是依托咪酯是否在大鼠肢体缺血再灌注肺损伤中发挥保护作用，目前尚无统一定论^[29-30]。

实验与其他文献报道不同之处在于，以往的文献报道大多局限于器官本身的缺血再灌注损伤，并且多集中于肺组织中活性氧自由基及丙二醛等自由基损伤角度指标进行研究^[31-32]，而此次实验是将研究靶点锚定于远隔脏器的损伤，并且不固化于自由基损伤领域，扩展到Fas/Fasl信号通路。在结果中可以观察到，与假手术组比较，模型组中Fas/Fasl明显升高，炎性因子大量释放，而血氧分压下降，提示大鼠肢体缺血再灌注肺损伤模型建立成功，为后续实验奠定了造模基础，特别是Fas/Fasl的升高，可以初步推测损伤机制很可能与Fas/Fasl有关；依托咪酯后处理组给予依托咪酯后处理干预之后，损伤明显减轻，提示依托咪酯后处理可以减轻大鼠肢体缺血再灌注肺损伤；进一步研究中发现，依托咪酯后处理组抗损伤的效价强度在统计学角度几乎相当于地塞米松0.5 mg/kg组，两者无显著性差异。此研究结果，不但巩固了依托咪酯后处理对肢体缺血再灌注肺损伤的保护作用，而且对依托咪酯后处理的保护作用进行了“量化”。在实验造模中，实验时间点的设定，距离临床实际手术操作时间有一定的差距，因此对临床指导意义有一定局限性；另外，在实验中，也可能对实验结果造成偏倚，如在判断血流阻断和重新灌注是否成功时，由于超声血流监测仪观察判定有无血流的界定不能完全准确，个别大鼠股动脉阻断后，屏幕隐约仍有极少量血流信号，但由于绝大部分血流已经被阻断，故仍视为完全阻断。后续实验中应加以改进，尽最大可能减少由此带来的实验结果偏倚。

综上所述，结果证实依托咪酯后处理可以减轻大鼠肢体缺血再灌注造成的肺损伤，其作用机制可能与下调Fas/Fasl表达有关；另外，依托咪酯(1.0 mg/kg)后处理的保护作用在统计学角度几乎与地塞米松(0.5 mg/kg)相当。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

依托咪酯：依托咪酯作为催眠性静脉全麻药，属于咪唑类衍生物，安全性高，全身麻醉诱导时呼吸和循环功能抑制作用比较轻微。依托咪酯发挥再灌注损伤保护作用的机制，可能与激活了细胞膜上的GABA受体，使细胞膜对Cl^-通透性增加，从而形成Cl^-平衡电位，从膜电位水平对缺血再灌注诱发的细胞膜去极化。

Fas/Fasl：FasL是可以与死亡受体TNFRSF6/FAS结合的细胞因子，在T淋巴细胞发育进程中介导细胞毒性诱导的细胞凋亡。Fas及其配体FasL是近年来研究得最为透彻的与细胞凋亡相关的膜表面分子，也是研究细胞凋亡的新靶点，对进一步了解细胞凋亡的发生机制起到了意义深远的影响。

在临床工作中，患者下肢长时间缺血，继而再灌注的实际病例损伤过程经常发生，而且难以避免，但很多可能改善的损伤过程的措施无直接对患者实施，所以模拟临床工作的驱血过程，并以大鼠为研究对象进行临床前研究，为后期的临床实验奠定夯实的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#