2.2  小鼠一般状况  空白对照组的小鼠活动状态良好，毛色白而具有光泽，粪便呈灰黑色，颗粒小、较硬，含水量低；模型组小鼠活跃程度明显减少，倦怠嗜睡，经常聚集在笼子的角落，并出现拱背、竖毛现象，毛色逐渐失去光泽且枯黄色(见图1)，粪便颗粒大而软含水量极高，有的粪便不成形，饮食量、饮水量、小肠推进率、胃排空率和体质量均较空白对照组小鼠明显降低(P < 0.05)。见表1-3。

2.2  小鼠一般状况  空白对照组的小鼠活动状态良好，毛色白而具有光泽，粪便呈灰黑色，颗粒小、较硬，含水量低；模型组小鼠活跃程度明显减少，倦怠嗜睡，经常聚集在笼子的角落，并出现拱背、竖毛现象，毛色逐渐失去光泽且枯黄色(见图1)，粪便颗粒大而软含水量极高，有的粪便不成形，饮食量、饮水量、小肠推进率、胃排空率和体质量均较空白对照组小鼠明显降低(P < 0.05)。见表1-3。

2.2  小鼠一般状况  空白对照组的小鼠活动状态良好，毛色白而具有光泽，粪便呈灰黑色，颗粒小、较硬，含水量低；模型组小鼠活跃程度明显减少，倦怠嗜睡，经常聚集在笼子的角落，并出现拱背、竖毛现象，毛色逐渐失去光泽且枯黄色(见图1)，粪便颗粒大而软含水量极高，有的粪便不成形，饮食量、饮水量、小肠推进率、胃排空率和体质量均较空白对照组小鼠明显降低(P < 0.05)。见表1-3。

2.2  小鼠一般状况  空白对照组的小鼠活动状态良好，毛色白而具有光泽，粪便呈灰黑色，颗粒小、较硬，含水量低；模型组小鼠活跃程度明显减少，倦怠嗜睡，经常聚集在笼子的角落，并出现拱背、竖毛现象，毛色逐渐失去光泽且枯黄色(见图1)，粪便颗粒大而软含水量极高，有的粪便不成形，饮食量、饮水量、小肠推进率、胃排空率和体质量均较空白对照组小鼠明显降低(P < 0.05)。见表1-3。

2.3  形态学结果  见图2。经过光镜观察苏木精-伊红染色切片发现空白对照组十二指肠、小肠组织单层柱状上皮完整、浆液性腺体无明显病理变化，模型组十二指肠、小肠出现轻度损伤表层少量细胞脱落，绒毛不完整。空白对照组的胃组织黏膜层、肌层、浆膜层较为完整，模型组胃黏膜层中淋巴细胞轻微增多，可能存在轻微炎症现象。

功能性消化不良是消化系统中普遍存在的一种慢性胃肠疾病，由于生活节奏的加快导致此病的发病率逐年升高，但是对于其具体的发病机制还尚未清楚，因而成为研究的热点，故为临床研究提供可靠的动物模型至关重要。目前功能性消化不良大鼠动物模型的制备方法均为单因素刺激，可分为经典的碘乙酰胺法(刺激因素为夹尾激怒)与左旋精氨酸法(左旋精氨酸作为造模刺激药物)^[1-7]；但是联合多因素制备功能性消化不良小鼠动物模型研究还未深入。联合多因素制备功能性消化不良动物模型尝试在短时间内利用成年小鼠制备功能性消化不良模型，除了可以降低单一药物的自愈性，进一步模拟患者疾病特征的真实情况，也是制备成年小鼠功能性消化不良模型的一次探索，为后续临床治疗和用药研究提供一种动物模型基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年1至7月在承德医学院基础医学研究所完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SPF级10周龄，成年昆明种雌性小鼠60只，体质量30-40 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2015-0003。

1.3.2  实验药品、试剂及仪器  活性碳粉(批号：180404，天津欧博凯化工有限公司)；多聚甲醛(批号：20180820，天津市福晨化学试剂厂)；碘乙酰胺(批号：O0920A,美仑生物技术有限公司)；L-精氨酸(批号：F0110A，美仑生物技术有限公司)；大黄饮片(购自北京同仁堂药店)；Shandon Excelsior全自动全封闭组织脱水机(美国Thermo公司)；RM2125 RT石蜡切片机(德国Leica公司)；TK-218型恒温摊片烤片机(孝感市泰维电子设备有限公司)；BH-2型OLYMPUS显微镜及摄像装置(日本Olympus公司)。

1.4  实验方法  

1.4.1  动物分组  60只昆明小鼠编号、称质量，采用随机数字表法分为2组：空白对照组和模型组，每组30只。

1.4.2  模型制备  每日早上称质量后，空白对照组小鼠每只灌胃2%蔗糖溶液0.2 mL，食水充足持续8 d。模型组小鼠每日上午每只给予0.1%碘乙酰胺蔗糖混合溶液0.2 mL，下午在110 cm×60 cm×40 cm长方形水槽中注入10 cm高的自来水加温到(22±1)℃，将造模小鼠按分组放入水箱中持续游泳20 min，1 h后给予左旋精氨酸溶液按5.7 g/kg灌胃，持续5 d，从第6天开始将左旋精氨酸溶液换成冷大黄水煎液，按小鼠体质量2.9 g/kg持续灌胃3 d，其余照常不变。模型组采取间日给食(24 h禁食，24 h给食)，循环往复共计8 d。

1.5  主要观察指标

1.5.1  小鼠一般状态  观察并记录造模前后小鼠的皮毛光泽、活动状况，粪便颗粒大小，软硬程度及体质量的变化。1.5.2  饮水量的变化  采用差值法测定小鼠的饮水量。每天早8点每笼的水瓶放入纯水150 mL，到第2天早8点测量水瓶的存水量，差值与小鼠只数的比值就是一只小鼠的每天饮水量。

1.5.3  饮食量的变化  每天早8点给予天平称量的定量食物，到第2天早8点称量剩余的食物量，差值与小鼠只数的比值就是一只小鼠的每天饮食量。

1.5.4  胃排空率  造模灌胃最后一次结束禁食24 h，给予小鼠碳粉半固体糊(按1∶4的比例勾兑碳粉和花生粉)0.5 mL灌胃，1 h后，体积分数4%水合氯醛(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉小鼠，解剖结扎胃贲门及幽门，取完整的胃，用滤纸拭干后称质量此为全胃质量，然后沿胃小弯处剪开胃体，用生理盐水洗去胃内容物并用滤纸沾干后再称质量此为空胃质量，以前后2次称质量的差值用来计算胃排空率。胃排空率=[(全胃质量-空胃质量)/全胃质量]×100%。

1.5.5  小肠推进率  将自幽门至回盲部取出完整的小肠。用钢尺分别测其全长和碳粉半固体糊在小肠中移动的距离。小肠推进率=碳粉推进长度/小肠总长度×100% 。

1.5.6  胃肠组织病理变化检测  分别取十二指肠、小肠、胃组织放入40 g/L多聚甲醛中浸泡固定48 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋、5 μm厚切片，苏木精-伊红染色，中性树胶封固，采用BH-2型OLYMPUS光学显微镜观察胃肠黏膜变化情况。

1.6  统计学分析  采SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05认为差异有显著性意义。

功能性消化不良是一种临床极为常见的发病机制复杂的消化系统疾病，西医多认为是由于胃动力低下、胃底调节障碍、内脏敏感性增高等原因引起^[8-9]。中医则将功能性消化不良出现的病症归属于积滞、痞满泄泻、食少纳呆、嗳气吞酸，究其病理机制属于肝郁脾虚、肝郁气滞等^[10-13]，除此以外心理精神因素的影响也成为了近些年的研究热点。有研究显示雌性动物更易受抑郁、焦虑等精神因素的影响^[14-15]。成年人的组织器官敏感度以及对于外来刺激的应答机制与新生儿有所不同，所以在新生儿期的胃刺激导致的胃运动功能障碍与模拟实际患病时期的身体状况有差异，故制备更符合临床需要的功能性消化不良动物模型并考虑到性别与年龄的影响，课题组此次实验选用的动物都是雌性10周龄的成年小鼠。

为建立一种成年鼠功能性消化不良模型，此次实验在查阅资料后在造模方法上选择采用较为普遍的联合多因素造模方法：碘乙酰胺造模方法联合间日给食的基础上加入左旋精氨酸、大黄水煎液以及强迫游泳。碘乙酰胺是一种烷基化试剂，可导致黏膜受损、细胞缺氧等现象，单独使用碘乙酰胺制备功能性消化不良模型只是通过刺激胃黏膜的途径模拟患者上腹部的灼烧感与嗳气吞酸的症状，并不能通过影响胃肠运动导致腹泻，吕林等^[16]就根据经典碘乙酰胺造模法成功复制功能性消化不良模型^[17]；碘乙酰胺的剂量、小鼠的个体差异以及是否联合用药均会影响造模质量，刘成全等^[3]对单独使用碘乙酰胺的模型组、碘乙酰胺加强迫游泳、碘乙酰胺加小平台3种造模方法做了横向比较，证实了单独使用碘乙酰胺组也不如复合因素造模组效果理想。左旋精氨酸可在一氧化氮合酶的作用下生成一氧化氮，一氧化氮可作用与胃，减少胃窦指数但是无法抑制胃排空，而且在禁食期与给食期左旋精氨酸的效果不一^[18]，因此若单独选用左旋精氨酸作为造模药物稳定性无法保证。大黄中的蒽醌类物质作用于肠平滑肌，通过增加肠蠕动而导致泻下现象^[19]；在胡洁等^[20]学者的研究中使用按1 g/(mL·d)大黄水煎液复制的脾虚证模型，出现了功能性消化不良模型的症状：毛发枯涩、便溏脱肛等；但是刘艳阳^[21]在文章中提出，单独使用苦寒泄下法如：番泻叶灌胃、大黄水煎液灌胃复制功能性消化不良模型复制性差、自愈倾向严重^[21-22]；除此以外大黄具有明显的肝脏及结肠毒性^[23-24]，此次实验考虑到此种因素降低了大黄的使用量，造模后切片观察此种造模方法成功的同时没有造成大肠黑变病的毒性作用，而且小鼠也没有出现便溏脱肛、久泻不止的现象，故在此种剂量下制备的功能性消化不良模型自愈性低、毒性小更加可靠且贴近现实消化不良情况。

综上所述单独使用一种因素造模方法比起联合多因素造模有一定弊端，此次实验使用多因素制备成年小鼠功能性消化不良模型，小鼠出现竖毛、毛色逐渐失去光泽且枯黄、拱背，体质量出现减轻趋势符合功能性消化不良模型疾病特征，模型组小肠推进率低于空白对照组(P < 0.05),模型组小肠胃内容物排空率低于空白对照组(P < 0.05)，模型组日均饮水量和进食量也低于空白对照组(P < 0.05)，符合功能性消化不良模型特征，苏木精-伊红染色切片胃肠组织显示有轻度损伤与轻微低度炎症现象，没有明显坏死、糜烂之类的器质性病变，说明此种制备成年功能性消化不良小鼠的方法可行，这种研究方法更贴近成年多机制致病的特点，可以为后续临床治疗功能性消化不良疾病患者确定治疗方案或是相关药物开发提供一种全新的、更优的功能性消化不良动物疾病模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

间日给食：是指连续两次给食时间间隔24 h，使得实验鼠不能正常饮食，是一种在实验过程中喂养方面影响的处理措施，是消化不良实验动物模型制备的常见饲养方法。

功能性消化不良(Functional dyspepsia，FD)：是指具有上腹部疼痛、胀痛、以及饱腹感、嗳气、食欲不振、恶心、呕吐等多种不适症状，经检查排除引起上述症状的器质性疾病的一组临床综合征。症状可持续或反复发作，频率为过去6个月中，症状发生3个月以上，是临床上最常见的一种功能性胃肠病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

成年人的组织器官敏感度以及对于外来刺激的应答机制与新生儿有所不同，所以在新生儿期的胃刺激导致的胃运动功能障碍与模拟实际患病时期的身体状况有差异，故制备更符合临床需要的功能性消化不良动物模型并考虑到性别与年龄的影响，课题组此次实验选用的动物都是雌性10周龄的成年小鼠。

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