2.1  实验动物数量分析  实验选用新西兰大白兔16只，实验过程中无死亡及脱失，全部进入最终结局分析阶段。

2.2  光镜观察  见图3。

对照组：半月板，光学显微镜下见软骨细胞较小，成行排列于大量平行或交叉排列的纤维束之间，基质较少，呈弱嗜碱性；滑膜，滑膜细胞排列整齐，由单层扁平或双层立方上皮构成；关节软骨，镜下关节软骨结构大体正常，软骨细胞及基质轻度增生，胶原纤维排列整齐。

模型组：半月板，软骨细胞及基质增多，部分软骨细胞体积增大，软骨陷窝清晰可见；滑膜，滑膜组织少量慢性炎细胞浸润，胶原纤维增多，部分增粗伴玻璃样变性，部分滑膜组织呈绒毛-结节状增生；关节软骨，部分软骨面有轻微裂隙，软骨细胞及基质轻度增生，少部分软骨细胞及基质减少，胶原纤维排列紊乱。

2.3   Mankin评分  对照组Mankin评分为0.83±0.32，模型组Mankin评分为6.82±2.30，两组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

膝骨关节炎，祖国医学又将其成为“膝痹病”“历节病”“骨痹”“鹤膝风”等名称，《内经·素问》中记载道：“风寒湿三气杂至，合而为痹也”，阐述了该病形成的关键因素。这种疾病的名称最早是在2010年国家中医药管理局发布的中医临床路径中提出的^[1]，现代医学也称为退行性骨关节炎。其特征是膝关节疼痛、麻木、肿胀、活动受限和关节僵硬，严重时甚至膝关节畸形，是临床十分常见的膝关节病变；其病理特征为关节软骨及半月板变性、滑膜组织破坏及增生，关节变形及关节周围组织功能减退等^[2]。对其病理改变的复制是膝痹动物模型建立的关键点，对膝痹造模方式的标准化操作是研究该病发生、发展的基础，也是开展膝痹防治研究的必要条件，但目前关于膝痹动物造模的方法尚无统一的标准规范^[3]。该项目组前期的实验中采用石膏铁丝固定法建立兔膝骨关节炎模型取得了较好的造模效果^[4]，但长期造模发现铁丝缝隙中的石膏仍然会被兔啃食，石膏定型后与兔腿部皮毛相连，当毛发出现生长、脱毛及磨损后仍会导致石膏的脱落，造成后期补打石膏的工作量显著增加。所以此次实验利用高分子绷带结合塑料杆固定建立兔膝骨关节炎模型，为实现高效、统一的膝骨关节炎基础试验提供模型支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物观察。

1.2  时间及地点  实验于2018年11月至2019年1月在新疆医科大学动物实验中心完成。

1.3  材料 

1.3.1  实验动物  选用健康6月龄清洁级雄性新西兰大白兔16只，由新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2018-0003，体质量2.0-2.5 kg^[5]。实验动物单笼喂养，饲养房温度20-25 ℃，湿度 30%-60%，日夜周期各12 h，自由饮食，使用滚珠饮水器饮水^[6]。利用SAS9.4根据样本量产生1∶1随机数字表将新西兰大白兔均分为模型组和对照组。

1.3.2  仪器  恒温箱(DNP-9272，上海精宏实验设备有限公司)；恒温鼓风干燥箱(DHG 型，上海精宏实验设备有限公司)； Nikon生物显微镜(E200)；盖玻片(江苏世泰试验器材有限公司)；染色缸：内径为15 cm的带盖玻璃缸；高分子绷带(广东省揭西县泰洲医疗科技有限公司，批号201600163)。

1.3.3  实验试剂  体积分数4%中性甲醛固定液，脱钙液(20181216，北京索莱宝生物科技有限公司)；二甲苯(天津市富宇精细化工有限公司)；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；苏木精染液(CTS-1097，福州迈新生物技术开发有限公司)；伊红染液(ZLI-9613，北京中杉金桥生物技术有限公司)；中性树胶(ZLI-9555，北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物模型的制备  模型组采用屈曲位高分子绷带结合塑料杆固定左侧膝关节，建立兔膝骨性关节炎模型^[4]，8周后去除高分子绷带^[7]。具体步骤如下：①剪取长约6 cm (保证足够包绕兔胫骨一圈)、宽约兔踝关节至膝关节长度一半的树脂高分子绷带2块，再剪取12 cm(足够包饶兔股骨一圈)，宽约兔膝关节至腹股沟长度一半的树脂高分子绷带2块；②将所得4块树脂高分子绷带水浴加热至80 ℃，待其变软后，用镊子夹出第1块较大的树脂高分子绷带，用纱布吸去其表面水分后，垂直于长轴方向包绕兔左下肢膝关节，把握松紧适度，范围从膝关节上1 cm至腹股沟处，较短一条高分子绷带垂直于胫骨方向在膝关节下1 cm处包饶胫骨一圈；③待树脂高分子绷带两个侧边粘连牢固后(约15 s即可)，观察30 min内兔左侧下肢足掌有无充血、紫绀及水肿等症状，若有不良情况发生立即解除制动装置消肿后重新固定；④再采用剩余较长一条高分子绷带将塑料杆的一头固定于股骨端高分子绷带的表面，待高分子绷带变硬前将塑料杆与股骨形成的夹角调整至60°左右，此端固定后将兔膝关节弯曲至75°左右，将塑料杆的另一端采用较短的一条固定于胫骨端高分子绷带的表面；⑤与单纯石膏固定法相比较，此次实验改良之处是在高分子绷带干燥变硬，弯曲兔膝关节75°左右在胫骨与股骨之间用塑料杆架构出三角形，并且使用高分子材料在两端固定，见图1A。塑料杆两端的纹路与高分子材料结合，当高分子材料冷却变硬后可以与塑料杆固定，加强了三角形的稳定性，膝关节弯曲角度可控，见图1B。每日检查高分子绷带固定情况，若有塑料杆脱落只需重新固定表面塑料杆即可。造模过程示意图见图2。对照组动物给予常规喂养，不进行任何干预。

注意事项：实验采用的塑料杆均来自一次性1 mL注射器中的推杆，推杆两头均有可以被高分子绷带包饶的平头，可以在塑形后卡在高分子绷带中，起到限制兔膝关节活动的作用，在高分子绷带冷却塑形前将包饶塑料杆两端的地方反复按压，可以加强其包饶固定作用；塑料杆其强度适中较耐啃食，质量轻不易造成兔行动负担。

1.4.2  质量控制  ①所有实验动物膝关节固定装置均由同一名试验人员完成，所有膝关节固定前均使用量角器将角度控制在(75±3)°；②造模期间每天3次(9：00；14：00；18：00)观察试验动物固定装置局部有无啃食或者局部组织缺血坏死，及时修复固定装置及防止意外情况发生。

1.4.3  标本取材及处理  模型组固定8周后，将实验动物的高分子绷带拆除，麻醉后处死所有动物。剔除兔膝关节处毛发并清理周围肌肉和结缔组织，然后用咬骨钳取下膝关节，修剪组织，只保留左膝股骨髁局部，并且将组织放置于预先配置的固定液中，对照组用同样的方法取下左膝股骨髁浸入固定液中24 h，之后置入脱钙液中36-48 h，并在24 h后每隔5 h观察关节软骨的软硬程度，防止过度脱钙。常规石蜡包埋后纵行切片，切片厚度5 μm，将组织切片置于65 ℃恒温箱中烘烤1.5-2 h。

1.4.4  苏木精-伊红染色组织病理学观察  将组织切片置入二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min脱蜡。无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，体积分数95%、90%、80%、70%乙醇、蒸馏水各5 min水化，苏木精复染3 min，盐酸乙醇分化数秒(一两秒)，自来水中终止分化5 min。置蒸馏水、体积分数70%，80%，90%，95%乙醇中各3 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min脱水。用0.5%伊红乙醇液对比染色1 min，将切片放入95%乙醇中洗去过量的红色，然后放入无水乙醇中5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min，最后用中性树胶封固。

1.5  主要观察指标  ①光学显微镜下观察样本的滑膜、软骨及半月板的形态、数目、排列等情况；②参照Mankin评分对关节软骨进行评分，Mankin满分14分^[10]，评分越高说明软骨退变越严重。

1.6  统计学分析  评分结果采用SPSS 20.0统计软件进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

3.1  实验结果分析  目前研究均指向雌激素E2对于关节炎的发生及发展有直接或间接的影响，雌激素E2水平的波动也是骨关节炎进程中的影响因素之一^[11-12]，为减少雌激素E2对造模结果的影响及干扰，故此次研究全部造模动物采用雄性新西兰大白兔。对照组与模型组对比后，模型组病理结果符合膝骨关节炎病理表现^[9]，且2组Mankin评分间对比具有统计学意义，提示造模成功。

3.2  造模方法对比  目前建立膝骨关节炎模型的方法多样，诱发性动物模型是目前最常用的造模方式，其中可分为手术和非手术造模。手术干预的造模方法中常见的是通过采用Hulth法、交叉韧带离断术、单纯半月板切除术等外科手术方式介入以建立动物膝骨关节炎模型^[13-16]，其造成膝关节稳定性下降，从而引起关节炎的发生。但由于其损伤严重，近些年出现了改良的Hulth法^[17]，减少了韧带的切除，并且仍能造成膝关节的不稳定产生。还有通过切除造模动物的卵巢以影响动物雌激素水平来建立骨关节炎模型；这些方法都存在相应的局限性，如资金、伦理及感染风险的影响^[18]，且造模程度难以控制，对于观察骨关节炎早期表现缺少优势。非手术造模方式中有研究通过关节腔内注射木瓜蛋白酶、碘乙酸钠引起软骨基质退行性变以成功建立动物膝骨关节炎模型，其缺点存在药物剂量很难把握，误差较大等；关节制动法是对动物进行关节的机械性制动，其中最为经典的是Videman法^[19]，该方法最接近人类膝骨关节炎的发生、发展模式^[20]。

该造模方法运用中医“膝痹”的概念，经络闭阻，气血不畅，久之则形成“痹证”^[8]。制动关节所形成的膝痹模型符合中医辩证分型中瘀血闭阻证膝痹。此次研究首次采用高分子绷带与塑料杆结合将兔膝关节固定，减少了固定材料的用量，利用了三角形的稳定性，不仅加强了固定性，而且可以减轻造模结构。造模8周，采用在兔膝关节上下高分子绷带环连接塑料杆固定方法制作的膝骨关节炎模型，此方法无手术风险和对关节结构无改变，可模拟膝骨关节炎自然的形成过程^[21]。

根据国内外相关研究表明，膝骨关节炎疾病的发生过程复杂^[22]，血流动力学的改变以及生物力学的变化是引起膝骨关节炎的重要原因^[23]；目前国内外有多种通过关节制动造模的方法^[24-26]；伸直位固定也是此方法常运用的一  种^[27]，其与此次造模方法不同的是其改变了兔膝关节的生理角度，拉伸兔腘绳肌，改变膝关节应力模式^[28]。优点可加速膝骨关节炎的形成，缺陷在于伸直位会由于不符合动物膝关节生理角度，过分拉伸肌肉从而加重兔造模过程中的不适感及造成焦躁不安，这会引起兔对造模装置的啃食加剧；屈曲位则不会改变兔膝关节应力，仅固定兔膝关节，舒适感较前者显著提升。

该项目组前期采用的关节制动法也存在部分不足，石膏固定于棉垫之上，存在滑脱不稳；石膏膝关节全部包饶局部压力随兔子生长逐渐增加，局部缺血坏死的风险也随之增加。

3.3  造模机制分析  根据目前学界的认识，膝骨关节炎的发生与发展已经不仅局限于与关节软骨相关，对滑膜的研究逐步重视，滑膜分布血管丰富，参与膝关节中的代谢，营养，保护，免疫等方面；膝骨关节炎的早期发生首先累及关节滑膜，并且伴随直至晚期^[29]。参照人类膝骨关节炎发展过程，膝关节滑膜、关节软骨、半月板均会有不同程度的病变，所以此次造模以膝关节滑膜、关节软骨、半月板的病理结果为最终评价指标。此次实验是在参考Videman法并在石膏铁丝固定法建立兔膝痹模型基础上进行改进^[4]，增加塑料杆的外固定使兔子的股骨与胫骨间保持(75±3)°的夹角，根据三角形稳定性的原理进一步加固，膝关节制动后的关节缩小了运动空间，一方面，关节失用后关节周围血管的血液循环受损^[30]，因减少了横跨膝关节的肌肉收缩而导致关节软骨的萎缩性变化，进一步影响关节软骨细胞凋亡^[31]；另一方面，关节之间的压力发生变化，失去了正常关节的紧张-松弛过程，软骨组织得不到充足的营养，代谢过程障碍使得关节软骨组织的破坏逐步恶化^[32]。

该造模方式具有以下优点：①此造模装置结构简单，膝关节角度可控；②高分子石膏绷带比传统石膏更具可塑性且透气性好，实验过程中高分子绷带在70-100 ℃水中即刻软化，进行局部固定后塑形快；③固定装置使膝关节完全暴露，局部透气性较好，不良事件较少发生；④造模时间可控，对于造模程度可以掌控。

3.4  问题与展望 

(1)此次实验中采用塑料杆进行加固，但过程中发现兔子对其有所啃食，通过方法总结后，拟于后续试验中将塑料杆以螺纹螺钉替代，以达到更加坚固的目的，也可以防止兔子对其啃食。

(2)此次实验的膝关节固定装置虽然比前期装置的质量有所减轻，但其质量仍然有使兔子拖行造模肢体的情况发生，拖行过程中不可避免会对兔子的髋关节周围组织产生牵拉或压迫，有研究显示长期对臀下静脉、股静脉和大隐静脉的压迫可以造成膝关节软骨的钙化线增宽及松质骨硬化^[33]。

(3)实验中Mankin评分较前人实验中所得评分较低^[4]，考虑和膝关节局部造模期间处于开放状态相关，此次实验中膝关节周围没有使用高分子绷带包饶，局部缺少机械压力，有研究发现膝关节周围异常的机械压力会引起局部缺血缺氧^[34]，低氧诱导因子1α基因呈现异常高表达，进而影响软骨的正常形态，相继出现炎性反应。可能是此次造模Mankin评分较低的原因。后期可以针对局部压力量化进行试验分析。

3.5  小结  综上所述，高分子绷带结合塑料杆建立兔膝痹模型的造模方法是建立膝骨关节炎动物模型研究过程中新的尝试，其方法简单易行，结构稳定性强，局部无创伤，使用材料透气、坚固。最终切片结果符合膝关节骨性关节炎的病理表现，且造模成功率高。该方法值得推广和进一步探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

高分子绷带：是石膏绷带的换代产品，与石膏绷带相比其优势明显，现在逐渐成为各大医院的首选。目前，市场上根据制造材料分为聚酯绷带(聚酯纤维绷带)和玻纤绷带(玻璃纤维绷带)两种。高分子绷带是石膏绷带硬度的5倍以上，有很好的保护性，可以抵抗意外伤害对治疗部位的突发影响，其仅是石膏质量的1/5、厚度的1/3，最大限度减轻人体活动的负担，不会因此带来行动不便。由特殊技术纺织的衬底，具有极佳的透气性，从而克服了其他产品对皮肤造成的瘙痒与刺激。

塑料杆：实验采用的塑料杆均来自一次性1 mL注射器中的推杆，推杆两头均有可以被高分子绷带包饶的平头，可以在塑形后卡在高分子绷带中，起到限制兔膝关节活动的作用，在高分子绷带冷却塑形前将包饶塑料杆两端的地方反复按压，可以加强其包饶固定作用。塑料杆其强度适中较耐啃食，质量轻不易造成兔行动负担。

非手术建立骨关节炎模型方式中有研究通过关节腔内注射木瓜蛋白酶、碘乙酸钠引起软骨基质退行性变以成功建立动物膝骨关节炎模型，其缺点存在药物剂量很难把握，误差较大等；关节制动法是对动物进行关节的机械性制动，其中最为经典的是Videman法，该方法最接近人类膝骨关节炎的发生、发展模式。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程