骨疏康干预Beagle犬正畸牙根吸收过程中的成骨分化及机制

doi:10.12307/2022.530

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2654-2659.doi: 10.12307/2022.530

• 口腔组织构建 oral tissue construction • 上一篇下一篇

骨疏康干预Beagle犬正畸牙根吸收过程中的成骨分化及机制

万哲1，杜军1，何静1，胡杨2

1新疆医科大学附属中医医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；2新疆医科大学第一附属医院口腔医院口腔种植修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2021-06-25 修回日期:2021-08-12 接受日期:2021-10-14 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-24
通讯作者: 胡杨，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院口腔医院口腔种植修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:万哲，男，1975年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，副主任医师，主要从事口腔错牙合畸形的矫正研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2019D01C185)，项目负责人：万哲

Effect of Gushukang on osteogenic differentiation in a Beagle dog model during orthodontic root resorption and its mechanism

Wan Zhe1, Du Jun1, He Jing1, Hu Yang2

1Department of Stomatology, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Implant and Prosthodontics, the First Teaching Hospital/Stomatological Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2021-06-25 Revised:2021-08-12 Accepted:2021-10-14 Online:2022-06-18 Published:2021-12-24
Contact: Hu Yang, Associate chief physician, Department of Implant and Prosthodontics, the First Teaching Hospital/Stomatological Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wan Zhe, Associate chief physician, Department of Stomatology, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region (General Project), No. 2019D01C185 (to WZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
RUNX2基因：为成骨细胞标志物核心结合因子或 Runt 相关转录因子2，作为骨细胞的特异转录因子，在成骨细胞的分化、软骨细胞的成熟、骨基质蛋白的产生等过程中都具有显著作用，对骨形成和重建起着重要作用，是一种公认的关键转录因子。
β-连环蛋白基因：是成骨细胞增殖和分化的关键基因，可以增强成骨细胞活性，调控成骨细胞定向分化，其所在的Wnt/β-连环蛋白信号通路在不同发育阶段发挥不同的作用机制，调控成骨细胞的增殖分化和骨形成。

背景：磨牙压低过程中牙根吸收是常见的并发症，具有不可预知性，目前临床上没有行之有效的治疗方法。骨疏康具有促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞活性的作用，主要用于预防和治疗骨质疏松与骨缺损，但其在牙根吸收方面的研究较少。
目的：探讨骨疏康对Beagle犬正畸牙根吸收过程中成骨分化的调节作用及可能的作用机制。
方法：将16只雄性Beagle犬随机分为正常对照组(n=4)、蒸馏水组(n=6)与骨疏康组(n=6)，正常对照组不进行任何干预，蒸馏水组与骨疏康组建立双侧上颌第一磨牙压低动物模型(正畸矫治手术)，造模后分别灌胃给予蒸馏水与骨疏康[2.1 g/(kg·d)]。造模后6，9，12周取第一磨牙组织，采用qRT-PCR检测RUNX2、牙本质涎磷蛋白、骨形成蛋白2、骨钙蛋白的mRNA表达，Western blot检测RUNX2和β-连环蛋白的蛋白表达。
结果与结论：①大体观察可见，随着时间的推移，第一磨牙出现明显压低现象，在第12周效果最为明显；②qRT-PCR检测显示，相同时间点下，骨疏康组骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白mRNA表达量高于其他两组(P < 0.05)，蒸馏水组骨形成蛋白2、RUNX2 mRNA表达量低于正常对照组(P < 0.05)；骨疏康组3个时间点的骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白mRNA表达量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；③Western blot检测显示，相同时间点下，骨疏康组β-连环蛋白、RUNX2的蛋白表达量高于其他两组(P < 0.05)，蒸馏水组β-连环蛋白、RUNX2的蛋白表达量低于正常对照组(P < 0.05)；骨疏康组造模后9，12周的RUNX2蛋白表达量高于造模后6周(P < 0.05)，造模后12周的β-连环蛋白表达量高于造模后9周(P < 0.05)；④结果表明，骨疏康可能是通过激活骨形成蛋白2与RUNX2/β-连环蛋白通路促进Beagle犬正畸磨牙组织的成骨分化，维持骨基质。

https://orcid.org/0000-0003-0153-2810 (万哲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 根吸收, 骨疏康, 成骨分化, 动物模型, 磨牙压低, 种植钉, 犬, 正畸矫治

Abstract: BACKGROUND: Root resorption is a common complication in molar intrusion, which is unpredictable. There is currently no effective treatment in clinical practice. Gushukang can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts and inhibit the activity of osteoclasts. It is mainly used for the prevention and treatment of osteoporosis and bone defects, but there are few studies on root resorption.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Gushukang on osteogenic differentiation in a Beagle dog model of orthodontic root resorption and its possible mechanism.
METHODS: Sixteen male Beagle dogs were randomly divided into a normal control group (n=4), a distilled water group (n=6) and a Gushukang group (n=6). The normal control group did not undergo any intervention. A bilateral maxillary first molar intrusion animal model (orthodontic surgery) was established in the distilled water group and Gushukang group. After the model was made, distilled water and Gushukang [2.1 g/(kg·d)] were given by gavage in the distilled water and Gushukang groups, respectively. At the 6th, 9th, and 12th weeks after modeling, the first molar tissue was taken. Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expression of runt-related transcription factor 2, dentin sialophosphoprotein, bone morphogenetic protein 2, and osteocalcin. Western blot was used to detect the protein expression of runt-related transcription factor 2 and beta-catenin.
RESULTS AND CONCLUSION: General observation showed that the first molar appeared to be significantly intruded with time, and the effect was most obvious at the 12th week. Quantitative real-time polymerase chain reaction test showed that, at the same time point, the mRNA expression of bone morphogenetic protein 2, dentin sialophosphoprotein, runt-related transcription factor 2 and osteocalcin in the Gushukang group was higher than that in the other two groups (P < 0.05). The mRNA expression of bone morphogenetic protein 2 and runt-related transcription factor 2 in the distilled water group was lower than that in the normal control group (P < 0.05). And there was no significant difference in the mRNA expression of bone morphogenetic protein 2, dentin sialophosphoprotein, runt-related transcription factor 2 and osteocalcin at three observational time points in the Gushukang group (P > 0.05). Western blot analysis showed that, at the same time point, the protein expression of beta-catenin and runt-related transcription factor 2 in the Gushukang group was higher than that in the other two groups (P < 0.05), and the protein expression of beta-catenin and runt-related transcription factor 2 in the distilled water group was lower than that in the normal control group (P < 0.05). The protein expression of runt-related transcription factor 2 in the Gushukang group at 9 and 12 weeks after modeling was higher than that at 6 weeks after modeling (P < 0.05), and the protein expression of beta-catenin at 12 weeks after modeling was higher than that at 9 weeks after modeling (P < 0.05). To conclude, Gushukang may promote osteogenic differentiation in orthodontic molar tissue and maintain the bone matrix in Beagle dogs by activating bone morphogenetic protein 2 and runt-related transcription factor 2/beta-catenin pathway.

Key words: root resorption, Gushukang, osteogenic differentiation, animal model, molar intrusion, implant nail, dog, orthodontic treatment

中图分类号:

万哲, 杜军, 何静, 胡杨. 骨疏康干预Beagle犬正畸牙根吸收过程中的成骨分化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2654-2659.

Wan Zhe, Du Jun, He Jing, Hu Yang. Effect of Gushukang on osteogenic differentiation in a Beagle dog model during orthodontic root resorption and its mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2654-2659.

图/表（结果） 5

2.1 Beagle犬一般观察情况造模12只犬无死亡，饮水进食正常，口腔环境良好，无明显炎症反应。种植钉没有出现松动现象，橡皮链无脱落。大体观察可见，随时间推移，造模犬第一磨牙有明显压低现象出现，在第12周效果最为明显，见图1。

2.2 qRT-PCR检测结果以干预措施分析，相同时间点下，骨疏康组骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白mRNA表达量高于其他两组、压低旁组织(P < 0.05)，蒸馏水组骨形成蛋白2、RUNX2 mRNA表达量低于正常对照组、压低旁组织(P < 0.05)，其余组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

结果显示，骨疏康可以通过调控骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白的表达来影响牙根吸收。
以不同时间点分析骨疏康干预效果，骨疏康组3个时间点的骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白mRNA表达量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

结果显示，骨疏康可以长期有效的起到治疗作用，其效价和耐受性较好。
2.3 Western blot检测结果以干预措施分析，相同时间点下，骨疏康组β-连环蛋白、RUNX2的蛋白表达量高于其他两组、压低旁组织(P < 0.05)，蒸馏水组β-连环蛋白、RUNX2的蛋白表达量低于正常对照组、压低旁组织(P < 0.05)，见图4A。以不同时间点分析骨疏康的干预效果，骨疏康组造模后9，12周的RUNX2蛋白表达量高于造模后6周(P < 0.05)，造模后12周的β-连环蛋白表达量高于造模后9周(P < 0.05)，见图4B。

结果显示，骨疏康可以通过调控RUNX2和β-连环蛋白的表达来影响牙根吸收。

参考文献

[1] 邹双双,温兴涛,徐卓,等.微种植支抗压低成年人上颌伸长磨牙的CBCT分析[J].口腔医学,2019,39(5):436-438.
[2] 张春利.微型种植钉支抗在口腔正畸中的临床应用效果[J].口腔医学研究,2018,10(3):135-137.
[3] 李翀乾,刘继光.正畸治疗中牙根吸收影响因素的研究进展[J].北京口腔医学,2018,26(3):178-181.
[4] 许辉明,陈雪芬,孙晓峰.微型种植体支抗在正畸治疗中的疗效观察[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2018,28(12):724-732.
[5] 田青鹭,赵志河.微型种植体在口腔正畸中稳定性的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2020,47(2):212-218.
[6] 吴也可,郜然然,左渝陵,等.影响微种植体正畸治疗成功率的因素[J].中国组织工程研究,2020,24(4):538-543.
[7] LOSSDÖRFER S, YILDIZ F, GÖTZ W, et al. Anabolic effect of intermittent PTH (1 -34) on the local microenvironment during the late phase of periodontal repair in a rat model of tooth root resorption. Clin Oral Investig. 2010;14(1):89-98.
[8] HUANG H, WANG J, ZHANG Y, et al. Bone resorption deficiency affects tooth root development in RANKL mutant mice due to attenuated IGF-1 signaling in radicular odontoblasts. Bone. 2018;114:161-171.
[9] TAN L, ZHANG Y, HUANG Y, et al. Preservation of alveolar ridge after tooth extraction with hypoxia-inducible factor-1alpha protein in a dog model. Exp Ther Med. 2019;17(4):2913-2920.
[10] 肖聪,葛伶伶,赵同平,等.微种植体支抗压低上颌磨牙的研究进展[J].现代生物医学进展,2018,18(2):397-400.
[11] 成洁,王颖,吉健华,等.骨疏康胶囊治疗肾阳虚型骨质疏松症疗效及对患者骨代谢影响[J].陕西中医,2019,40(9):1232-1234,1250.
[12] 侍方,李欣,张蕊,等.骨疏康胶囊联合鲑鱼降钙素、戊酸雌二醇对绝经后骨质疏松患者的临床疗效[J]. 中成药,2020,42(12):3188-3192.
[13] 郑志坚,舒冰,赵世天,等.骨疏康颗粒对去卵巢小鼠骨质疏松模型骨丢失和破骨细胞凋亡的影响[J].中华中医药杂志,2020,35(7): 3647-3651.
[14] EL-BIALY T, HAZAN MOLINA H, AIZENBUD Y, et al. Effects of Intraligamentary Injection of Osteogenic-Induced Gingival Fibroblasts on Cementum Thickness in the Dog Model of Tooth Root Resorption. Adv Exp Med Biol. 2021;1289:107-114.
[15] 黄林,方威苏,曹君.IL-1β、MMP-2在大鼠牙根吸收组织中的表达及意义[J].口腔正畸学研究,2019,39(6):604-607.
[16] 梁昌富,陈国新,肖秀凤,等.正畸治疗对下颌髁突肥大术后颞下颌关节的影响[J].口腔医学研究,2018,34(8):870-875.
[17] 林若慧,陈赛楠,叶云金,等.基于TMT蛋白质组学分析骨疏康胶囊治疗骨质疏松模型大鼠的机制[J]. 中国组织工程研究,2021, 25(32):5141-5147.
[18] SCHWARTZ AM. Tissue changes incidental to tooth movement. Int J Orthod. 1992;18(5):331-352.
[19] ABOALNAGA AA, SALAH FAYED MM, EL-ASHMAWI NA, et al. Effect of micro-osteoperforation on the rate of canine retraction: a split-mouth randomized controlled trial. Prog Orthod. 2019;20(1):21.
[20] ALQADASI B, ALDHORAE K, HALBOUB E, et al. The effectiveness of micro-osteoperforations during canine retraction: a three-dimensional randomized clinical trial. J Int Soc Prev Community Dent. 2019;9(6): 637-645.
[21] BABANOURI N, AJAMI S, SALEHI P. Effect of mini-screw-facilitated micro-osteoperforation on the rate of orthodontic tooth movement: a single-center, split-mouth, randomized, controlled trial. Prog Orthod. 2020; 21(1):7.
[22] LI Y, JACOX LA, LITTLE SH, et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications Kaohsiung J Med Sci. 2018;34(4):207-214.
[23] MOON CH, WEE JU, LEE HS. Intrusion of overerupted molars by corticotomy and orthodontic skeletal anchorage. Angle Orthod. 2007; 77(6):1119-1125.
[24] 喻凤,邓锋,张翼,等.骨皮质切开术对比格犬前磨牙压入移动影响的三维形态学研究[J].华西口腔医学杂志,2016,34(3):267-271.
[25] 费晓娟,金美林,卢曾奎,等.骨形态发生蛋白-2(BMP2)基因的生理功能和信号通路研究进展[J].中国畜牧杂志,2021,57(3):1-6.
[26] LIN YC, NICETA M, MUTO V, et al. SCUBE3 loss-of-function causes a recognizable recessive developmental disorder due to defective bone morphogenetic protein signaling. Am J Hum Genet. 2021;108(1): 115-133.
[27] KIM MJ, CHA JK, PAENG KW, et al. Immediate versus delayed application of bone morphogenetic protein-2 solution in damaged extraction sockets: a preclinical in vivo investigation. Clin Oral Investig. 2021;25(1):275-282.
[28] RAKIAN A, YANG WC, GLUHAK-HEINRICH J, et al. Bone morphogenetic protein-2 gene controls tooth root development in coordination with formation of the periodontium. Int J Oral Sci. 2013;5(2):75-84.
[29] NEWTON AH, PASK AJ. Evolution and expansion of the RUNX2 QA repeat corresponds with the emergence of vertebrate complexity. Commun Biol. 2020;3(1):771.
[30] LI S, KONG H, YAO N, et al. The role of runt-related transcription factor 2 (Runx2) in the late stage of odontoblast differentiation and dentin formation. Biochem Biophys Res Commun. 2011;410(3):698-704.
[31] MURODUMI H, SHIGEISHI H, KATO H, et al. Melatonin‑induced miR‑181c‑5p enhances osteogenic differentiation and mineralization of human jawbone‑derived osteoblastic cells. Mol Med Rep. 2020; 22(4):3549-3558.
[32] LIU J, WU M, FENG G, et al. Downregulation of LINC00707 promotes osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by regulating DKK1 via targeting miR-103a-3p. Int J Mol Med. 2020;46(3):1029-1038.
[33] SASE T, SUZUKI T, MIURA K, et al. Runt-related transcription factor 2 in human colon carcinoma: a potent prognostic factor associated with estrogen receptor. Int J Cancer. 2012;131(10):2284-2293.
[34] ZHANG G, LI H, ZHAO W, et al. miR-205 regulates bone turnover in elderly female patients with type 2 diabetes mellitus through targeted inhibition of Runx2. Exp Ther Med. 2020;20(2):1557-1565.
[35] 张麟,向楠,周广文,等.补肾化痰方对去势骨质疏松大鼠BMP2/Smad/RUNX2信号通路及钙沉积的影响[J].中医药导报,2018, 24(18):20-24.
[36] 秦凡,周述作,罗金英,等.β-catenin对人牙周膜干细胞应力成骨调控作用的研究[J].局解手术学杂志,2017,26(3):162-166.
[37] 任小华,韩红娟,吴浩.下颌单颗后牙即刻种植负载后种植体周围龈沟液TNF-α、IL-1β、TGFα及骨钙蛋白的变化及意义[J].四川医学, 2018,39(8):904-908.
[38] 陈聚秀,黄正蔚.Ⅱ型牙本质发育不全患者DSPP基因突变的研究进展[J].口腔生物医学,2021,12(1):66-70.
[39] CHEN XJ, SHEN YS, HE MC, et al. Polydatin promotes the osteogenic differentia- tion of human bone mesenchymal stem cells by activating the BMP2-Wnt/beta -catenin signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2019;112:108746.
[40] SHEN YS, CHEN XJ, WURI SN, et al. Polydatin improves osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells by stimulating TAZ expression via BMP2-Wnt/β-catenin signaling pathway. Stem Cell Res Ther. 2020;27;11(1):204.
[41] KUSHWAHA P, KHEDGIKAR V, GAUTAM J, et al. A novel therapeutic approach with Caviunin-based isoflavonoid that en routes bone marrow cells to bone formation via BMP2/Wnt-β-catenin signaling. Cell Death Dis. 2014;5(9):e1422.

引言

临床上磨牙的长期缺失会导致对牙合牙伸长，对牙合牙的伸长不但破坏了与邻牙的正常邻接关系，容易引起牙体牙周疾病，而且使缺牙部位垂直高度降低，造成义齿修复困难。解决牙齿伸长使之压低的传统方法有截冠修复、外科矫正和正畸压入等，但都会导致健康牙齿的损伤，存在手术创伤面大、预后不理想、效果欠佳等问题[1-6]。近几年随着种植技术的发展，种植钉被用于压低磨牙并取得了良好的效果，但是该技术也有一定的不良反应，在上颌磨牙被压低的过程中，医生和患者最担心的问题无疑是被压低磨牙的健康状况，包括牙髓状态(是否会影响牙髓活力)、牙根是否发生了内吸收或外吸收等[7]。牙根的吸收是不可预知的，目前临床上没有行之有效的治疗方法，如果存在某种措施或者某种药物可以减少正畸治疗过程中的牙根吸收，那将会是正畸领域的一大进步，将会减少正畸矫治的不良反应。最近研究证实，破骨细胞分化因子、骨保护因子、核心结合因子α1、胰岛素样生长因子系统、骨形成蛋白2等可以作为细胞因子起到抑制牙根吸收、促进牙根修复的作用[7-8]，但由于缺点其在骨再生中的应用受到限制，包括溶骨、异位骨化、易降解、安全性和效率[9]。低强度脉冲超声、重组人类可溶性受体、釉基质蛋白等外源性因素均可辅助加速牙根修复，减少牙根吸收，然而这些方法应用因价格昂贵、临床使用有一定的局限性而不能推广应用[10]。常规药物帕米膦酸盐、多西环素等西药也因为不良反应大、耐药性等问题在临床上使用受限。故研发生产低不良反应、低价格、高疗效的中成药是目前亟待解决的问题。
中医理论认为“肾为先天之本”“肾藏精生髓主骨”“其充在骨”，骨生长发育强劲衰弱与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨髓生化有源，骨骼得以滋养而强健有力，肾精亏虚则骨髓生化无源，骨骼失养而屡弱无力。根据中医“肾主骨”的理论指导下的补肾法，在成骨治疗中占有重要地位。骨疏康由淫羊藿、骨碎补、黄芪、熟地黄、丹参等多种中药组成，具有补肾健脾、益精强骨的作用，临床上被大量用于预防和治疗骨质疏松和骨缺损方面。成洁等[11]和侍方等[12]的研究发现，骨疏康可以调节骨质疏松症患者的骨代谢紊乱，促进骨形成，提高机体骨密度，改善临床症状。郑志坚等[13]通过动物实验发现，骨疏康能够促进体内和体外破骨细胞凋亡，降低破骨细胞的骨吸收，延缓骨丢失和治疗骨质疏松症。以上报道表明，骨疏康具有促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞活性的作用，但其在牙根吸收方面的研究较少。
实验以Beagle犬为研究对象建立犬上颌第一磨牙压低动物模型，采用骨舒康干预治疗模型犬，分别于第6，9，12周检测分析骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2、β-连环蛋白的表达差异性，探讨骨舒康在牙根吸收发生发展过程中的疗效及作用机制，为正畸临床中牙根吸收的预防和治疗提供理论参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，计量资料进行单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年4-9月在新疆医科大学动物实验中心进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性Beagle犬16只，体质量(12±1) kg，恒牙列完整、形态正常，牙齿及牙周健康，无明显的错颌畸形，口腔环境及牙列形态基本相一致，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证编号：1107292011000023。实验方案经新疆医科大学动物实验管理中心伦理委员会批准(伦理审批号：IACUC202101113-01)。
1.3.2 主要药物及试剂骨疏康(胶囊，溶于水后用于灌胃，辽宁康辰药业有限公司)；TIANScript RT Kit、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio，中国)；兔多抗RUNX2(abcam，美国)；兔多抗β-连环蛋白(Proteintech，中国)；HRP标记羊抗兔二抗(Bioswamp，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物分组适应性喂养1个月后，将Beagle犬随机分为正常对照组(n=4)、蒸馏水组(n=6)与骨疏康组(n=6)。正常对照组不做任何处理，正常饲养；蒸馏水组建立双侧上颌第一磨牙压低动物模型(正畸矫治手术)，造模后灌胃给予蒸馏水100 mL/d；骨疏康干预组建立双侧上颌第一磨牙压低动物模型，造模后灌胃给予骨疏康2.1 g/(kg·d)，造模后每天早晨10点灌胃。造模后6，9，12周，蒸馏水组与骨疏康组分别选取2只犬，进行相关指标的检测。正常对照组直接取材。

1.4.2 犬上颌第一磨牙压低模型的建立
种植钉的植入：将比格犬称质量后，按照0.1 mL/kg肌注现配好的1∶1舒泰50与速眠新，5 min左右比格犬陷入深度睡眠，药效持续0.5-1 h。植入部位局部消毒后，在双侧上颌第一磨牙与第二磨牙颊侧和腭侧牙槽间隔附着龈与黏膜交界处，先用手术刀做切口，剥离牙龈黏骨膜，使用专用工具将微型种植体缓慢旋入适宜深度。若骨皮质坚硬，则先用先锋钻穿破骨皮质，再旋入微型种植体，在手术全过程中严格无菌操作。
矫治器的安置与施力：以橡皮链施力，使橡皮链跨越牙齿的牙合面，两端固定于颊腭侧的种植钉上，使用测力计测量加力力值100 g。术后加强对比格犬的护理，增加保温措施，进食高蛋白软食补充营养，自由饮水，术后连续3 d肌注青霉素钾8×104 U/kg，1次/d，口服甲硝唑片，2片/次，2次/d，预防感染发生。时刻关注比格犬身体情况及精神状态，检查微种植体是否脱落，链状橡皮筋是否在位及时做出调整，每4周更换一次链状橡皮筋,并使用正畸专用测力计施加力值。
1.4.3 一般情况观察造模后6，9，12周，观察Beagle犬压低磨牙的压低程度，并以照片形式观察压低效果。在规定时间内收集整个第一磨牙组织，并立即放入液氮中保存。设置骨疏康组第二磨牙为压低旁组织。
1.4.4 qRT-PCR检测造模后6，9，12周，采用qRT-PCR检测磨牙组织中骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白的mRNA相对表达量。
通过DNAMAN软件设计骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白荧光实时定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。引物序列见表1。

反转录cDNA步骤：5×Hiscript Buffer 4 µL，dNTP(2.5 mmol/L) 4 µL，Oligo(dT)18(10 μmol/L) 2 µL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 µL，Hiscript Reverse Transcriptase 1 µL，RNA 5 µg，ddH2O加到20 µL，混匀后，25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。qPCR反应：正反引物各0.4 µL，SYBR Select Master Mix 10 µL，ddH2O 4.8 µL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 µL，cDNA 4 µL，配制成20 µL体系混合均匀，95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15s ，40个循环，获得qPCR反应结果，采用2-ΔΔCt方法用于结果量化计算。
1.4.5 Western blot检测造模后6，9，12周，采用Western-Blot检测β-连环蛋白、RUNX2的蛋白表达。将磨牙组织裂解、离心、BCA定量后，配置5%浓缩胶和12%分离胶，进行样本变性加样、电泳和转膜，将膜装入5%TBST封闭液，制置室温摇床2 h，分别加5 mL兔多抗RUNX2、兔多抗β-连环蛋白稀释液(1∶1 000)，4 ℃过夜。加入1 mL HRP标记羊抗兔二抗(1∶10 000稀释)，置于摇床上2 h。显色，在暗室中压片曝光显影。结果用BandScan分析胶片灰度值，分别计算检测蛋白条带与参比蛋白条带强度比值(%)。
1.5 主要观察指标各组磨牙组织RUNX2、牙本质涎磷蛋白、骨形成蛋白2、骨钙蛋白的mRNA表达，以及RUNX2和β-连环蛋白的蛋白表达。
1.6 统计学分析所有数据利用SPSS 15.0软件进行数据处理，对计量资料进行单因素方差分析，采用LDS法进行两两比较，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

牙根吸收是一类正畸治疗过程中受到机械压力、化学反应等过程影响产生的无菌性炎症反应，会导致牙周组织的功能异常，引起牙齿冠根的比例失调、松动脱落[3]。已有研究表明，正畸力作用后牙根吸收的发病率在25%-100%[14]，目前诊断主要依靠影像学检测，只有牙根组织中矿化损失率为60%左右才可以被检测到，易出现治疗不及时的问题[15]，因此发现正畸治疗后防治牙根吸收的治疗药物显得尤为重要。骨疏康是一类中药药物，具有成骨的作用，目前大量研究表明，骨疏康可以有效治疗骨质疏松和骨代谢异常等[16-17]，但在根吸收方面的研究欠缺。
实验使用100 g的恒定力值来观察Beagle犬磨牙压低效果，以及对压低过程中牙根吸收的情况。恒定力值的选择根据SCHWARTZ[18]研究结论，最适宜的矫治力不宜超过毛细血管的压力，即20-26 g/cm2，此种温和而持久的矫治力使牙齿能产生所希望的移动，而又不会引起牙根及牙周组织的损伤。相关研究表明，应用微型种植体作支抗，施加100-150 g力压可导致压低1-8 mm不等[19-21]，因此实验根据已有报道选择100 g恒定力值作为Beagle犬压低实验的力值。磨牙压低的时间长短与牙根吸收程度呈正相关关系[22]。MOON等[23]用微种植体压低磨牙，仅 2 个月即获得了 3-3.5 mm的上颌磨牙压低。喻凤等[24]在Beagle犬压低磨牙的三维形态学研究中发现，第12周牙根吸收量最大。因此，实验选择6，9，12周作为研究时间，来观察Beagle犬磨牙压低效果及对压低过程中牙根吸收的情况。实验结果表明在6-12周过程中，Beagle犬磨牙随时间推移明显发生了压低效果，12周的效果最佳。
实验确定了骨疏康在成骨分化中的作用，其最终导致成骨细胞的成熟和有机骨基质的矿化。骨形成蛋白2在牙齿形成过程中起到积极作用，是骨形态发生的早期信号分子，可诱导刺激成骨和骨形成[25-29]。RUNX2在早期作为成骨的主调控因子表达，是骨形成的关键基因，其表达活性可以对其他成骨基因发挥调控作用[30-35]。β-连环蛋白基因是成骨细胞增殖和分化的关键基因，可以增强成骨细胞活性、调控成骨细胞分化[36]。骨钙蛋白是成骨分化晚期的特异性表达的分子[37]。牙本质涎磷蛋白参与了牙本质矿化过程，起到至关重要的作用，是成牙本质细胞分化成熟的标志。研究表明，牙本质涎磷蛋白的缺失与牙本质和骨的矿化缺陷有密切关系[38]。正如实验结果所描述，骨疏康干预治疗显著提高了Beagle犬磨牙分化过程不同阶段表达的标志物骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、骨钙蛋白、RUNX2、β-连环蛋白的表达量，确定了其在成骨分化中的作用，并最终导致成骨细胞的成熟和有机骨基质的矿化，而蒸馏水组的各指标表达量相对降低。
虽然骨疏康显著增强了成骨细胞的成熟和有机骨基质的矿化，但其潜在机制尚不清楚。骨形成蛋白和Wnt/β-连环蛋白通路是成骨分化和协同控制骨形成所必需的[38]，Wnt/β-连环蛋白通路作为骨形成蛋白的下游调节因子，调节增殖、骨分化和矿化的进程[39]。实验发现骨疏康激活了成骨关键基因RUNX2和β-连环蛋白的活性，诱导了成骨细胞标志物骨钙蛋白、牙本质涎磷蛋白等的表达。RUNX2是骨形成蛋白和Wnt/β-连环蛋白信号通路激活成骨分化的主要调控因子，可以诱导β-连环蛋白的核转位，并刺激骨形成蛋白2诱导的成骨分化，同时可以促进骨形成蛋白2与Wnt/β-连环蛋白的结合，共同起到调控成骨的机制作用[40]。因此，骨疏康可能通过促进骨形成蛋白2和β-连环蛋白的表达激活RUNX2，刺激骨形成，而RUNX2也可以促进β-连环蛋白的表达；同时，骨形成蛋白2的活化也可以诱导Wnt/β-连环蛋白信号激活刺激成骨[41]。实验还发现，骨疏康在不同时间段对成骨标志物的转录水平表达无明显差异性，但是在RUNX2和β-连环蛋白的蛋白表达水平上显示12周的表达量最高。这也进一步表明了上述观点，因此推测骨疏康可以持续稳定地激活RUNX2和β-连环蛋白的表达水平，诱导标志物表达来刺激成骨细胞活性。
综上所述，骨疏康可能是通过激活调节骨形成蛋白2与RUNX2/β-连环蛋白通路促进Beagle犬正畸磨牙组织的成骨分化，维持骨基质。目前的研究描述了一种有前途的治疗药物，用于正畸治疗后牙根吸收的预防，并为其治疗的可能机制提供了一定理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨疏康干预Beagle犬正畸牙根吸收过程中的成骨分化及机制

Effect of Gushukang on osteogenic differentiation in a Beagle dog model during orthodontic root resorption and its mechanism

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[3]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1187-1193.
[4]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[5]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[6]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.
[7]	冯建波, 李陈诚, 刘金月, 王小敏, 彭笳宸. 金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入建立创伤性大鼠骨髓炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 700-705.
[8]	王世辉, 程杨, 朱赟洁, 程少丹, 毛剑莹. 弧刃针刀治疗冻结肩模型兔炎症因子及组织形态的反应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 706-711.
[9]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.
[10]	王佳佳, 刘杰, 王敏. 构建具核梭杆菌诱导的实验性根尖周炎小鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 176-181.
[11]	李舒伦, 郝鹏, 郝飞, 段红梅, 赵文, 高钰丹, 杨朝阳, 李晓光. 改良光化学栓塞法诱导缺血性脑卒中模型大鼠的病理变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 218-224.
[12]	杨沁, 王敏. 构建牙周炎伴咬合创伤小鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2667-2672.
[13]	程艺, 刘婷, 郭玉静, 孙小桐, 毕蓝, 张荣和. 雌激素在正畸过程中对牙移动骨改建及牙根吸收的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2782-2788.
[14]	张红梅, 孙溪饶, 王程越. 聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2498-2503.
[15]	车振家, 朱正清, 朱礼伟, 李友斌, 祝晨一, 黄岚峰. 钛植入物表面生物化学改性对骨整合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2576-2583.