异甘草素抑制SETD7表达可保护缺氧/复氧诱导心肌细胞的氧化损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2353

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (35): 5613-5618.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2353

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异甘草素抑制SETD7表达可保护缺氧/复氧诱导心肌细胞的氧化损伤

于辉1，赵阳1，费家玥1，张文礼1，赵洛沙2

¹郑州大学第五附属医院心肺康复科，河南省郑州市 450052；²郑州大学第一附属医院心血管内科，河南省郑州市 450052

收稿日期:2019-11-11 修回日期:2019-11-16 接受日期:2020-01-18 出版日期:2020-12-18 发布日期:2020-10-16
作者简介:于辉，女，1980年生，河南省漯河市人，汉族，2006年郑州大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事心血管疾病方面的研究。
基金资助:
2018年河南省医学科技攻关计划项目(2018020250)

Isoliquiritigenin inhibits SETD7 expression against oxidative damage in cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation

Yu Hui1, Zhao Yang1, Fei Jiayue1, Zhang Wenli1, Zhao Luosha2

¹Department of Cardiopulmonary Rehabilitation, Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China; ²Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Received:2019-11-11 Revised:2019-11-16 Accepted:2020-01-18 Online:2020-12-18 Published:2020-10-16
About author:Yu Hui, Master, Associate chief physician, Department of Cardiopulmonary Rehabilitation, Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
2018 Henan Provincial Medical Science and Technology Research Project, No. 2018020250

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

氧化损伤：活性氧和活性氮是引起蛋白质氧化损伤的重要因素。活性氧和活性氮可以通过多种代谢途径产生，如化学毒物与药物代谢、细胞呼吸、辐射、光照等。

异甘草素：是从甘草中进一步提取的单体化合物，已有研究提示异甘草素可通过抑制AMPK信号通路而发挥抗氧化作用，从而改善缺氧心肌细胞收缩功能障碍。但是异甘草素对缺血/再灌注损伤心肌细胞的作用机制尚未深入研究。

背景：缺血性心脏病已成为威胁人体健康的重要疾病之一，但其发生发展的分子机制尚未阐明。

目的：探讨异甘草素对心肌细胞缺氧/复氧损伤后氧化应激及细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。

方法：体外培养大鼠心肌细胞H9C2，随机分为空白对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+异甘草素10，20，40，80 μmol/L组，缺氧/复氧+si-con组(si-con为阴性对照)、缺氧/复氧+si-SETD7组、缺氧/复氧+异甘草素+pcDNA组、缺氧/复氧+异甘草素+pcDNA-SETD7组。采用MTT法检测细胞存活率；采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；测定细胞中活性氧、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛水平；蛋白免疫印迹法检测细胞中凋亡相关蛋白活化半胱氨酸蛋白酶3表达。

结果与结论：①与空白对照组比较，缺氧/复氧组细胞存活率显著降低(P < 0.05)，细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达水平与活性氧、丙二醛水平显著升高(P < 0.05)，而谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低(P < 0.05)；②与缺氧/复氧组比较，缺氧/复氧+异甘草素10，20，40，80 μmol/L组细胞存活率显著升高(P < 0.05)，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)，SETD7、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达水平与活性氧、丙二醛水平显著降低(P < 0.05)，而谷胱甘肽过氧化物酶水平显著升高(P < 0.05)；③与缺氧/复氧+si-con组相比，缺氧/复氧+si-SETD7组心肌细胞存活率显著升高(P < 0.05)，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)，SETD7与活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白的表达水平显著降低(P < 0.05)，活性氧、丙二醛水平显著降低(P < 0.05)，谷胱甘肽过氧化物酶水平显著升高(P < 0.05)；④与缺氧/复氧+异甘草素+pcDNA组相比，缺氧/复氧+异甘草素+ pcDNA-SETD7组心肌细胞存活率显著降低(P < 0.05)，细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，SETD7、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)，活性氧、丙二醛水平显著升高(P < 0.05)，谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低(P < 0.05)；⑤提示异甘草素可通过抑制SETD7表达而抵抗细胞凋亡及增强其抗氧化能力，从而对缺氧/复氧损伤心肌细胞发挥保护作用。

ORCID: 0000-0002-7612-454X(于辉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 异甘草素, SETD7, 缺氧/复氧, 心肌细胞, 氧化应激

Abstract:

BACKGROUND: Ischemic heart disease has become one of the important diseases that threaten human health, but the molecular mechanism of its occurrence and development has not yet been elucidated.

OBJECTIVE: To investigate the effects of isoliquiritigenin (ISL) on oxidative stress and apoptosis in cardiomyocytes after hypoxia/reoxygenation (H/R) injury and its possible mechanism.

METHODS: Rat cardiomyocytes H9C2 were cultured in vitro and randomly divided into normal control group, H/R group, H/R+ISL 10, 20, 40, 80 μmol/L groups, H/R+si-con group, H/R+si-SETD7 group, H/R+ISL+pcDNA group, H/R+ISL+pcDNA-SETD7 group. Cell viability was measured using methylthiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Apoptosis was detected by flow cytometry. The levels of reactive oxygen species (ROS), glutathione peroxidase (GSH-Px), and malondialdehyde (MDA) in the cells were measured. The expression of apoptosis-related protein Cleaved Caspase-3 was detected by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group, the cell survival rate of H/R group was significantly decreased (P < 0.05), the apoptosis rate was significantly increased (P < 0.05), Cleaved caspase-3 expression and ROS and MDA levels were significantly increased (P < 0.05), while the GSH-Px content was significantly reduced (P < 0.05). Compared with the H/R group, the cell survival rate of H/R+ISL 10, 20, 40, 80 μmol/L groups was significantly increased (P < 0.05), and the apoptosis rate was significantly decreased (P < 0.05), and the expression of SETD7 and Cleaved caspase-3 was significantly decreased (P < 0.05), and the levels of ROS and MDA were significantly decreased (P < 0.05), while the content of GSH-Px was significantly increased (P < 0.05). Compared with the H/R+si-con group, the cell survival rate of H/R+si-SETD7 group was significantly increased (P < 0.05), the apoptosis rate was significantly decreased (P < 0.05), the expression of SETD7 and Cleaved caspase-3 was significantly decreased (P < 0.05), and the levels of ROS and MDA were significantly decreased (P < 0.05), while the content of GSH-Px was significantly increased (P < 0.05). Compared with the H/R+ISL+pcDNA group, the cell survival rate of H/R+ISL+pcDNA-SETD7 group was significantly decreased (P < 0.05), the apoptosis rate was significantly increased (P < 0.05), the expression of SETD7 and Cleaved caspase-3 was significantly increased (P < 0.05), and the levels of ROS and MDA were significantly increased (P < 0.05), while the content of GSH-Px was significantly decreased (P < 0.05). These findings indicate that ISL can inhibit the expression of SETD7 to reduce the apoptosis of cardiomyocytes induced by H/R and enhance the cell antioxidant capacity, thereby protecting cardiomyocytes against H/R injury.

Key words: ">isoliquiritigenin, SETD7, hypoxia/reoxygenation, cardiomyocytes, oxidative stress

中图分类号:

于辉, 赵阳, 费家玥, 张文礼, 赵洛沙. 异甘草素抑制SETD7表达可保护缺氧/复氧诱导心肌细胞的氧化损伤[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(35): 5613-5618.

Yu Hui, Zhao Yang, Fei Jiayue, Zhang Wenli, Zhao Luosha. Isoliquiritigenin inhibits SETD7 expression against oxidative damage in cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(35): 5613-5618.

图/表（结果） 5

2.1 不同浓度异甘草素对缺氧/复氧处理后心肌细胞凋亡率的影响与空白对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞存活率显著降低(P < 0.05)，细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白的表达水平显著升高(P < 0.05)。与缺氧/复氧组相比，缺氧/复氧+异甘草素10，20，40，80 μmol/L组心肌细胞存活率显著升高(P < 0.05)，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)，活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白的表达水平显著降低(P < 0.05)，其中异甘草素浓度为 80 μmol/L时作用效果较为显著，因而选用80 μmol/L异甘草素进行后续实验，见图1。

2.2 不同浓度的异甘草素对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激的影响与空白对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低(P < 0.05)，活性氧、丙二醛水平显著升高(P < 0.05)；与缺氧/复氧组相比，缺氧/复氧+异甘草素10，20，40，80 μmol/L组心肌细胞谷胱甘肽过氧化物酶水平显著升高(P < 0.05)，活性氧、丙二醛水平显著降低(P < 0.05)，见图2。

2.3 不同浓度异甘草素对缺氧/复氧处理对心肌细胞SETD7表达的影响与空白对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞中SETD7的表达水平显著升高(P < 0.05)；与缺氧/复氧组相比，缺氧/复氧+异甘草素10，20，40，80 μmol/L组心肌细胞SETD7的表达水平均显著降低(P < 0.05)，见图3。

2.4 沉默SETD7表达对缺氧/复氧处理心肌细胞的影响与转染si-con组相比，si-SETD7组心肌细胞SETD7表达显著降低(P < 0.05)。相较于缺氧/复氧+si-con组，缺氧/复氧+ si-SETD7组心肌细胞存活率显著升高(P < 0.05)，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)，SETD7与活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白的表达水平显著降低(P < 0.05)，活性氧、丙二醛水平显著降低(P < 0.05)，谷胱甘肽过氧化物酶水平显著升高(P < 0.05)，见图4。

2.5 上调SETD7部分逆转异甘草素对缺氧/复氧处理心肌细胞的保护作用与转染pcDNA组相比，pcDNA-SETD7组心肌细胞SETD7表达显著增加(P < 0.05)。与缺氧/复氧+ 异甘草素+pcDNA组相比，缺氧/复氧+异甘草素+pcDNA- SETD7组心肌细胞存活率显著降低(P < 0.05)，细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，SETD7、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)，活性氧、丙二醛水平显著升高(P < 0.05)，谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低(P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学水平，对比观察实验。

1.2 时间及地点于2018年2月至2019年4月在郑州大学第五附属医院医院心肺康复科完成。

1.3 材料大鼠心肌细胞H9C2，购自上海研盟生物工程有限公司；DMEM培养基，购自北京拜尔迪生物技术有限公司；胎牛血清，购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；胰蛋白酶，购自北京索莱宝科技有限公司；MTT，购自北京百奥创新科技有限公司；Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡试剂盒，购自上海贝博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000，购自美国Thermo Fisher公司；异甘草素，购自百灵威科技有限公司；SETD7小干扰RNA(si-SETD7)(UGC CCG UUA GGA UCG UAG)、无意义阴性对照(si-con)(CGA GCG ACC UUG UUG UUU)，购自上海吉玛基因；pcDNA3.1与SETD7过表达序列(ACG UGA CUU UGU UCU GGG AU)，购自湖南丰晖生物科技有限公司；SETD7、活化半胱氨酸蛋白酶3单克隆抗体，均购自美国Santa Cruz公司；活性氧检测试剂盒与谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司；丙二醛检测试剂盒，购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 缺氧/复氧模型建立以含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养心肌细胞H9C2，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱内培养，每隔2 d更换1次培养基，待细胞生长融合度达到80%左右时进行传代培养。取对数生长期H9C2细胞，接种于24孔板，将24孔板置于缺氧/复氧培养箱内缺氧24 h。缺氧条件：充入体积分数95%N₂与5%CO₂混合气体，弃旧培养基，加入DMEM新鲜培养基，将24孔板复氧6 h；复氧条件：37 ℃、体积分数5%CO₂体积分数培养箱^[8]。缺氧/复氧作用的心肌细胞作为缺氧/复氧组，未经任何处理的心肌细胞作为空白对照组。

1.4.2 实验处理与分组取对数生长期心肌细胞，分别培养于含有异甘草素的培养液中，异甘草素终浓度分别为10，20，40，80 μmol/L^[9]。各组细胞培养24 h后进行缺氧/复氧处理，分别命名为缺氧/复氧+异甘草素10 μmol/L组、缺氧/复氧+异甘草素20 μmol/L组、缺氧/复氧+异甘草素40 μmol/L组、缺氧/复氧+异甘草素80 μmol/L组。

细胞转染及分组：取对数生长期心肌细胞，随机分为缺氧/复氧+si-con组(si-con转染至心肌细胞24 h后进行缺氧/复氧处理)、缺氧/复氧+si-SETD7组(si-SETD7转染至心肌细胞24 h后进行缺氧/复氧处理)、缺氧/复氧+异甘草素+ pcDNA组(pcDNA转染至心肌细胞24 h后置于含有异甘草素的培养基继续培养24 h，随后进行缺氧/复氧处理)、缺氧/复氧+异甘草素+pcDNA-SETD7组(pcDNA-SETD7转染至心肌细胞24 h后置于含有异甘草素的培养基继续培养24 h，随后进行缺氧/复氧处理)，各组转染方法参照Lipofectamine 2000说明书进行操作。

1.4.3 检测心肌细胞中活性氧、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶的水平收集各组心肌细胞，按照活性氧检测试剂盒说明书检测各组荧光强度，活性氧水平以荧光强度表示。收集各组细胞及培养液上清，采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛水平；采用改良二硫双硝基苯甲酸定量法检测谷胱甘肽过氧化物酶水平。

1.4.4 MTT检测细胞增殖取生长状态良好的心肌细胞接种于96孔板，按照“1.4.2”的分组方法分别处理细胞，培养结束后，每孔分别加入20 μL MTT溶液，充分混匀，室温条件下培养4 h，弃上清，每孔分别加入二甲基亚砜 150 μL，吹打混匀，摇床内孵育10 min，应用酶标仪检测细胞在490 nm处的吸光度(A)值，以空白对照组细胞存活率作为100%，比较分析各组细胞存活率变化。

1.4.5 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组心肌细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为6×10⁸ L^-1，4 ℃条件下，1 000 r/min转速离心10 min，取细胞沉淀加入100 μL结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI，室温避光孵育15 min，再次加入400 μL结合缓冲液，应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.6 蛋白免疫印迹(Western blot)检测SETD7、活化半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达取各组心肌细胞，弃旧培养基，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃条件下， 12 000 r/min转速离心10 min(离心半径6 cm)，吸取上清液置于另一离心管内，采用BCA测定蛋白浓度。取适量蛋白加入2×上样缓冲液，充分混合，置于100 ℃恒温水浴锅内煮沸5 min，蛋白变性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔加入50 μL蛋白样品，电泳条件：80 V 30 min，120 V 90 min。4 ℃条件下(90 V电压)转膜2 h，用5%脱脂奶粉封闭1 h。孵育一抗稀释液(1∶500)，4 ℃孵育24 h，孵育二抗稀释液(1∶1 000)，室温孵育1 h，滴加增强型化学发光试剂，暗室曝光显影，自动凝胶成像系统分析各蛋白条带灰度值。

1.5 主要观察指标 ①异甘草素对缺氧/复氧处理后心肌细胞凋亡率的影响；②不同浓度的异甘草素对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激的影响；③不同浓度异甘草素对缺氧/复氧处理对心肌细胞SETD7表达的影响；④抑制SETD7表达对缺氧/复氧处理心肌细胞凋亡及氧化应激的影响；⑤上调SETD7部分逆转异甘草素对缺氧/复氧处理心肌细胞的保护作用。

1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，实验数据以x(_)±s表示，2组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

缺血性心脏病患病率和发病率逐年上升，由于缺血/再灌注损伤导致治疗效果不佳，患者预后差。目前关于缺血/再灌注损伤的病理机制尚未完全阐明，既往研究显示抑制心肌细胞氧化应激损伤及心肌细胞凋亡可有效保护心肌细胞免受缺血/再灌注损伤^[10-11]。此次研究初步探讨了异甘草素通过SETD7途径抵抗心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用机制。

甘草素是从甘草中提取的有效成分，研究表明甘草素具有抗炎、抗肿瘤及抗氧化等多种功能^[12]，甘草素还可通过抗氧化、抗凋亡等作用对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用^[13]。异甘草素是从甘草中进一步提取的单体化合物，已有研究提示异甘草素可通过抑制AMPK信号通路而发挥抗氧化作用，从而改善缺氧心肌细胞收缩功能障碍^[14]。但是异甘草素对缺血/再灌注损伤心肌细胞的作用机制尚未深入研究。此次研究构建了缺氧/复氧模型，结果表明心肌细胞存活率显著降低，细胞凋亡率明显升高，说明缺氧/

复氧可通过加重心肌细胞氧化损伤及促进细胞凋亡，提示缺氧/复氧模型构建成功。此次研究结果显示不同浓度的异甘草素处理后可提高心肌细胞存活率，降低细胞凋亡率，且随着异甘草素药物浓度的增加而进一步的改善，提示异甘草素可通过促进心肌细胞存活及抑制细胞凋亡，从而对心肌细胞缺氧/复氧损伤发挥保护作用。细胞凋亡过程受到多种基因调控，既往研究表明半胱氨酸蛋白酶3参与了心肌细胞凋亡过程，半胱氨酸蛋白酶3活化成为活化半胱氨酸蛋白酶3时可发挥促进细胞凋亡的作用^[15-18]。此次研究结果显示，异甘草素作用后心肌细胞缺氧/复氧模型中活化半胱氨酸蛋白酶3的表达水平降低，提示异甘草素可能通过抑制活化半胱氨酸蛋白酶3表达影响缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡。先前研究表明，氧化应激是缺血/再灌注损伤的重要原因之一，细胞发生氧化应激时可提高活性氧水平，活性氧水平升高可加重心肌细胞凋亡，丙二醛是一种脂质过氧化产物，细胞发生氧化应激时促使丙二醛水平升高从而进一步加重氧化应激损伤，谷胱甘肽过氧化物酶属于抗氧化酶类且具有清除氧自由基能力^[19-29]。此次研究结果显示，缺氧/复氧处理后心肌细胞中活性氧、丙二醛水平显著升高，谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低，异甘草素可以提高谷胱甘肽过氧化物酶水平，降低缺氧/复氧处理后心肌细胞中活性氧、丙二醛水平，提示异甘草素可通过减少氧化应激损伤对缺氧/复氧诱导的心肌细胞发挥保护作用。

研究表明SETD7过表达可激活活性氧信号转导途径从而加重氧化应激损伤^[30-31]。此次研究结果显示，缺氧/复氧诱导的心肌细胞中SETD7表达水平升高，异甘草素可降低SETD7表达，随着异甘草素浓度的增加而SETD7表达降低，提示异甘草素抑制SETD7表达可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡，促进细胞存活，增强细胞抗的氧化应激能力。为探究异甘草素是否通过抑制SETD7表达而发挥作用，此次研究在缺氧/复氧诱导的心肌细胞中上调SETD7的表达，结果发现上调SETD7表达可逆转异甘草素对缺氧/复氧损伤的心肌细胞的保护作用。提示异甘草素可通过下调SETD7的表达抑制凋亡途径的激活及减轻氧化应激损伤从而对心肌细胞发挥保护作用。

综上所述，异甘草素可通过下调SETD7的表达抑制氧化应激损伤及细胞凋亡，对缺氧/复氧损伤心肌细胞发挥保护作用，其中间作用机制可能与增强细胞抗氧化能力、抑制活化半胱氨酸蛋白酶3表达有关。此次研究仅初步明确异甘草素具有抑制心肌细胞氧化损伤及细胞凋亡的作用，仍存在不足之处，关于其对SETD7上游基因的靶向调控机制尚需进一步研究，同时体外心肌细胞的实验与体内临床试验相比有很大的差距，还需进行临床试验研究验证异甘草素的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

异甘草素抑制SETD7表达可保护缺氧/复氧诱导心肌细胞的氧化损伤

Isoliquiritigenin inhibits SETD7 expression against oxidative damage in cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation

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