自噬对晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤的早期保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2921

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (35): 5619-5624.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2921

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

自噬对晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤的早期保护

韩焱福1，陶然2，孙天骏3

¹首都医科大学附属北京世纪坛医院整形美容外科，北京市 100038；²解放军总医院第一医学中心整形修复科，北京市 100853；³解放军总医院第四医学中心烧伤整形科，北京市 100048

收稿日期:2020-02-24 修回日期:2020-02-29 接受日期:2020-03-30 出版日期:2020-12-18 发布日期:2020-10-16
作者简介:韩焱福，男，1968年生，安徽省太湖县人，汉族，2008年解放军第二军医大学整形外科学研究生毕业，博士，博士后，副主任医师，主要从事干细胞、皮肤组织工程与创面修复研究。
基金资助:
2020年度军队医学科技青年培养计划孵化项目(20QNPY097)

Autophagy has an early protective effect against fibroblast injury induced by advanced glycation end products

Han Yanfu1, Tao Ran2, Sun Tianjun3

1Department of Plastic Surgery, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; 2Department of Plastic Surgery, First Medical Center, General Hospital of Chinese PLA，Beijing 100853, China; 3Department of Burn and Plastic Surgery, Fourth Medical Center, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100048, China

Received:2020-02-24 Revised:2020-02-29 Accepted:2020-03-30 Online:2020-12-18 Published:2020-10-16
About author:Han Yanfu, MD, Associate chief physician, Department of Plastic Surgery, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
Supported by:
2020 Military Medical Science and Technology Project for Youth Training and Cultivation, No. 20QNPY097

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞自噬：自噬是普遍存在于真核细胞中的一种高度保护的、维持细胞内环境自身稳定的细胞内降解机制。胞浆中的细胞器和蛋白质等首先被双层膜包裹，形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬可降解清除细胞内受损线粒体等细胞器及毒性蛋白质聚集体。细胞自噬可影响糖尿病等慢性创面成纤维细胞的活力，被认为是疾病修复的关键调节因素。

晚期糖基化终末产物：是在持续高糖条件下，蛋白质、脂质甚至核酸的氨基与糖的醛基在非酶催化反应下生成的最终末产物。在糖尿病患者体内，病理性高血糖可加速糖基化反应，形成大量的晚期糖基化终末产物。局部晚期糖基化终末产物蓄积作为糖尿病代谢重构的直接产物，是皮肤组织细胞、细胞外基质和细胞因子改变的重要环境介质，使得糖尿病患者的皮肤易损伤并形成溃疡创面。

背景：晚期糖基化终末产物与糖尿病创面难愈合密不可分，晚期糖基化终末产物可影响成纤维细胞增殖及迁移，但自噬在晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤中的早期保护作用尚未见相关研究。

目的：研究晚期糖基化终末产物对成纤维细胞活力及自噬的影响，探讨自噬在成纤维细胞损伤中的早期保护作用。

方法：以体外传代培养的人成纤维细胞为研究对象，设立正常对照组(DMEM培养液)、晚期糖基化终末产物组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物)、晚期糖基化终末产物抑制剂N-苯乙酰噻唑组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物+100 mg/L N-苯乙酰噻唑)、自噬抑制剂氯喹组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物+10 μmol/L氯喹)。培养48 h后，锥虫蓝染色检测各组细胞活力，Western blot法检测LC3及P62蛋白的表达，细胞免疫荧光实验检测自噬体形成，透射电镜观察自噬泡超微结构。

结果与结论：①细胞死亡率：与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物组细胞死亡率显著增加(P < 0.01)；与晚期糖基化终末产物组比较，N-苯乙酰噻唑组细胞死亡率显著降低(P < 0.05)，而氯喹组细胞死亡率显著增加(P < 0.05)；②LC3及P62蛋白的表达：与正常对照组相比，晚期糖基化终末产物组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加，P62表达显著降低(P < 0.01)；与晚期糖基化终末产物组相比，N-苯乙酰噻唑组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显下降，P62表达明显上升(P < 0.05)，而氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白含量变化不明显(P > 0.05)，P62表达明显上升(P < 0.05)；③自噬体形成：晚期糖基化终末产物组和氯喹组均可见细胞中LC3绿色荧光点状聚集物增加；晚期糖基化终末产物组可见数目较多的自噬小体和自噬泡结构，而氯喹组细胞中自噬体结构数量和空泡状结构少于晚期糖基化终末产物组；④结果证实，晚期糖基化终末产物可损伤成纤维细胞，降低细胞生存率，早期可激活细胞自噬；诱导的自噬对成纤维细胞损伤起到一定的保护作用。

ORCID: 0000-0003-3966-8684(韩焱福)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 细胞, 成纤维细胞, 晚期糖基化终末产物, 自噬, N-苯乙酰噻唑, 氯喹, 细胞活力, 免疫, 创面, 实验

Abstract:

BACKGROUND: Advanced glycation end products (AGEs) are closely related to diabetic wound healing. AGEs can affect the proliferation and migration of fibroblasts, but the early protective effect of autophagy in AGE-induced fibroblast injury has not been explored.

OBJECTIVE: To confirm the effect of AGEs on fibroblast cell viability and autophagy, and to explore the early protective effect of autophagy on cell injury.

METHODS: Human fibroblasts were cultured in vitro. Normal control group (DMEM medium), AGE group (DMEM medium+100 mg/L AGEs), AGE+PTB (AGE inhibitor) group (DMEM medium+100 mg/L AGEs+100 mg/L PTB), and AGE+chloroquine (autophagy inhibitor) group (DMEM medium+100 mg/L AGEs+10 μmol/L chloroquine) were established. After 48 hours of culture, trypan blue staining was used to detect the cell viability of each group, western blot was used to detect the expression of LC3 and P62 protein, cell immunofluorescence assay was used to detect the formation of autophagy using, and transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructure of autophagy vesicles.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, cell death rate in the AGE group increased significantly (P < 0.01). Compared with the AGE group, the cell death rate in the AGE+PTB group decreased significantly (P < 0.05), while that in the AGE+chloroquine group increased significantly (P < 0.05). Compared with the control group, the ratio of LC3 II/LC3 I in the AGE group increased significantly, and the expression of P 62 decreased significantly (P < 0.01); compared with the AGE group, the ratio of LC3 II/LC3 I in the AGE+PTB group decreased significantly, the expression of P62 increased significantly (P < 0.05), whereas the content of LC3 II/LC3 I in the AGE+chloroquine group did not change significantly (P > 0.05) and the expression of P62 increased significantly (P < 0.05). Both in the AGE group and AGE+chloroquine group, the green fluorescent dot-like aggregation of LC3 was increased. By comparing these two groups, there were more autophagy bodies and autophagy vesicles in the AGE group, whereas the number of autophagy structures and vacuole like structures were less in the AGE+chloroquine group. These findings indicate that AGEs could damage fibroblasts in vitro, reduce cell survival rate, and activate autophagy activity in an early stage, and moreover induced autophagy could certainly protect fibroblasts.

Key words: cell, fibroblast, advanced glycation end products, autophagy, PTB, chloroquine, cell viability, immune, wound, experiment

中图分类号:

韩焱福, 陶然, 孙天骏. 自噬对晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤的早期保护[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(35): 5619-5624.

Han Yanfu, Tao Ran, Sun Tianjun. Autophagy has an early protective effect against fibroblast injury induced by advanced glycation end products[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(35): 5619-5624.

图/表（结果） 10

2.1 晚期糖基化终末产物对体外成纤维细胞活力的影响与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物组坏死细胞数目增多，N-苯乙酰噻唑组坏死细胞数目减少，100 mg/L晚期糖基化终末产物对成纤维细胞活力有明显抑制效果，细胞死亡率显著增加(P < 0.01)。与晚期糖基化终末产物组比较，N-苯乙酰噻唑明显减轻晚期糖基化终末产物对成纤维细胞活力的抑制，细胞死亡率显著降低(P < 0.05)，见图1和图2。

2.2 晚期糖基化终末产物对成纤维细胞自噬的影响与正常对照组相比，晚期糖基化终末产物组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增高，P62表达显著降低(P < 0.01)，表明晚期糖基化终末产物处理后可使成纤维细胞自噬水平增高；与晚期糖基化终末产物组相比，N-苯乙酰噻唑组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显下降，P62表达则有明显上升(P < 0.05)，表明N-苯乙酰噻唑处理后可使成纤维细胞自噬水平降低，见图3和图4。

2.3 氯喹处理对晚期糖基化终末产物环境下成纤维细胞活力的影响与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物对成纤维细胞的活力有抑制效果，细胞死亡率显著增加(P < 0.01)，与晚期糖基化终末产物组比较，氯喹组成纤维细胞活力进一步受到显著抑制，细胞死亡率显著增加(P < 0.05)，由此推测氯喹通过阻断自噬进程，增强了晚期糖基化终末产物对成纤维细胞活力的抑制作用，见图5和图6。

2.4 氯喹处理对晚期糖基化终末产物培养环境下成纤维细胞自噬的影响与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值显著增高，P62表达显著降低(P < 0.01)，表明成纤维细胞自噬水平增高；与晚期糖基化终末产物组比较，氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值变化不明显(P > 0.05)，P62表达进一步上升(P < 0.05)，表明氯喹处理后可抑制成纤维细胞自噬进程，见图7和图8。

免疫荧光实验结果显示，与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物组细胞中LC3绿色荧光点状聚集物增加，表明晚期糖基化终末产物处理可以诱导形成大量LC3Ⅱ标记的自噬体；晚期糖基化终末产物联合氯喹共同处理后，由于氯喹抑制自噬的机制是通过抑制自噬体与溶酶体的融合过程，因此氯喹可以抑制自噬完成，但会造成LC3Ⅱ积累，导致细胞中点状聚集物增加，见图9。透射电镜观察结果显示，正常对照组可见完整的细胞核及核膜，线粒体丰富，形态清晰；晚期糖基化终末产物组可见数目较多的自噬小体及内含物被降解后遗留的空泡和髓样小体结构，自噬程度明显增加；氯喹组细胞中亦可观察到自噬体结构，因氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合过程，细胞中自噬体结构和空泡状结构比晚期糖基化终末产物组少，见图10。

参考文献

[1] AJITH TA, VINODKUMAR P. Advanced Glycation End Products: Association with the Pathogenesis of Diseases and the Current Therapeutic Advances. Curr Clin Pharmacol. 2016;11(2):118-127.

[2] 陆树良,青春,谢挺,等.糖尿病皮肤“隐性损害”的机制研究[J].中华创伤杂志,2004,20(8):468-473.

[3] VERMA N, MANNA SK. Advanced Glycation End Products (AGE) Potently Induce Autophagy through Activation of RAF Protein Kinase and Nuclear Factor κB (NF-κB). J Biol Chem. 2016;291(3): 1481-1491.

[4] YU Y, WANG L, DELGUSTE F, et al. Advanced glycation end products receptor RAGE controls myocardial dysfunction and oxidative stress in high-fat fed mice by sustaining mitochondrial dynamics and autophagy-lysosome pathway. Free Radic Biol Med. 2017;112:397-410.

[5] VERMA N, MANNA SK. Advanced glycation end products (AGE) potentiates cell death in p53 negative cells via upregulaion of NF-kappa B and impairment of autophagy. J Cell Physiol. 2017; 232(12):3598-3610.

[6] PARZYCH KR, KLIONSKY DJ. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxid Redox Signal. 2014;20(3):460-473.

[7] LU K, PSAKHYE I, JENTSCH S. Autophagic clearance of polyQ proteins mediated by ubiquitin-Atg8 adaptors of the conserved CUET protein family. Cell. 2014;158(3):549-563.

[8] LIM J, LACHENMAYER ML, WU S, et al. Proteotoxic stress induces phosphorylation of p62/SQSTM1 by ULK1 to regulate selective autophagic clearance of protein aggregates. PLoS Genet. 2015;11(2):e1004987.

[9] 杨桂然,王福科,李彦林.成纤维细胞的生物学特性及分化潜能[J].中国组织工程研究,2020,24(13):2114-2119.

[10] NAZARUK J, BORZYM-KLUCZYK M. The role of triterpenes in the management of diabetes mellitus and its complications. Phytochem Rev. 2015;14(4):675-690.

[11] SHAIKH-KADER A, HOURELD NN, RAJENDRAN NK, et al. The link between advanced glycation end products and apoptosis in delayed wound healing. Cell Biochem Funct. 2019;37(6):432-442.

[12] 赵峻,马翅,杨娜娜,等.晚期糖基化终末产物致软骨细胞炎性反应的潜在机制[J].中国组织工程研究,2018,22(24): 3786-3791.

[13] DAI J, CHEN H, CHAI Y. Advanced Glycation End Products (AGEs) Induce Apoptosis of Fibroblasts by Activation of NLRP3 Inflammasome via Reactive Oxygen Species (ROS) Signaling Pathway. Med Sci Monit. 2019;25:7499-7508.

[14] MARTINS IJ. Human Survival and Immune Mediated Mitophagy in Neuroplasticity Disorders. Neural Regen Res. 2019;14(4):735.

[15] REGGIORI F, KLIONSKY DJ. Autophagosomes: biogenesis from scratch? Curr Opin Cell Biol. 2005;17(4):415-422.

[16] XIE Z, KLIONSKY DJ. Autophagosome formation: core machinery and adaptations. Nat Cell Biol. 2007;9(10):1102-1109.

[17] TAKAHASHI A, TAKABATAKE Y, KIMURA T, et al. Autophagy Inhibits the Accumulation of Advanced Glycation End Products by Promoting Lysosomal Biogenesis and Function in the Kidney Proximal Tubules. Diabetes. 2017;66(5):1359-1372.

[18] LI M, LIU DW. Advances in the research of effects of regulation of cell autophagy on wound healing. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2017;33(10):625-628.

[19] ZENG T, WANG X, WANG W, et al. Endothelial cell-derived small extracellular vesicles suppress cutaneous wound healing through regulating fibroblasts autophagy. Clin Sci (Lond). 2019;133(9): CS20190008.

[20] RABIEE MOTMAEN S, TAVAKOL S, JOGHATAEI MT, et al. Acidic pH derived from cancer cells as a double-edged knife modulates wound healing through DNA repair genes and autophagy. Int Wound J. 2020;17(1):137-148.

[21] CHEN W, WU Y, LI L, et al. Adenosine accelerates the healing of diabetic ischemic ulcers by improving autophagy of endothelial progenitor cells grown on a biomaterial. Sci Rep. 2015;5:11594.

[22] ZHENG A, MA H, LIU X, et al. Effects of Moist Exposed Burn Therapy and Ointment (MEBT/MEBO) on the autophagy mTOR signalling pathway in diabetic ulcer wounds. Pharm Biol. 2020; 58(1):124-130.

[23] 王朝俊,陈铖,张莹,等.晚期糖基化终末产物(AGEs)对人软骨细胞自噬活性的影响研究[J].航空航天医学杂志,2018,29(1):51-53.

[24] KOCATURK NM, AKKOC Y, KIG C, et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. Eur J Pharm Sci. 2019; 134:116-137.

[25] COOPER ME, THALLAS V, FORBES J, et al. The cross-link breaker, N-phenacylthiazolium bromide prevents vascular advanced glycation end-product accumulation. Diabetologia. 2000;43(5):660-664.

[26] YAMAGISHI S. Potential clinical utility of advanced glycation end product cross-link breakers in age- and diabetes-associated disorders. Rejuvenation Res. 2012;15(6):564-572.

[27] BRADKE BS, VASHISHTH D. N-phenacylthiazolium bromide reduces bone fragility induced by nonenzymatic glycation. PLoS One. 2014;9(7):e103199.

[28] MATHEW R, KARP CM, BEAUDOIN B, et al. Autophagy suppresses tumorigenesis through elimination of p62. Cell. 2009;137(6):1062-1075.

[29] CHEN S, ZHOU L, ZHANG Y, et al. Targeting SQSTM1/p62 induces cargo loading failure and converts autophagy to apoptosis via NBK/Bik. Mol Cell Biol. 2014;34(18):3435-3449.

[30] VEGLIANTE R, DESIDERI E, DI LEO L, et al. Dehydroepiandrosterone triggers autophagic cell death in human hepatoma cell line HepG2 via JNK-mediated p62/SQSTM1 expression. Carcinogenesis. 2016;37(3):233-244.

[31] XU F, LI J, NI W, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist 15d-prostaglandin J2 mediates neuronal autophagy after cerebral ischemia-reperfusion injury. PLoS One. 2013;8(1):e55080.

[32] WU D, WANG H, TENG T, et al. Hydrogen sulfide and autophagy: A double edged sword. Pharmacol Res. 2018;131:120-127.

[33] LI ZY, WU YF, XU XC, et al. Autophagy as a double-edged sword in pulmonary epithelial injury: a review and perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2017;313(2):L207-L217.

[34] HAN Y, SUN T, TAO R, et al. Clinical application prospect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on clearance of advanced glycation end products through autophagy on diabetic wound. Eur J Med Res. 2017;22(1):11.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 2018年4月至2019年6月在北京世纪坛医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验用主要细胞、试剂人皮肤成纤维细胞(齐氏生物科技有限公司)；DMEM培养基(赛默飞公司)；胰岛素、维甲酸和CaCl₂(Sigma公司)；抗LC3抗体、GAPDH抗体(CST公司)；抗P62抗体(武汉优尔生商贸有限公司)；链脲佐菌素(阿拉丁公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；1%双抗(赛默飞公司)；ECL发光液(Millipore公司，WBKLS0100)；晚期糖基化终末产物(Abcam公司，AB51995)；晚期糖基化终末产物抑制剂N-苯乙酰噻唑(Santa Cruz公司，sc-500909)；自噬抑制剂氯喹(Sigma公司)。

1.3.2 实验用主要仪器 VD-1320超净工作台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；MCO-15AC二氧化碳培养箱(Sanyo公司)；CK倒置显微镜(Qlympu公司)；蛋白质电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(Alpha Innotech公司)；荧光显微镜(Qlympus公司)；透射电子显微镜(FEI公司，Quanta200)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及干预采用含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗(青链霉素混合液)的DMEM培养液，将原代成纤维细胞株进行扩增培养，选取第3代细胞按1×10⁵/孔将细胞悬液接种到6孔板中，分为4组：正常对照组(DMEM培养液，n=6)，晚期糖基化终末产物组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物，n=6)，N-苯乙酰噻唑组(DMEM培养液+ 100 mg/L晚期糖基化终末产物+100 mg/L N-苯乙酰噻唑，n=6)，氯喹组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物+10 μmol/L氯喹，n=6)，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养48 h后收集细胞行相关检测。

1.4.2 锥虫蓝染色检测细胞活力各组细胞培养48 h后，使用胰酶消化，制备单细胞悬液，并作适当稀释，细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混合均匀(终浓度为0.04%)，在 3 min内分别计数活细胞和死细胞。倒置显微镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状，随机选取视野进行拍照处理。死细胞率(%)=死细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.4.3 Western blot法检测各组细胞LC3及P62蛋白的表达培养48 h后收集成纤维细胞，离心弃上清，加入RAPI裂解液提取总蛋白，将样品上样至10%聚丙烯酰胺凝胶中，SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜上。按照实验步骤，加入LC3抗体(1∶1 000)、P62抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶2 000)及HRP标记羊抗兔二抗。取出膜，在膜上滴加ECL发光液并放入成像系统进行拍照。ImageJ软件定量分析LC3及P62与GAPDH的吸光度值，取LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及P62/GAPDH吸光度比值进行统计分析。

1.4.4 细胞免疫荧光实验检测自噬体正常对照组、晚期糖基化终末产物组和氯喹组细胞培养48 h后，使用体积分数为75%乙醇浸泡过夜，PBS洗2次×5 min，40 g/L多聚甲醛常温固定20 min；加入0.5% Triton静置15 min，PBS洗3次×5 min，摇床轻轻摇晃；加入LC3抗体常温孵育2 h，回收一抗，PBS洗3次；避光加入FITC荧光二抗，避光常温孵育1 h，回收二抗，PBS洗3次；Hoechst 33258避光染色15 min，PBST洗2次×5 min，摇床轻轻摇晃；将盖玻片倒扣在滴有20%甘油的载玻片上，于激光共聚焦显微镜观察细胞自噬变化，并随机选取视野进行拍照处理。

1.4.5 透射电子显微镜观察细胞自噬体超微结构培养48 h后收集正常对照组、晚期糖基化终末产物组和氯喹组细胞，2.5%戊二醛固定2 h，PBS漂洗3次，每次10 min，1%锇酸固定30 min，双蒸水漂洗5 min，依次浸入体积分数为50%，70%，80%，90%乙醇各脱水10 min，换成90%丙酮10 min，纯丙酮3次，每次10 min，用Epon812包埋剂包埋标本，先切1.0-2.0 μm半薄切片，定位后制成60-80 nm超薄切片，醋酸铀饱和水溶液染色后再用柠檬酸铅染色，透射电镜下观察，随机选取视野进行拍照处理。

1.5 主要观察指标 ①各组死细胞数量及细胞死亡率；②LC3及p62蛋白的表达；③自噬体形成及自噬泡超微结构变化。

1.6 统计学分析所有数据均使用SPSS 13.0软件进行统计。两样本之间的比较采用t 检验，多样本之间的比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)或双因素方差分析(Two-way ANOVA)中的LSD法(最小显著性法)检验。计量资料数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

晚期糖基化终末产物可诱导皮肤组织内成纤维细胞、内皮细胞及神经细胞凋亡，与糖尿病皮肤创面难以愈合密切相关^[10-11]。晚期糖基化终末产物是在持续高糖条件下，蛋白质、脂质甚至核酸的氨基与糖的醛基在非酶催化反应下生成的最终末产物。在糖尿病患者体内，病理性高血糖可加速糖基化反应，形成大量的晚期糖基化终末产物，并在组织中蓄积。晚期糖基化终末产物具有不可逆性，这使其在高血糖被纠正后也不能恢复到正常水平。局部晚期糖基化终末产物蓄积作为糖尿病代谢重构的直接产物，是皮肤组织细胞、细胞外基质和细胞因子改变的重要环境介质，使得糖尿病患者的皮肤易损伤；有研究表明，晚期糖基化终末产物致软骨细胞损伤，其损伤机制可能与核因子κB信号通路有关^[12]；在体外晚期糖基化终末产物通过诱导活性氧的产生和激活NLRP3炎症小体，引起成纤维细胞凋亡^[13]。

自噬是普遍存在于真核细胞中的一种高度保护的、维持细胞内环境自身稳定的重要细胞内降解机制^[14]。胞浆中的细胞器和蛋白质等首先被双层膜包裹，形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将其中消化产物释放入胞浆用于代谢反应^[15-16]。自噬可降解清除细胞内受损线粒体等细胞器及毒性蛋白质聚集体^[7]，如果自噬活性降低，可能出现细胞内损伤细胞器(特别是线粒体)与分子积累，导致细胞衰老或死亡。自噬被认为是疾病修复的关键调节因素。最近糖尿病肾病动物实验证实，自噬可通过促进溶酶体的生物合成和功能，有助于晚期糖基化终末产物的降解，有望治疗糖尿病肾病^[17]。自噬和凋亡、坏死一样，在创面加深进程中的作用已受到关注^[18-20]。腺苷可通过改善内皮祖细胞的自噬，从而加速糖尿病缺血溃疡创面愈合^[21]；外用烧伤湿润疗法药膏MEBT/MEBO可通过自噬促进糖尿病溃疡创面愈合^[22]。低质量浓度(100 mg/L)晚期糖基化终末产物在短时间内可能通过调节软骨细胞自噬增强细胞活性，自噬在维持细胞内环境自我稳态及促进细胞生存方面发挥重要作用^[23-24]。目前，自噬在晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤中的保护作用尚不清楚。

皮肤组织成纤维细胞是伤口愈合过程中最主要的修复细胞，以晚期糖基化终末产物培养环境下的皮肤成纤维细胞模拟糖尿病皮肤状态，体外建立糖尿病皮肤细胞模型，以正常培养条件下成纤维细胞作为对照。研究结果显示，成纤维细胞在晚期糖基化终末产物环境下，坏死细胞明显增多，细胞活力下降，培养48 h后可见细胞自噬水平明显提高。加入晚期糖基化终末产物抑制剂N-苯乙酰噻唑，坏死细胞明显减少，细胞活力下降减轻，细胞自噬水平也明显降低。因N-苯乙酰噻唑能切断晚期糖基化终末产物引起的蛋白交联，使交联蛋白恢复到未交联状态，可以阻止或逆转血管中糖基化终末产物积累^[25-27]，从而抑制了晚期糖基化终末产物对成纤维细胞的损伤作用，细胞自噬活性也随之下降。该研究再通过应用细胞自噬抑制剂氯喹处理，成纤维细胞损伤进一步加重，活力下降明显，氯喹是一种常用的溶酶体抑制剂，通过改变溶酶体功能可阻断自噬相关的溶酶体融合和代谢过程。自噬底物P62是由原癌基因c-myc编码，定位于细胞核，在细胞质中合成，自噬发生时细胞质中的P62先与泛素化的蛋白质结合，再与定位于自噬小体内膜上的LC3Ⅱ蛋白结合形成复合物，并在自噬溶酶体中降解，自噬发生时P62水平下降；而自噬活动受到抑制时，P62蛋白则不断累积^[28-30]。研究结果表明晚期糖基化终末产物条件下成纤维细胞自噬标志性蛋白LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ升高，P62水平降低，证实细胞内自噬增加，应用氯喹后P62水平升高，自噬水平降低，细胞生存率降低，说明自噬水平的下降会导致细胞活性的降低。以上结果证实，自噬可以减弱晚期糖基化终末产物对细胞的损伤作用，对细胞起到一定的早期保护作用。

自噬对细胞具有双重作用，当自噬过度激活时，细胞发生裂解，引起自噬性细胞死亡^[31-33]，早期诱导自噬，提升自噬水平，可减轻晚期糖基化终末产物对成纤维细胞的损伤，表明调控自噬可能是提高晚期糖基化终末产物环境下成纤维细胞活力的潜在治疗靶点，这将为糖尿病创面的治疗提供新的思路与理论基础。通过增强创面自噬性清除晚期糖基化终末产物，有望为糖尿病创面修复治疗提供新策略，具有良好的临床应用前景^[34]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

自噬对晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤的早期保护

Autophagy has an early protective effect against fibroblast injury induced by advanced glycation end products

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 10

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[4]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[5]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[6]	刘志超, 张帆, 孙旗, 康晓乐, 袁巧妹, 柳根哲, 陈江. 不同静水压下人椎间盘髓核细胞的形态和活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1172-1176.
[7]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[8]	李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.
[9]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[10]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[11]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[12]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[13]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[14]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[15]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.