2.1  X射线光电子能谱分析结果  不同硅酸盐生物陶瓷中均存在Si、Ca、O三种元素，对于CS-5Cu、CS-5Mg、CS-5Cu/5Mg生物陶瓷而言，均成功引入Cu或Mg元素，且没有其他元素污染或Cu、Mg元素之间交叉污染的现象。根据4种陶瓷表面的全谱检测得知，在不同生物陶瓷样品中Si、Cu、Mg与O之间分别以SiO₂、CuO、MgO的化合形态形式存在，Ca则与SiO₄^4-形成Ca₂SiO₄，见表3。

2.2  X射线衍射与傅里叶红外光谱分析结果  在SBF模拟液体中浸泡不同时间后4种样本X射线衍射图谱，见图1，观察到浸泡后的样本仍保持着非晶体状态的典型特征，但均出现多个晶面相，说明所有样本表面均有晶体形成。将浸泡后的4种样本相互对比，在002、211、310、222、213晶面出现衍射峰，通过对比标准JCPDS卡片(卡号72-1243)发现这些峰对应的是磷灰石晶体的衍射峰，见图2，说明经在SBF模拟液体中浸泡3 d后4种样品表面均形成的是磷灰石晶体。不同样本表面的磷灰石晶面相有明显差别，CS-5Cu陶瓷的多个晶面相衍射峰强度是4种样本中最强的，CS陶瓷次之，再次是CS-5Cu/5Mg，而CS-5Mg衍射峰最弱。

如图3所示，将硅酸盐生物活性陶瓷样品浸泡于SBF模拟液体后傅里叶红外光谱极性基团发生了明显变化：非晶体典型的1 000 cm^-1附近的Si-O-Si伸缩振荡峰明显减弱或收窄，取而代之的是P-O吸收峰；在870 cm^-1和1 460 cm^-1附近的波峰对应CO₃^2-振动，表明矿化过程中部分CO₃^2-基团取代磷灰石中的PO₄^3-基团(B型碳酸盐磷灰石)；而CS-5Cu陶瓷样本在870 cm^-1和1 460 cm^-1两处波峰的振幅均较CS、CS-5Mg和CS-5Cu/5Mg陶瓷更明显和宽大，这说明CS-5Cu陶瓷表面有更多磷灰石沉积结晶，这与X射线衍射检测结果一致。综合X射线衍射和傅里叶红外光谱检测结果可得，4种硅酸盐生物活性陶瓷样本均能在体外矿化出的磷灰石晶体，且属于B型碳酸磷灰石，它与人骨骼的无机矿物质成分十分相似。

2.3  成骨细胞培养和鉴定结果  培养至第2天，成骨细胞呈短梭形、三角形或立方形等，细胞状态良好，边界清晰，表面较为光滑，胞质突起，生长势呈放射状，与相邻细胞连接，见图4A。培养1周后细胞形态趋向于长梭形，集落生长，细胞排列紧密而整齐，局部区域还出现了细胞重叠现象，呈“铺路石”状排列，细胞透光性增加，见图4B，这些细胞形态表象符合成骨细胞的形态特征。

培养的绝大多数细胞胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细小颗粒，染色呈阳性反应，且阳性率超过90%，见图5A，说明细胞具有很强的分泌碱性磷酸酶的能力，符合成骨细胞的生物学特征。用茜素红染液对细胞进行染色，茜素红染料可以使钙结节显示桔红色。倒置相差显微镜观察显示细胞茜素红染色结果呈阳性，细胞产生钙化结节，见图5B。

2.4  流式细胞仪测定结果  结果显示，不同氧化物的加入均对成骨细胞增殖具有促进作用，其中以CuO和MgO混合氧化物陶瓷对成骨细胞增殖的促进作用最为明显，见图6。

2.5  碱性磷酸酶测定结果  与CS组相比，其他3组成骨细胞的碱性磷酸酶活性明显增强，这表明CuO和MgO有利于促进成骨细胞分化，其中以CuO和MgO混合氧化物陶瓷对成骨细胞分泌碱性磷酸酶的促进作用最为明显，见图7。

2.6  免疫荧光检测结果  免疫荧光染色显示各生物活性陶瓷材料表面的细胞均发展的很好，其中CS-5Cu/5Mg有最多量的黏着及更清晰的肌动蛋白纤维，见图8。

2.7  qRT-PCR检测结果  成骨细胞在CS-5Cu/5Mg、CS-5Cu、CS-5Mg陶瓷上表达的骨桥蛋白和骨钙素基因活性明显强于CS组，见图9，这表明Cu²⁺和Mg²⁺均可以促进成骨细胞分化，并在一定程度上可以呈现协同作用，促成骨分化作用强弱为CS-5Cu/5Mg >CS-5Cu≈CS-5Mg>CS。

骨缺损的修复是临床治疗的一大难题，自体骨移植是目前临床治疗的主要方式，但存在自身骨量不足或骨质被吸收等缺点，而同种异体骨或异种骨移植又存在免疫排异、感染等风险^[1-3]。组织工程骨作为一种有望克服传统骨修复方式诸多不足的治疗方法，已成为骨修复研究最具前景的方向。

组织工程包含种子细胞、支架、生长因子3要素，其中支架材料是当前组织工程研究的热点之一。通过大量研究证实，硅酸盐生物陶瓷是组织工程骨支架材料的理想选择之一^[4-6]。硅酸盐生物活性陶瓷作为一种新型可降解生物活性材料，能从分子水平上激发特定的细胞响应，负载骨修复相关的活性物质、释放活性离子，或直接在材料表面与细胞发生反应，诱导、刺激新骨生成，具有非常良好的发展前景。但硅酸盐生物活性陶瓷存在着机械性能、力学性能和促进成骨、成血管方面的不足^[7-9]。生物活性离子是一类在分子水平对细胞具有特殊激发作功能的碱金属或碱土离子。研究发现，铜、镁作为人体所必需的微量元素对成骨细胞和成血管细胞都具有明显的诱导、刺激作用^[10-12]。

实验利用溶胶-凝胶法制备掺杂铜、镁的不同组成硅酸盐生物活性陶瓷，比较铜、镁两种元素对硅酸盐生物活性陶瓷的降解性及生物活性的影响，以及不同组成硅酸盐生物活性陶瓷对成骨细胞细胞增殖、细胞活性及细胞黏附迁移的作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods 

1.1  设计  对比观察细胞学实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年1月至2018年10月在西南医科大学附属口腔医院口颌面修复重建和再生实验室进行。

1.3  材料  

1.3.1  实验动物  新生1-3 d SD大鼠乳鼠，购于南京医科大学实验动物中心。动物实验获得西南医科大学附属口腔医院伦理委员会批准。

1.3.2  主要实验设备  倒置荧光显微镜、高清数码相机(日本Nikon公司)；精密pH仪(上海雷磁新泾仪器有限公司)；马弗炉(鹤壁市恒信电子有限公司)；粉末X射线衍射仪(德国布鲁克公司)；傅里叶变换红外光谱仪、X射线光电子能谱仪(美国赛默飞公司)；ABI 7500系统(德国Scandrop，JENA)；流式细胞仪(BD FACS Vantage SE，美国)；各种医疗手术器械(上海医疗器械公司)。

1.3.3  主要实验试剂  正硅酸乙酯、四水硝酸钙、三水合硝酸镁、六水合硝酸铜(国药集团化学试剂有限公司)；DMEM培养基(美国，GIBCO公司)；茜素红(美国，Sigma公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(中国，南京建成生物工程研究所)；多聚甲醛(中国，国药集团有限公司)；1 mol/L Tris-HCl(中国，江苏康为世纪生物科技公司)；RNA总提取试剂盒(中国，biotake)；cDNA合成试剂盒(美国，费舍尔公司)；SYBR PCR 组合试剂盒(德国，T advanced，JENA)。

1.4  实验方法

1.4.1  硅酸盐生物活性陶瓷的制备  取硅酸钙生物陶瓷的化学组分为摩尔百分比60%SiO₂、摩尔百分比40%CaO，再以摩尔百分比5%相同含量的铜、镁部分取代硅酸钙陶瓷中的钙，制备含有铜、镁的硅酸盐生物陶瓷，如表1配比所示，溶胶-凝胶法制备生物陶瓷。

采用溶胶-凝胶法制备硅酸钙生物活性陶瓷粉体，简要步骤为：按配比将22 mL正硅酸乙酯溶于无水乙醇中制成   0.8 mol/L的溶液，加入去离子水，将pH值调至2.0-3.0；在搅拌器中加入适量清水预热至50 ℃，100 r/min搅拌1 h，依次加入11.80 g四水硝酸钙、2.02 g三水硝酸铜和2.13 g六水硝酸镁，搅拌水解各1 h得到透明溶胶；室温通风下放置3 d后得到湿凝胶，将湿凝胶放干燥1 d得到干凝胶。将获得的干凝胶研磨成粉后煅烧，最后用研钵研磨热处理后的硅酸盐生物活性陶瓷(记为CS)，过150目筛得到样品粉体。采用相同方法制备掺铜硅酸盐生物陶瓷、掺镁硅酸盐生物陶瓷与掺铜镁硅酸盐生物活性陶瓷(陶瓷中铜、镁的摩尔百分比均为5%)，分别记为CS-5Cu、CS-5Mg、CS-5Cu/5Mg。

选用改良型SBF模拟液体测定样品体外矿化情况，X射线光电子能谱分析对样品表面的元素组成、元素含量及元素化合态情况进行检测分析，X射线衍射仪对4种硅酸盐陶瓷样品在模拟液体中浸泡前后的物相组成特征峰进行分析，傅里叶变换红外光谱仪测定分析材料成分。

以溶胶-凝胶法制备的硅酸钙生物活性陶瓷粉体为原料，加入质量分数3%的羧甲基纤维素作为黏结剂，用钢模在20 MPa下压制成直径为6 mm、厚度为3 mm的圆片状支架，再经700 ℃下热处理1 h备用。采用同样的方法制备其他硅酸盐生物陶瓷片状支架。

1.4.2  成骨细胞的获取  取出SD大鼠颅盖骨，颅骨切成约1 mm×1 mm×1 mm块状，均匀放置在25 mL培养瓶里。培养液的配置：DMEM中添加体积分数10%热灭活胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 mg/L)，和0.05%L-谷氨酰胺，并保持在37 ℃下湿润空气(体积分数5%CO₂/95%)中。每2 d更换一次培养液。选用第4-6代的成骨细胞用于实验，将融合后的细胞用Von Kossa的染色方法进行传代培养和鉴定。

1.4.3  成骨细胞与硅酸盐生物活性陶瓷共培养  将成骨细胞以密度为2×10⁵/支架接种到不同组成成分的支架中(CS、CS-5Cu、CS-5Mg、CS-5Cu/5Mg)，将生物陶瓷支架灭菌后置于已添加体积分数10%热灭活胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 mg/L)和0.05%L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，在并保持在37 ℃下湿润空气(体积分数5%CO₂/95%O₂)中培养。继续培养24 h，然后测定成骨细胞的生物学行为，包括细胞增殖、细胞分化及细胞骨架形态。

1.4.4  成骨细胞增殖指数测定  成骨细胞在不同硅酸盐生物陶瓷支架上培养24 h后，PBS洗涤胰蛋白酶消化后的细胞，然后置于4 ℃体积分数70%乙醇溶液中保存。将细胞悬液2 000 r/min离心10 min。收集细胞，PBS漂洗后再次添加1 mL的PBS以获取细胞悬液。在悬液中加入20 μL的RNAse(10 g/L)，然后置于37 ℃下培养至少30 min。接着，细胞悬液内加入50 μL吡啶碘化物，37 ℃、无光条件下再培养30 min。最后，利用流式细胞仪检测细胞周期阶段，并使用Cell Quest软件(Becton Dickinson)加以分析。细胞增殖指数(PI%)=(S+G₂/M)/(G₀/G₁+S+G₂/M)×100%。

1.4.5  成骨细胞分泌碱性磷酸酶的测定  成骨细胞在不同硅酸盐生物陶瓷支架上培养24 h后，置于150 µL冰点裂解缓冲液中裂解30 min，14 000 r/min离心上清液得到总蛋白。通过碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime，中国)测定总蛋白浓度，用来规范碱性磷酸酶活性。在490 nm和570 nm用多功能酶标仪(Bio-Rad)测定吸光度，进行碱性磷酸酶与总蛋白浓度检测。

1.4.6  成骨细胞黏着斑和细胞骨架形态测定  成骨细胞在不同硅酸盐生物陶瓷支架上培养24 h后，采用免疫荧光染色法检测成骨细胞的黏着斑形成和细胞骨架重排情况。染色前，将成骨细胞置于含40 g/L多聚甲醛的PBS中培养30 min，在PBS里用0.25%Triton X-100渗透10 min。随后，在PBS中加入1%牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点与成骨细胞孵化，持续1 h。观察黏着斑的形成，首先在室温下孵化小鼠单克隆抗黏着斑蛋白抗体60 min，以染色黏着斑；接着在室温下用异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗鼠免疫球蛋白二级抗体孵化60 min。室温下用Rhodamine-Phalloidin染色F-肌动蛋白60 min，孵育染色细胞核10 min。清洗染色标本，置于甘油上，用倒置荧光显微镜进行检测。

1.4.7  qRT-PCR测定成骨细胞骨桥蛋白和骨钙素基因表达  成骨细胞在不同硅酸盐生物陶瓷支架上培养24 h后，用qRT-PCR进一步评估成骨细胞的分化程度。测定常用成骨分化标记物，包括骨桥蛋白和骨钙素的mRNA相对表达水平，主引物如表2所示。用RNA总提取试剂盒进行qRT-PCR样品总RNA分离提取。接着，使用Revertaid第一链cDNA合成试剂盒从1 mg总RNA反转录互补DNA。用SYBR PCR 组合试剂盒进行实时PCR检测，再用ABI 7500系统进行反应。最后，用标记基因GAPDH标准化每个基因mRNA表达水平，量化是相基于循环阈值(CT)。

1.5  主要观察指标  各组硅酸盐生物活性陶瓷支架上成骨细胞的增殖指数、碱性磷酸酶分泌量、骨桥蛋白和骨钙素基因表达及黏着斑和肌动蛋白表达。

1.6  统计学分析  统计学软件为OriginPro(版本8.0)，所有数据参数均用x(_)±s(所有实验中n≥6)，使用单因素方差分析技术(ANOVA)，置信区间设置为0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

3.1  不同组成硅酸盐生物陶瓷的制备及表征  生物活性陶瓷已被广泛应用于骨缺损修复和再生，尤其在组织工程骨的研究中^[13-15]。良好的生物活性、细胞相容性和骨支架与骨再生相配的降解性是确保治疗成功的保障。实验中分析铜、镁离子对硅酸盐生物陶瓷析晶、矿化能力的影响，通过溶胶-凝胶法成功制备了掺杂摩尔百分比5%CuO、MgO的硅酸盐生物陶瓷(CS-5Cu、CS-5Mg、CS-5Cu/5Mg)和硅酸钙活性陶瓷(CS)，而且对4种不同生物陶瓷材料进行了测试表征。X射线光电子能谱分析结果显示，Cu、Mg两种元素均成功引入相应的生物陶瓷之中，制备了成分纯净的多元硅酸盐生物陶瓷(CS-5Cu、CS-5Mg、CS-5Cu/ 5Mg)，这体现出溶胶-凝胶法在制备多元硅酸盐生物陶瓷方面的优势。Si、Cu、Mg三种元素均以相应的氧化物化合态出现，结合X射线衍射结果证明制备的生物陶瓷为非晶态无机材料。不同生物陶瓷都出现了β-Ca₂SiO₄的晶面相，但随着氧化物的掺入，生物陶瓷中出现了相应的CuO、MgCaSi₂O₆晶相衍射峰，而β-Ca₂SiO₄衍射峰强度有所减弱，当CuO和MgO同时存在时β-Ca₂SiO₄衍射峰强度降至最低，但不同生物陶瓷主体结构仍是非晶态形式。由于β-Ca₂SiO₄具有非常优良的诱导磷灰石沉积能力，而Cu和Mg相对抑制β-Ca₂SiO₄析晶的特性可能对材料陶瓷的矿化能力有一定影响。研究表明，当生物陶瓷植入体内后与体液发生物理化学反应，在陶瓷表面会形成一层与骨无机成分相似的羟基磷灰石层，并与骨组织发生紧密的化学键合，促进骨修复再生^[16-18]。

通过X射线衍射和傅里叶红外光谱检测发现，不同的生物陶瓷有矿化结晶的能力，即生物活性。不同生物陶瓷的生物活性遵循以下规律：CS-5Cu>CS>CS-5Cu/5Mg> CS-5Mg。生物活性的差异与铜、镁对硅酸盐陶瓷结构的影响密切相关：一方面，CuO、MgO掺入硅酸盐陶瓷后β-Ca₂SiO₄析晶量的减少，可能降低了生物陶瓷对磷灰石沉积结晶的诱导能力；另一方面，Cu²⁺、Mg²⁺对硅酸盐陶瓷结构的影响也是造成生物活性差异的重要原因。硅酸盐生物陶瓷的主体是SiO₂、CaO，并形成以Si-O为主的网络结构，其中Si是网络形成剂，而Ca和一些一价和二价离子可作为网络中间体可以嵌在Si-O网络结构中^[19]，通过调整网络结构的完整性和紧密程度影响陶瓷的性能。Cu²⁺、Mg²⁺作为网络中间体嵌入Si-O网络结构后，对Si-O网络结构的影响表现出不同的作用效果。根据硅酸盐生物陶瓷的矿化作用机制，在陶瓷表面的Si⁴⁺层是诱导羟基磷灰石形成的关键因素之一，所以在一定时间内陶瓷溶解出Si⁴⁺的多少是羟基磷灰石形成的重要影响因素之一。Cu²⁺通过取代Ca²⁺的方式嵌入Si-O网络过程，可能破坏超分子混合自组装过程中的无机相缩聚，从而使三维网络空间结构变得脆弱^[20-22]，陶瓷结构变得疏松，进而可以加快陶瓷的降解速度，在陶瓷表面形成的Si⁴⁺层更快、更多，这将加速羟基磷灰石的沉积结晶速度。而Mg²⁺在取代Ca²⁺后并不破坏Si-O网络结构，由于Mg²⁺半径小于Ca²⁺半径，根据计算电场强度公式I=Z/r²，计算可知I_Mg²⁺>I_Ca²⁺，电场强度越大积聚效应越强，网络结构近程有序范围增多，在宏观上表现为使陶瓷网络结构更加紧密，提高陶瓷的物理性能，材料本身也更容易析晶，但同时降低了材料的降解性和诱导羟基磷灰石沉积的结晶速度^[23-26]。

3.2  硅酸盐基生物活性陶瓷对成骨细胞生物学行为的影响  在组织工程骨中，理想支架材料的降解速度应与成骨速度相匹配，且具有促进成骨、成血管的生物活性^[27-28]。

实验中通过调节CuO、MgO的掺入比例，观察硅酸盐生物陶瓷的降解性与生物活性，发现掺有不同氧化物(CuO、MgO)的生物陶瓷材料对成骨细胞的聚集效应影响，并了解这些影响的可能机制。活性金属离子是骨组织工程中非常重要的部分，因此常被作为研究成骨细胞的体外添加剂，也是体内生物反应过程中不可绕过的一部分。实验中掺入不同类型金属氧化物的生物陶瓷材料，均可以很大程度上调节成骨细胞的生物学行为，CS-5Cu/5Mg生物陶瓷材料对成骨细胞的成骨活性影响最大，因此认为Cu²⁺和Mg²⁺可以很大程度上调节黏着斑和细胞骨架，并且两者同时存在时可以展现出协同效应。众所周知，碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素的产生在骨形成和骨重塑中发挥重要作用，它们是成骨细胞分化的重要依据^[29-31]。鉴于此，选定碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素为参数以分析不同生物陶瓷对成骨细胞分化的影响。成骨细胞初始黏着和铺展包括整合素诱导骨架重排和黏着斑初形成，已被视为影响成骨细胞活性及后续生物学效应相关信号转导的关键因素。正是由于Cu²⁺和Mg²⁺的不同，影响了成骨细胞早期的黏附和铺展现象，从而导致了其后续的生物学效应。总之，掺有不同氧化物(CuO、MgO)的生物陶瓷材料对成骨细胞的生物学效应产生了很大影响，包括成骨细胞黏附和铺展、增殖、分化等^[32-33]。

综上所述，铜元素能够加快硅酸盐生物活性陶瓷的降解速度，增强生物陶瓷的生物活性，而镁元素表现出与之相反的调节作用。铜和镁离子对成骨细胞的增殖、成骨相关基因表达及对细胞黏附、铺展均表现出促进作用，且两种离子表现出协同效应。此次实验结论为组织工程骨的研究提供了实验学基础，对骨组织工程修复及构建体外生物反应器具有重要的指导意义。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

硅酸盐生物活性陶瓷：能从分子水平上激发特定的细胞响应，负载骨修复相关的活性物质、释放活性离子，或直接在材料表面与细胞发生反应，诱导、刺激新骨生成的新型可降解生物活性材料。

生物活性离子：是一类在分子水平对细胞具有特殊激发作功能的碱金属或碱土离子。研究发现，铜、镁作为人体所必需的微量元素都对成骨细胞和成血管细胞都具有明显的诱导、刺激作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

硅酸盐生物活性陶瓷作为组织工程骨理想支架材料之一存在着机械性能、力学性能和促进成骨方面的不足。实验利用溶胶-凝胶法制备掺杂铜、镁的不同组成硅酸盐生物活性陶瓷，并与成骨细胞共培养。结果提示铜、镁离子对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶分泌、成骨细胞骨桥蛋白和骨钙素的基因表达均有促进作用，对成骨细胞黏着斑和细胞骨架都表现出积极正面的调节作用，二者具有协同作用，同时掺入两种离子硅酸盐生物活性陶瓷的促进效果最明显。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程