2.1  透射电镜观察结果  通过透射电镜观察微球及电纺丝的形态，结果见图2所示，纳米微球为规整的圆形球体，外圈包覆均匀的一层壳聚糖，微球粘连情况不严重，粒径分布较为均匀。静电纺丝支架的透射电镜图显示微球是可以有效分散在静电纺丝中的，同时微球的基本形态得到保留，并且发现静电纺丝直径与微球直径也是相匹配的。

2.2  扫描电镜观察结果  药物缓释纳米纤维膜是由直径较为均匀且表面连续光滑的丝状结构构成，电纺丝无规则互相交织形成网状结构，网状结构中有很多孔隙，见图3，这些孔隙可供细胞黏附生长，也可为水及营养物质的输送提供管道途径^[16-17]。药物缓释膜呈现出类似天然的细胞外基质结构。



由图4A可以看出，载药微球及纳米羟基磷灰石的纺入对静电纺丝的表面粗糙度影响不大，大多数被基质包裹仅少部分暴露于表面。降解1个月时静电纺丝变化不大，3个月时经过PBS的冲刷降解及药物释放以后，静电纺纤维丝由较光滑的表面逐渐转变为粗糙表面，同时载药纳米纤维出现断端，材料的微观结构出现变化，见图4B。   

2.3  缓释阿托伐他汀钙纤维膜的失重率  聚己内酯作为高分子聚合物其分子链中具有众多酯键，酯键发生断裂会导致高分子材料整体结构破坏，导致分子质量下降。缓释阿托伐他汀钙纤维膜1，2，3个月时的失重率分别为18.33%，29.54%，35.70%。第1个月时材料降解速度是最快的，后期降解速度减缓，这是因为高分子聚合物包含的酯键水解断裂是随意的，降解初期链包含酯键分子位点多。降解1个月时，明显感觉材料变得松软，机械性能下降，但是尚可成膜，降解3个月时材料已经不完整。

2.4  缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架的药物释放  药物包封率70%左右，大部分药物可以包裹在牛血清白蛋白微球中。药物缓释支架前期释放较快，前3 d已达21%，体现了短期的爆发式的释放规律，后期释放逐渐变慢，3-30 d的释放模式类似药物零级释放动力学。药物缓释支架持续释放药物时间可达1个月以上，累计释放量达63%，1个月以后药物仍然缓慢释放，见图5。多重屏障半衰期明显延长，整体分为2个阶段，前期短暂的突释放可迅速使药物达到有效作用浓度，后期的缓慢释放可维持药物浓度并明显延长药物作用时间。

2.5  缓释阿托伐他汀钙纳米纤维膜的生物相容性  细胞接种于纳米纤维膜12 h后，扫描电镜观察细胞黏附、迁移及形体学伸展变化情况，见图6所示，MC3T3-E1细胞集簇分布并黏附固定于纤维之上，并且形态已经得到较好伸展，伸出凸起，具有成骨细胞的生长特征。以上现象说明细胞能较好的黏附于药物缓释支架上，药物缓释支架对成骨细胞没有明显毒性。

2.6  缓释阿托伐他汀钙纳米纤维膜的细胞毒性  图7为CCK-8检测结果，由于前3 d的药物突释，药物对成骨细胞增殖的促进作用并没有显示出来，第3天时的吸光度值甚至低于对照组，从第5天开始实验组吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)，结果说明药物保持了活性并可促进细胞的增殖。

将接种细胞培养3 d的药物缓释纤维膜进行活细胞/死细胞双染色观察，结果见图8所示，纤维膜上的细胞表现出较强的绿色荧光，同时红色荧光较少，表明死细胞较少。实验结果表明MC3T3-E1细胞在缓释阿托伐他汀钙纳米纤维膜上具有较好的生长活性。

种植义齿被誉为人类的第三副牙齿。相比于其他修复方式，种植义齿能最大程度上恢复缺牙患者的咀嚼效率，延缓牙槽骨的吸收，提高患者生活质量。现代口腔种植的奠基者Branemark教授在18世纪60年代就提出了种植体骨结合理论，此理论成为了种植体实施的理论基础^[1-2]。种植义齿成功率与种植体整体形态设计及表面处理方式、种植修复设计和手术临床实施情况密切相关，另外很大程度上也取决于患者的牙槽骨条件。种植体植入区域骨的质和量会对其初期稳定性及骨结合性能产生影响^[3-4]，如骨质疏松是种植体失败的危险因素^[5-7]，种植区域三维骨量的不足会直接影响种植义齿的可行性^[8]。综上，提高种植义齿局部骨质及骨量是后续义齿修复后长期行使功能的重要保证。目前临床上对于骨质疏松的治疗仍以药物治疗为主，作者设想设计一种药物缓释材料，在种植义齿手术局部缓释，达到高效提高种植义齿局部骨质及骨量的目的。

他汀类药物在调节血脂、治疗和预防心脑血管疾病方面有显著作用^[9]，同时其还具有促进骨修复的作用。他汀类药物可以通过刺激骨形态发生蛋白2基因促进成骨细胞增殖分化^[10]，同时通过TGF-β/SMAD-3途径抑制成骨细胞凋亡，可通过抑制甲羟戊酸途径来抑制破骨细胞的功能及分化^[11]。近年来，他汀类化合物作为抑制骨吸收促进骨形成的药物，在骨质疏松治疗方面已取得的一定的进展，但是其在体内发挥作用有很多缺陷。GUTIERREZ等^[12]发现局部应用他汀药物的成骨效果较口服好，同时他汀类药物作为小分子药物的半衰期短，局部作用具有浓度依赖性，过高及过快的浓度释放会导致细胞毒性及组织的炎性反应，这些缺陷限制了其在口腔范围的应用，这一问题是口腔科大夫亟需解决的问题。

生物可降解高分子材料在医学领域有着广泛的应用前景，代表性材料有聚己内酯^[13]。聚己内酯具有体内可降解性，降解产物对身体无副作用且可通过粪尿完全排除，不在组织器官中分布和蓄积，生物相容性好^[14]，最重要的是它具有药物透过性，被广泛应用于生物降解性药物控释载体的研究^[15]。聚己内酯已经通过FDA的认证，被正式作为药用辅料收进美国药典，目前为止用聚己内酯制成的左炔诺孕酮Capronor在美国已经完成了Ⅱ期临床试验。

实验设计通过静电纺丝的方法用聚己内酯作为阿托伐药物缓释载体，实现药物阿托伐他汀钙在口腔种植义齿修复局部的应用，达到药物局部持续缓释提高骨质及骨量的效果。实验考虑到药物在有机溶剂及高压环境下有生物活性失活的可能性，所以加入牛血清白蛋白制作成微球包裹进行保护，同时达到双重屏障的作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  观察实验及细胞学实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年4至11月在滨州医学临床医学实验室和山东大学口腔医学院科研实验室完成。

1.3  材料

主要药品、试剂与材料：阿托伐他汀钙(美国瑞辉制药公司)；牛血清白蛋白、纳米羟基磷灰石、聚己内酯(表1)、Triton X-100 及壳聚糖(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；二氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)；鬼笔环肽及DAPI(北京索莱宝科技有限公司)。

主要仪器与设备：天平及pH仪(瑞士METTLER TOLEDO公司)；搅拌器(江苏科析仪器有限公司)；微量注射泵(深圳市通力维纳科技有限公司)；高压电源(大连鼎通科技发展有限公司)；超净工作台(美国Thermo Electron公司)，荧光显微镜(美国Beckman-Coulter公司)；紫外线分光光度计紫外线光分光光度计(日本Hitachi 公司)。

1.4  实验方法  实验设计图如图1所示。

1.4.1  壳聚糖稳定牛血清白蛋白纳米微球的制备  将  50 mg牛血清白蛋白加入5 mL去离子水中，搅拌均匀后加入400 µg阿托伐他汀钙，在连续搅拌下使用微量注射泵以30 mL/h的速度将20 mL无水乙醇泵入，继续持续搅拌混合液至少8 h。将溶解在稀醋酸中的壳聚糖以30 mL/h的速度加入连续搅拌的牛血清白蛋白溶液中，加入20 mL，将混合液至少搅拌8 h。最终混合液通过12 000 r/min离心    15 min，纯化3次，收集最终的沉淀，将最终的沉淀物冻干即得壳聚糖稳定的牛血清白蛋白纳米微球。

1.4.2  静电纺丝制备缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架  将二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺以5∶2的比例配成7 mL液体，加入1 g聚己内酯、150 mg的纳米羟基磷灰石及微球冻干粉0.1 g搅拌均匀，搅拌至少8 h；将混合液放入注射器，推进速度为3 mL/h，针头为6号，电压25 kV，接受距离20 cm，接收器为轮轴接收器，收集所有支架真空干燥，平均静电纺丝膜为0.15 mm。

1.4.3  透射电镜观察  将制备好的微球悬浊液保存在   1 mL的乙醇和水(体积比50∶50)混合液中，充分搅拌超声均匀后，取10 µL悬浊液用无水乙醇扩大200倍，取一滴滴在载碳铜网(230目)上，晾干。在静电纺丝膜制备过程中直接将丝收集到通网上，烘干备用。收集多个样本多部位观察，每个样本至少检测3个部位，综合观察结果。

1.4.4  扫描电镜观察  将制备好的纳米纤维膜裁剪成合适大小的样本，粘在扫描电镜样品台上并连接导电胶，扫描之前为增加样本导电性避免电荷的积聚，需在制备的纤维膜表面喷金处理。采用电子加速率为15 kV的扫描电镜测定纳米纤维膜的微观形态学特性。

1.4.5  失重率及降解后形貌  将干燥之后的纳米纤维膜修剪成20 mm×20 mm(约10 mg)大小，去除背部锡箔纸(此时天平称量记录纤维膜初质量m₀)放入中号培养皿中，注入降解介质(灭菌的PBS，pH=7.4，共6 mL)，放入恒温振荡箱(37 ℃ 100 r/min震荡)，分别在第1，2，3个月随机取样。实验结束后滤纸吸去多余水分后干燥6 h后电子天平称质量(m_t)。失重率按如下公式计算：失重率(%)=[(m₀-m_t)/ m₀]×100%。每组实验重复3次，取平均值作为实验最终结果。扫描电镜观察纤维表面形貌的改变。

1.4.6  载药率及体外释药曲线  将载药微球混合液离心后的上清液收集起来，用紫外线分光光度计(波长为240 nm)计算上清液中的药物含量，去除未载入的药量，通过换算得载药微球的载药量。包封率(%)＝[药物的总质量-上清液中药物的质量)/药物的总质量]×100%。

将一定量的缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架      (20 mm×20 mm，约10 mg)浸入3 mL PBS中(pH=7.4)，放入15 mL离心管进行实验。将离心管移入37 ℃转速为  100 r/min的恒温振荡箱，达到预定时间后取出1 mL，用分光光度计测定缓释液中的药物浓度，波长设置为240 nm，同时加入相同体积新的PBS，计算药物浓度及累计释放量。每组设置3个平行组，并取3组实验结果的平均值作为最终结果。预定时间为6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、10 d、14 d、18 d、22 d、26 d、30 d。

1.4.7  细胞早期黏附生长及细胞增殖  将载纳米纤维膜剪成R=15 mm的圆形(与24孔板直径相匹配)，去除背面铝箔纸后将纤维膜经紫外线消毒(正反面各4 h)，消毒后用无菌不锈钢环压于培养皿底部，加入培养基使培养基完全没过纤维支架，浸泡30 min后再进行下一步操作。

将对数生长期的MC3T3-E1细胞(山东大学口腔医学院科研实验室赠送)用胰蛋白酶消化液消化成细胞悬浮液，按照1×10⁴/cm²的密度接种到纳米纤维屏障膜上，放于细胞培养箱中进行培养，同时以不加纤维膜作为对照组。细胞培养12 h后多聚甲醛细胞固定，用扫描电镜观察结果。

细胞早期黏附：细胞培养12 h后，拿出细胞爬片及药物缓释支架吸取多余水分，PBS冲洗后细胞固定、脱水干燥，扫描电镜观察。

细胞增殖：培养1，3，5，7 d后，在培养基加入CCK-8工作液(80 µL)，置于恒温培养箱培养2 h后吸出置于96孔板中，通过酶标仪在450 nm处测吸光度值。

1.4.8  活细胞/死细胞双染色  将药物缓释支架消毒浸泡，将消化好的细胞悬浮液按1×10⁴/cm²的密度接种到纳米纤维支架膜上，放于细胞培养箱中进行培养，培养3 d进行活死细胞染色。将试剂提前拿出室温解冻，将2 mmol/L Calcein-AM及1.5 mmol/L PI按照一定比例加到Assay Buffer中，混合均匀制备出工作液备用。每孔取300 µL工作液，加入染色30 min后去除工作液，在490 nm波长荧光显微镜下观察。

1.5  主要观察指标  缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架的表征及对成骨细胞增殖与黏附的影响。

1.6  统计学分析  计量资料用x(_)±s表示。所有数据资料以统计软件包SPSS 18.0进行处理，数据比较采用单因素方差分析，设P < 0.05时差异有显著性意义。

静电纺丝作为一种小分子药物的缓释材料，在局部控释缓释方面已经有了较为广泛的研究^[18-20]。根据电镜图可以看出，药物缓释支架呈现出类似天然细胞外基质的结构，纤维交织空隙分布的三维立体形态模拟骨微环境，有利于成骨细胞的增殖与分化^[21-22]，目前为止已经有很多学者利用静电纺丝这一特性^[23-25]。类似细胞外基质的环境增加了细胞的黏附面积，高表面积本身就可以诱导贴壁细胞的黏附^[26]，对细胞的增殖有促进作用，同时空隙形成的孔道有利于营养物的传送和吸水性能，也是有利于细胞黏附及生长的因素。将药物加载于缓释支架上，药物的释放类似于零级释放动力学，可以保证药物的作用浓度并延长药物作用时间，促进成骨细胞的增值。

 药物释放是通过药物扩散及聚己内酯聚合物降解实现的^[20]。作者设计将药物包裹于牛血清白蛋白中再纺于与聚己内酯上，一方面加载高压时药物活性可以受到保护，另一方面双层屏障缓释药物突释情况可以受到控制，同时亲水性物质牛血清白蛋白的载入可以显著加快材料的降解。研究表明单纯聚己内酯降解需要2年甚至更长的时间，加入亲水性较好的物质可显著提高其降解性能。KIM等^[27]发现一些亲水性的药物可被包封在两亲性嵌段共聚物的亲水嵌段内，促使微球与聚己内酯更好地结合。实验结果显示材料3个月就已经降解35.70%，但是与成骨时间相比还不够，前期药物缓释支架降解较快，后2个月逐渐变缓慢，可以预测后期材料降解会变得更加缓慢。缓释支架不但应具有一定的机械性能，还应具有与组织形成想相匹配的降解速率^[28-29]，所以如何进一步提高材料的降解性能是后期实验需要解决的一个问题。

课题利用去溶剂法制备了载阿托伐他汀钙微球，并将其载入静电纺丝纤维中，成功制备出了双屏障缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架。实验结果表明，载药微球颗粒均匀、无粘连，纺入静电纺丝可被聚己内酯基质包裹保持基本形态不变，该新型药物缓释支架表现出了良好的细胞相容性，细胞可以在纤维支架表面正常黏附和生长，同时可以促进细胞增殖，为后续实验提供了理论基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

去溶剂化法：如果溶胶的溶剂化层和胶粒较强的结合力被破坏，则会导致两者的分离，胶体就会聚沉，这个过程就是去溶剂化过程，一般通过加热或者加入去溶剂化溶剂实现，乙醇是常见制备蛋白微粒的去溶剂化溶剂。

静电纺丝：是一种特殊的纤维制造工艺，高分子聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形(即“泰勒锥”)，并从圆锥尖端延展得到纤维细丝，是高分子流体静电雾化的一种形式，在材料学领域已有较为广泛的应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

实验将去溶剂法与静电纺丝技术相结合，用牛血清白蛋白及聚己内酯为基础材料制备出一种药物双屏障缓释支架，以达到药物局部靶向缓慢释放的效果。实验成功制备出包覆阿托伐汀钙的双屏障缓释纤维支架，实现药物局部长达1个月以上的缓释，并对纤维支架材料进行了体外细胞学研究，结果显示材料具有良好的生物安全性，可促进成骨细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程