2.1  实验动物数量分析  实验动物模型选用SD大鼠30只，分为空白对照组10只、自体神经组10只及嗅鞘细胞上清组10只。大鼠全部存活，均进入后续实验结果数据分析。

2.2  嗅鞘细胞的纯化鉴定结果  嗅鞘细胞经过纯化培养后进行固定，并对嗅鞘细胞进行GFAP和p75^NTR双标免疫荧光染色和DAPI染色，见图1。GFAP和p75^NTR双染阳性的细胞认定为嗅鞘细胞。嗅鞘细胞纯度(%)=GFAP和p75^NTR双染阳性细胞数量/DAPI阳性细胞数量。该实验中嗅鞘细胞的纯度为(94.4±3.1)%。

2.3  嗅鞘细胞上清液促进背根神经节组织块神经轴突的生长  与PBS对照组、空白对照组和低剂量嗅鞘细胞上清组对比，高剂量嗅鞘细胞上清组背根神经节组织块的5根最长神经轴突平均长度显著增加(P < 0.05)。另外，为避免组织块之间自身差异，计算比较了神经轴突总面积/组织块面积。结果发现，高剂量嗅鞘细胞上清组背根神经节组织块的神经轴突总面积/组织块面积显著高于PBS对照组、空白对照组、低剂量嗅鞘细胞上清组(P < 0.05)，见图2。以上数据表明，高剂量嗅鞘细胞上清能够在体外环境下促进背根神经节组织块神经轴突的生长。

2.4  嗅鞘细胞上清液能够促进大鼠坐骨神经的再生  自体神经组再生神经贯通缺损区域，并且再生神经排列有序；嗅鞘细胞上清处理组神经再生情况明显优于空白对照组，再生神经贯通缺损区域，损伤远端也有较多再生神经分布，与自体神经组类似，见图3。以上结果表明，在体内条件下嗅鞘细胞上清处理组能够促进坐骨神经的再生。

2.5  嗅鞘细胞上清液能够促进大鼠坐骨神经损伤后再生轴突髓鞘化  透射电镜结果显示，嗅鞘细胞上清处理组再生神经轴突的数量显著多于空白对照组(P < 0.05)。同时，嗅鞘细胞上清处理组再生神经轴突的髓鞘厚度显著高于空白对照组(P < 0.05)，见图4。上述结果说明嗅鞘细胞上清液能够促进大鼠坐骨神经损伤后再生轴突的髓鞘化。

周围神经损伤是一种临床常见的组织损伤，可导致不可逆的组织萎缩和远端器官功能障碍^[1]。近年来，显微外科的发展极大地提升了周围神经损伤的修复效果^[2-4]。对于无法进行端对端缝合的长节段神经缺损，神经移植仍然是修复损伤的金标准，但存在供体移植物供应有限、神经功能丧失、尺寸大小不匹配及移植后神经瘤形成等问题^[5-7]。因此，如何寻找替代治疗方案迫在眉睫。

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)是一种特殊的神经胶质细胞，存在于鼻黏膜的神经纤维层和嗅球，兼具星形胶质细胞和许旺细胞的功能特性^[8-9]。大量研究表明，嗅鞘细胞在中枢神经系统和外周神经系统环境下，均可以促进神经修复^[10-13]，并在一定条件下恢复部分运动功能^[14-17]，其机制包括分泌细胞外基质成分以及各种神经营养因子，与激活的宿主胶质细胞相互作用，促进神经血管的形成以及调节免疫反应^[18-19]；除此之外，嗅鞘细胞还能够诱导神经轴突的再生并为其“搭桥铺路”，促进髓鞘的形成，调节免疫细胞吞噬细胞碎片，进而构建促进神经修复再生的微环境^[20]。然而，神经损伤局部移植的嗅鞘细胞存活率很低(0.3%-3%)^[19，21]，严重限制了嗅鞘细胞发挥其神经修复的作用；同时，嗅鞘细胞来源、培养代数、纯度、移植时间窗等也是嗅鞘细胞移植所面临的困扰^[22-24]。这促使学者们探究一种新的基于嗅鞘细胞的替代方法，能够避免上述问题，并有效促进周围神经损伤的修复。

近来，有研究发现嗅鞘细胞培养上清含有多种神经营养因子，可以促进神经损伤修复再生^[25-26]，并且嗅鞘细胞培养上清能够突破移植细胞存活率低、免疫排斥、细胞移植所需的额外手术操作等限制。已有研究表明嗅鞘细胞培养上清能够促进脊髓损伤后轴突的再生以及功能的恢   复^[19，27]。然而，在周围神经损伤情况下，嗅鞘细胞培养上清是否同样发挥促进神经轴突再生的作用，目前鲜有研究报道。因此，该研究旨在确定嗅鞘细胞培养上清促进大鼠坐骨神经损伤修复的作用，希望为周围神经损伤提供了一种新的基于嗅鞘细胞的无细胞疗法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  2018年3月至2019年7月在空军军医大学西京医骨科实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  选取2 d龄SD大鼠用于提取嗅鞘细胞和提取背根神经节；选取雄性SD大鼠30只用于体内实验，6-8周龄，体质量为220 g左右。所有大鼠均由空军军医大学实验动物中心提供，该实验经空军军医大学动物实验伦理委员会批准(KY20172005-1)。

1.3.2  实验主要试剂  胰蛋白酶(Solarbio)；胎牛血清(Gibco)；DF12(DMEM和Ham’s F12的1∶1混合物)培养基(HyClone)；左旋多聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)(Sigma)；青霉素-链霉素(Solarbio)；磷酸盐缓冲盐水(HyClone)；多聚甲醛(科昊生物)；Triton X-100(Solarbio)；聚ε-己内酯(ε-caprolactone，PCL)(Sigma)；进口山羊血清工作液(中杉金桥)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma)；鼠尾蛋白(Solarbio)；鸡抗大鼠GFAP单克隆抗体(Abcam)；兔抗大鼠p75^NTR单克隆抗体(Abcam)；β-tubulin-Ⅲ兔单克隆抗体(CST)；鼠抗NF160单克隆抗体(Abcam)；山羊抗鸡Cy3(康为世纪)；山羊抗鼠FITC(康为世纪)。

1.3.3  实验主要仪器  台式离心机(Xiang Yi)；培养瓶(Biofil)；石蜡切片机(LEICA)；共聚焦显微镜(Nikon)；透射电镜(H-600；Hitachi)；注射泵(Cole Parmer)。

1.4  实验方法

1.4.1  嗅鞘细胞的提取培养和纯化  依照NASH等^[28]提出的方法，从2 d龄SD大鼠的嗅球中剥离出嗅觉神经层，并从鼻中隔两侧刮出嗅黏膜。用无菌剪刀剪碎后加入0.25%胰蛋白酶在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中酶促消化   5 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的DF12培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，使用DF12培养基将细胞重悬，接种至未包被的培养瓶中，在37 ℃，体积分数为5%CO₂孵箱中培养18 h；取细胞悬液，再次转移至另一未提前包被的培养瓶中，继续培养36 h；最后，将细胞悬液转移至用10 g/L左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，用含体积分数为10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DF12培养基继续培养，用于后续实验。

1.4.2  嗅鞘细胞的鉴定  纯化的原代嗅鞘细胞培养7 d，PBS漂洗，在40 g/L多聚甲醛中固定15 min；在室温下与TritionX-100和体积分数为10%山羊血清封闭液孵育    60 min；加入鸡抗大鼠GFAP单克隆抗体(1∶1 000)和兔抗大鼠p75^NTR单克隆抗体(1∶50)在4 ℃下孵育过夜；室温复温1 h后PBS洗涤3次，每次5 min，加入山羊抗鸡Cy3   (1∶500)和山羊抗兔FITC(1∶500)二抗，在37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中孵育60 min，PBS洗涤3遍；在室温下加入100 μg/L DAPI孵育5 min，PBS洗涤3遍；然后使用抗荧光淬灭剂封固；拍摄随机区域并计数GFAP和p75^NTR双阳性细胞数量及DAPI阳性细胞数量，计算嗅鞘细胞纯度。

1.4.3  嗅鞘细胞培养上清的制备  纯化后原代嗅鞘细胞培养7 d，用0.25%胰蛋白酶消化并在上述培养基中传代培养。每2 d更换培养基，并在传代培养后第4天和第6天收集细胞上清液，将上清液在4 ℃下以2 500 r/min离心10 min，应用0.4 μm过滤器过滤以去除细胞碎片，过滤后的上清液在-80 ℃冷冻直至使用。

1.4.4  嗅鞘细胞培养上清对背根神经节的作用  将2 d龄SD大鼠的背根神经节组织块切下并剥去外膜，0.25%胰蛋白酶消化60 min后用含体积分数为10%胎牛血清的DF12培养基终止消化。取鼠尾蛋白包被的6孔板，每个孔中接种1块背根神经节组织。该实验分为4组：空白对照组、PBS对照组、低剂量嗅鞘细胞培养上清组以及高剂量嗅鞘细胞培养上清组。空白对照组每日向各孔中加入2 mL DF12培养基，PBS对照组每日向各孔中加入2 mL PBS，低剂量嗅鞘细胞培养上清组每日向各孔中加入0.5 mL嗅鞘细胞培养上清及1.5 mL DF12培养基，高剂量嗅鞘细胞培养上清组每日向各孔加入2 mL嗅鞘细胞培养上清。培养3 d后，每组随机取6个背根神经节组织块，通过对背根神经节组织块进行β-tubulin-Ⅲ特异性免疫荧光染色，观察背根神经节轴突生长情况，并测量背根神经节组织块的5根最长神经轴突平均长度，计算背根神经节组织块的神经轴突总面积/组织块面积。

1.4.5  聚ε-己内酯导管的制备  将聚ε-己内酯颗粒(M_n=80 000)溶解在甲醇和氯仿(1∶5)的混合物中制成15%的聚ε-己内酯电纺丝溶液。将聚ε-己内酯电纺丝溶液装载在10 mL注射器中，并通过注射泵将流速控制在     5 mL/h。电纺系统的施加电压为12 kV，注射器针头与集电器之间的距离为20 cm。收集器是一根旋转的不锈钢棒，长约5 mm，直径1.5 mm，制成聚ε-己内酯导管备用。

1.4.6  嗅鞘细胞培养上清对坐骨神经损伤的修复作用  选用SD大鼠30只，腹腔内注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉，切开左后肢的皮肤和钝性分裂下面的组织，小心地暴露出左侧坐骨神经。取出一段坐骨神经后留下5 mm的缺损，制成大鼠坐骨神经缺损模型。将制备好的大鼠模型随机分为3组：空白对照组应用空聚ε-己内酯导管桥接，导管内填充生理盐水，之后每日经腹腔注射5 mL生理盐水；自体神经移植组将切取下的5 mm坐骨神经翻转后，应用10-0尼龙缝合线行神经外膜缝合，每日腹腔注射5 mL生理盐水；嗅鞘细胞培养上清液组(实验组)采用空聚ε-己内酯导管桥接，导管内填充10 μL嗅鞘细胞培养上清，之后每日经腹腔注射  5 mL嗅鞘细胞培养上清。饲养4周后取坐骨神经组织进行免疫荧光检测及透射电镜观察。

1.4.7  免疫荧光观察大鼠坐骨神经轴突生长情况  取处理侧坐骨神经，石蜡包埋后进行纵切，厚度为14 μm。将坐骨神经切片在PBS中浸泡5 min，室温下在含有0.2% Triton X-100和体积分数为10%正常山羊血清的封闭溶液中孵育1 h，然后将坐骨神经切片用鼠抗NF160单克隆抗体(1∶200)孵育过夜；在室温下复温1 h后，将切片用PBS冲洗3次，每次5 min，并用山羊抗鼠FITC(1∶200)在37 ℃下孵育1 h，PBS冲洗切片3次，盖上方盖玻片，通过共聚焦显微镜收集免疫荧光染色结果。

1.4.8  透射电子显微镜观察坐骨神经轴突髓鞘化程度  将各组坐骨神经浸泡在固定液环境下取材(组织体积     1 mm×1 mm×2 mm)；加入4%戊二醛固定24 h，PBS漂洗3遍，每次15 min；再用1%锇酸固定2 h，双蒸水洗3遍，每次15 min；分别用体积分数为50%，70%，90%，100%乙醇(2次)，100%乙醇∶纯丙酮=1∶1，纯丙酮(2次)脱水，每次5-8 min；将材料依次放入纯丙酮∶812树脂(1∶1)  40 min、纯丙酮∶812树脂(1∶3)2 h，纯812树脂5 h或过夜进行渗透；分别将812树脂、材料放入包埋板内，材料放入包埋块切片顶端；将包埋板放入恒温干燥箱37 ℃   4 h、45 ℃ 6 h、60 ℃ 12 h进行聚合；将组织块修成梯形，制作超薄切片(1.0-2.0 μm)，并在此基础上选定区域对材料再次细致修整，进行超薄切片50-100 nm；然后对超薄切片用醋酸双氧铀染色30 min，柠檬酸铅染色10 min；最后，透视电镜观察再生轴突的髓鞘厚度。

1.5  主要观察指标  ①嗅鞘细胞的鉴定及纯度；②背根神经节组织块的5根最长神经轴突平均长度；③背根神经节组织块的神经轴突总面积/组织块面积；④大鼠坐骨神经缺损区域轴突生长情况；⑤大鼠坐骨神经损伤后再生轴突数量；⑥大鼠坐骨神经损伤后再生轴突的髓鞘厚度。

1.6  统计学分析  所有数据均用x(_)±s表示。采用SPSS 24.0软件包，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

大量研究证实，嗅鞘细胞移植作为一种有效方法应用于中枢及外周神经损伤的修复，得到了良好的神经修复效果^[10-11]。研究发现，嗅鞘细胞促进神经再生以及功能恢复的机制是多方面的，包括分泌多种神经营养因子和细胞外基质成分，如脑源性神经营养因子、神经生长因子、胶质神经营养因子^[29-30]、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和基质金属蛋白酶2等^[31-32]，此外可能机制还包括神经胶质细胞反应^[33-34]、抗炎症作用和促血管生成特性等^[35-36]。但是细胞移植后，面临局部微环境的改变以及可能的免疫反应，致使细胞活性差、存活率低；同时细胞来源也是限制嗅鞘细胞移植应用的难题。

2004年CHUNG等^[37]设计了一种特殊培养装置，能够区别观察嗅鞘细胞与神经轴突之间的直接和间接作用。该装置使用一种微孔结构(1 μm直径，可渗透小分子而非细胞)，使嗅鞘细胞无法直接接触受损神经元。结果发现，隔断嗅鞘细胞与神经轴突之间的直接接触并未能完全阻断其促神经再生作用，说明嗅鞘细胞的促神经修复作用并不完全依赖于细胞之间的直接接触，可能通过分泌的可溶性因子或纳米级细胞外物质而实现；进一步将处理后的嗅鞘细胞培养上清通过腹腔注射途径给予脊髓损伤模型大鼠，结果发现嗅鞘细胞培养上清促进了脊髓损伤大鼠神经轴突再生和运动功能恢复^[19]。基于嗅鞘细胞在神经损伤后修复特性，嗅鞘细胞培养上清在周围神经损伤领域尚无相关研究，该研究旨在通过体外和体内实验探究嗅鞘细胞培养上清对周围神经损伤后神经再生以及功能恢复的作用。

体外实验中，高剂量的嗅鞘细胞培养上清能够有效促进背根神经节组织块中神经轴突的生长，最长神经轴突平均值以及神经轴突总面积/组织块面积均显著高于低剂量的嗅鞘细胞上清组、PBS对照组和空白对照组。因此，在体外环境下嗅鞘细胞上清能够有效促进外周神经轴突的生长，并且这种促进作用依赖于足够的嗅鞘细胞培养上清剂量。体内实验中，嗅鞘细胞上清处理组NF160标记的再生轴突已经贯通了神经缺损，在神经缺损的近端、中部、远端均有大量再生神经轴突的分布；但是空白对照组损伤部位的中部以及远端几乎没有再生神经轴突；进一步的超微结构观察发现：嗅鞘细胞上清处理组再生轴突数量明显优于空白对照组，证实嗅鞘细胞上清可促进周围神经损伤后的轴突再生，说明了嗅鞘细胞上清能够促进神经的再生修复。

更重要的是，该研究发现嗅鞘细胞上清不仅能够直接促进损伤坐骨神经轴突的再生，并且能够提高再生神经的髓鞘化程度，从而进一步促进轴突再生。髓鞘是周围神经系统动作电位跳跃传导和轴突完整性的结构基础，外周神经损伤会造成神经脱髓鞘改变，导致运动功能障碍^[38]。众所周知，许旺细胞在损伤周围神经的修复和功能恢复中发挥多重作用，通过支持轴突再生和伸长，分泌各种可溶性因子促进再生轴突的髓鞘形成，加速受损外周神经的再生和功能恢复^[39-40]。虽然嗅鞘细胞的很多促神经修复特性与许旺细胞相似，但是在嗅神经系统内嗅鞘细胞通常并不形成髓鞘。该研究结果发现，嗅鞘细胞培养上清同样可以促进再生轴突髓鞘化，这也进一步证实了嗅鞘细胞在合适的周围神经系统环境下能够展现其成髓鞘特性的观点^[10]。有研究证实少突胶质细胞所分泌的细胞外囊泡内含有髓鞘相关蛋白^[41]，进而通过细胞外囊泡促进了髓鞘的形成；因此，作者推测嗅鞘细胞上清促进再生轴突髓鞘化可能是嗅鞘细胞直接分泌成髓鞘相关蛋白，具体的促进成髓鞘的分子机制还有待于进一步研究。在未来的研究中将进一步优化相关参数，同时通过蛋白组学、高通量RNA测序等手段，探究和阐明嗅鞘细胞中具体成分的分子作用机制。

在该研究中发现了局部腹腔注射嗅鞘细胞培养上清能够有效促进大鼠外周神经损伤后的神经修复以及再生神经的髓鞘化。这种不基于细胞移植的治疗方法，在留存了嗅鞘细胞促进神经修复的有效成分的基础上，避免了细胞移植后存活率低以及潜在免疫排斥等问题，为周围神经损伤提供了一种新的基于嗅鞘细胞的无细胞疗法。

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文题释义：

细胞培养上清：细胞在正常生理过程中会释放一些信息物质，包括可溶性因子、细胞外囊泡、蛋白质、各种RNA等，这些物质能够在细胞间通讯，乃至在多种生理过程中发挥重要作用。在细胞培养过程中，这些物质由细胞分泌至细胞培养液中。这种含有细胞分泌的活性物质并去除了细胞碎片等杂质的培养液，称为细胞培养上清。

神经再生：损伤后的神经再生是一个复杂的生理过程，受多种因素的影响和调节。神经再生过程可归纳为3个方面：受损神经近端轴突的萌芽和伸长，再生轴突的髓鞘化，再生轴突与靶器官之间突触连接的重建。神经再生分为中枢神经再生及周围神经再生。受轴突外部再生微环境的影响，中枢神经再生较外周神经再生更为困难。

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该实验结合嗅鞘细胞的促神经修复能力以及嗅鞘细胞移植的缺陷，探究了嗅鞘细胞培养上清促进周围神经修复再生的可能性。文章首先从研究体外条件下嗅鞘细胞上清对背根神经节组织块轴突生长入手，相继研究了嗅鞘细胞上清促进大鼠坐骨神经缺损的轴突再生以及再生轴突的髓鞘化情况。结果表明，嗅鞘细胞上清能够有效促进神经的生长以及再生，提升大鼠坐骨神经损伤后的修复效果；有效避免了嗅鞘细胞移植后细胞活性下降以及存活率低等缺陷。为下一步深入探究嗅鞘细胞上清中有效促神经修复的具体分子和相关通路提供了基础及思路。

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