电活性聚苯胺/聚乳酸支架的制备及生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0755

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (22): 3557-3562.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0755

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电活性聚苯胺/聚乳酸支架的制备及生物相容性

王玲玲，崔志明，徐冠华，李卫东，保国锋，孙郁雨，陈佳佳，张金龙

南通大学第二附属医院脊柱外科，江苏省南通市 226001

收稿日期:2017-12-12 出版日期:2018-08-08 发布日期:2018-08-08
通讯作者: 徐冠华，博士，副主任医师，南通大学第二附属医院脊柱外科，江苏省南通市 226001
作者简介:王玲玲，女，1983年生，江苏省淮安市人，汉族，主治医师，主要从事脊柱外科的临床和基础研究。
基金资助:
江苏省卫生科研项目(Z201316)；江苏省六大人才高峰第十批次高层次人才资助项目(2013-WSW-007)；江苏省中医药管理局科技项目(LB13020)；南通市重大科技计划项目(HS2014002)

Preparation and biocompatibility of an electroactive polyaniline/poly(lactic-acid) scaffold

Wang Ling-ling, Cui Zhi-ming, Xu Guan-hua, Li Wei-dong, Bao Guo-feng, Sun Yu-yu, Chen Jia-jia, Zhang Jin-long

Department of Spinal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Received:2017-12-12 Online:2018-08-08 Published:2018-08-08
Contact: Xu Guan-hua, M.D., Associate chief physician, Department of Spinal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
About author:Wang Ling-ling, Attending physician, Department of Spinal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
Supported by:
Health Research Project of Jiangsu Province, No. Z201316; the 10^th Batch High-Level Talent Project in Jiangsu Province, No. 2013-WSW-007; the Science and Technology Project of Jiangsu Provincial Traditional Chinese Medicine Administration, No. LB13020; the Major Science and Technology Project of Nantong Municipality, No. HS2014002

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

聚苯胺：一种高分子化合物，具有特殊的电学、光学性质，经掺杂后可具有导电性及电化学性能；聚苯胺的聚掺杂和脱掺杂完全可逆，掺杂度受pH值和电位等因素的影响，并表现为外观颜色的相应变化；聚苯胺因其具有的原料易得、合成工艺简单、化学及环境稳定性好等特点而得到了广泛研究和应用。

聚乳酸：是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，也称为聚丙交酯，属于聚酯家族，具有无毒性、生物相容性好、在体内可完全降解吸收及具有良好的抗拉强度和延展度等优点，但不足之处是材料力学强度较低，降解产物呈酸性而易引起体内无痛炎症反应，因此常与其他材料复合应用。

背景：有研究证实在电刺激条件下，聚苯胺/聚乳酸复合支架可促进神经干细胞突起的生长。

目的：制备电活性聚苯胺/聚乳酸支架，观察其与大鼠嗅鞘细胞的生物相容性。

方法：采用乳液聚合的方法制备聚苯胺/聚乳酸膜，电镜下观察其形态，测定其电导率。将SD乳鼠嗅鞘细胞分别接种于聚苯胺/聚乳酸膜上(实验组)与多聚赖氨酸包被的玻片上(对照组)，进行细胞增殖、细胞黏附率测定及免疫荧光抗体标记观察。

结果与结论：①扫描电镜下，聚苯胺/聚乳酸膜表面平整、均匀，可见为细小纤维形成的网格状结构，其电导率为1.5×10^-5 S/cm；②培养1，3，5，7 d，实验组的细胞相对增殖率均在90%以上，细胞毒性为Ⅰ级； ③培养7 d后，实验组细胞吸附率高于对照组(P < 0.05)；④培养7 d后免疫荧光检测显示，对照组S-100阳性细胞的数量及胞体面积与实验组无明显性差异(P > 0.05)，对照组S-100阳性细胞周长明显小于实验组(P < 0.05)；⑤结果表明，制备的聚苯胺/聚乳酸膜与嗅鞘细胞具有良好的生物相容性。

ORCID: 0000-0001-9629-1751(王玲玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 神经材料, 导电生物材料, 聚苯胺, 聚乳酸, 嗅鞘细胞, 生物相容性, 共培养, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed that polyaniline/poly(lactic-acid) scaffold could promote the growth of neural stem cell processes in the condition of electrical stimulation.

OBJECTIVE: To prepare an electroactive polyaniline/poly(lactic-acid) scaffold and to investigate its biocompatibility with rat olfactory ensheathing cells.

METHODS: Olfactory ensheathing cells of Sprague-Dawley neonatal rats were inoculated onto the polyaniline/poly(lactic acid) film (experimental group) and poly lysine coating slides (control group). Cell proliferation and cell adhesion rate were detected, and the cells were observed with immunofluorescence histochemistry.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Smooth and even polyaniline/poly(lactic acid) film was visible under electron microscopy, with a grid structure formed by fine fibers, and its conductivity was 1.5×10^-5 S/cm. (2) At 1, 3, 5, 7 days after co-culture, the cell relative growth rates were all above 90%, and the cytotoxicity was graded I. (3) At 7 days after co-culture, the cell adhesion rate in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). (4) At 7 days after co-culture, immunofluorescence results showed that there was no obvious difference between the two groups in the number or area of S-100 positive cells (P > 0.05), while the cell perimeter in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). To conclude, the prepared polyaniline/poly(lactic acid) film has good biocompatibility with olfactory ensheathing cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Spinal Cord Injuries, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王玲玲，崔志明，徐冠华，李卫东，保国锋，孙郁雨，陈佳佳，张金龙. 电活性聚苯胺/聚乳酸支架的制备及生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(22): 3557-3562.

Wang Ling-ling, Cui Zhi-ming, Xu Guan-hua, Li Wei-dong, Bao Guo-feng, Sun Yu-yu, Chen Jia-jia, Zhang Jin-long. Preparation and biocompatibility of an electroactive polyaniline/poly(lactic-acid) scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(22): 3557-3562.

图/表（结果） 7

2.1 聚苯胺/聚乳酸膜的形态观察图1为合成的导电支架在扫描电镜下的形态图，在低倍镜下，聚苯胺/聚乳酸膜表面平整、均匀，放大后可见为细小纤维形成的网格状结构。

2.2 聚苯胺/聚乳酸膜的红外光谱 1 577 cm^-1和 1 499 cm^-1为聚苯胺结构中的苯环的骨架伸缩振动峰； 1 091 cm^-1为-CH₃的伸缩振动峰；3 262 cm^-1为聚苯胺结构中的-NH₂伸缩振动峰；1 756 cm^-1为聚乳酸结构中的羰基的伸缩振动峰，见图2所示。

2.3 聚苯胺/聚乳酸膜的紫外光谱将聚苯胺/聚乳酸膜溶解于乙醇溶液中，再加入微量的固体过硫酸铵，复合膜逐渐被氧化，变为蓝色后又变成紫红色，其紫外光谱如图3所示。其中在290 nm出现的紫外吸收峰与苯胺结构中的苯环的∏-∏*跃迁有关；在390 nm处出现一个吸收峰，与从苯环到醌环的激子跃迁有关，随着氧化程度的增加，这个吸收峰的强度逐渐增加，达到最大后峰位蓝移。

2.4 聚苯胺/聚乳酸膜的电导率测量结果用循环伏安法测定聚苯胺/聚乳酸膜的电导率为1.5×10^-5 S/cm。生物电为微电流，生物组织或器官的电压一般低于150 mV，同时电流的变化电流的变化范围在0.6-400 μA之间。应用于神经修复的平均电压为100 mV，当100 mV电压加到聚苯胺/聚乳酸材料上时，将产生1-100 μA的电流，符合生物电的电流要求。因此，合成的聚苯胺/聚乳酸电导率能满足刺激神经生长的需要。

2.5 嗅鞘细胞增殖检测结果嗅鞘细胞与聚苯胺/聚乳酸膜共培养不同时间点的吸光度A值见表1，在各时间点实验组的细胞相对增殖率均大于90%，第7天时细胞相对增殖率为93%，显示聚苯胺/聚乳酸膜对嗅鞘细胞的毒性较低，为Ⅰ级。

2.6 嗅鞘细胞吸附率测定结果两组的细胞吸附率见表2，其中实验组细胞吸附率为38.7%，对照组细胞吸附率为19.1%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，提示与对照组相比，聚苯胺/聚乳酸膜能明显增加细胞的吸附率。

2.7 嗅鞘细胞免疫荧光检测结果两组细胞镜下形态不规则，有长短不一的突起，其中对照组S-100阳性细胞较大，突起较短(图4A)；实验组S-100阳性细胞相对较小，突起长，分枝较多(图4B)。两组细胞的数量、胞体面积和周长(包括突起)比较结果显示(表3)，对照组S-100阳性细胞的数量及胞体面积与实验组无明显差异(P > 0.05)，S-100阳性细胞周长明显小于实验组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年11月至2017年8月在南通大学神经生物学研究所完成。

1.3 材料

实验动物：出生1-3 d 的SD大鼠，由南通大学实验动物中心提供，动物生产许可证：SCXK(苏2008-0010)，动物使用许可证：SYXK(苏2002-0022)。

材料、试剂和仪器：苯胺、过硫酸铵均为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)；聚乳酸(济南岱罡生物科技有限公司)；DMEM/F12、胎牛血清(美国Gibro公司)；MTT溶液(美国Amresco公司)；Anti-S-100-protein抗体(美国Chemicon公司)；酶标仪(美国宝特ELX800)；Zeiss Ultra Plus型扫描电镜(德国蔡司公司)；荧光显微镜(德国Leica)；Avatar 360FT-IR红外光谱仪(美国Nicolet公司)；UV-3600型紫外光谱仪(日本岛津公司)；chi660B电化学分析仪(上海辰华仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 聚苯胺/聚乳酸膜的制备在60 mL的氯仿溶剂中加入1 g聚乳酸，将溶液置于恒温水浴锅中搅拌，使聚乳酸充分溶解，制成聚乳酸溶液。在溶液中依次加入0.18 g苯胺、0.1 g十二烷基磺酸钠(乳化剂)及15 mL水后，充分搅拌均匀。再将氧化剂(0.65 g过硫酸铵溶入15 mL水)滴入到原先混合溶液中并搅拌，使其中的苯胺单体发生氧化聚合。充分反应后，溶液逐渐成为墨绿色乳浊液，将该乳液用玻棒卷绕成膜，并先后用蒸馏水和乙醇冲洗后真空干燥，即得到掺杂态的聚苯胺/聚乳酸膜。

1.4.2 聚苯胺/聚乳酸膜的微观结构观察及表征采用扫描电子显微镜观察材料微观形貌；采用红外光谱仪测定合成聚合物的结构；采用紫外光谱仪器测定聚合物的化学氧化过程；采用电化学分析仪用循环伏安法测定聚合物的电导率。

1.4.3 嗅鞘细胞的原代培养及纯化取出生1-3 d的SD大鼠，腹腔麻醉后断头，分离嗅球并置于DMEM/F12基础培养液中。将嗅球剪成小块后，加入0.125%胰酶消化20 min，反复吹打至悬液呈乳白色，用体积分数10%胎牛血清中止消化。悬液用筛网滤过后以1 000 r/min离心10 min，加入培养液并吹打均匀。再次离心后加入体积分数10%胎牛血清，吹打制成单细胞悬液。计数后以细胞浓度1×10⁹ L^-1接种于培养瓶，置于体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中，18 h后取出，将瓶中未贴壁细胞转种于另一培养瓶。继续培养36 h，将未贴壁细胞吸至离心管后离心，加入阿糖胞苷和体积分数10%胎牛血清后培养48 h，用DMEM/F12培养基冲洗贴壁细胞并吸至离心管，离心后再次加入体积分数10%胎牛血清，吹打均匀后得到纯化的嗅鞘细胞悬液。采用S-100、NGFRp75特异性抗体作免疫荧光染色鉴定为嗅鞘细胞。

1.4.4 聚苯胺/聚乳酸膜与嗅鞘细胞的共同培养接种细胞前聚苯胺/聚乳酸膜用体积分数70%乙醇灭菌，无菌生理盐水反复清洗后紫外灯照射20 min。将细胞浓度为1×10⁹ L^-1的纯化嗅鞘细胞悬液接种于聚苯胺/聚乳酸膜上做为实验组，而将嗅鞘细胞接种于多聚赖氨酸包被的玻片上作为对照组。两组分别置于培养板中，于体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中培养，每3 d半量换液。

1.5 主要观察指标

嗅鞘细胞在聚苯胺/聚乳酸膜上的增殖：于培养的第1，3，5，7天后分别取出培养板，各取6片，加入5 g/L MTT溶液后，于37 ℃孵育4 h，加入二甲基亚砜，室温下震荡使结晶溶解，酶标仪于570 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，取平均值后计算细胞相对增殖率：细胞相对增殖率=实验组A值/对照组A值×100%，细胞相对增殖率值越大材料毒性越小。细胞相对增殖率100%及以上，细胞毒性为0级；细胞相对增殖率75%-99%，为Ⅰ级，细胞相对增殖率50%-74%，细胞毒性为Ⅱ级；细胞相对增殖率25%-49%，细胞毒性为Ⅲ级；细胞相对增殖率1%-24%，细胞毒性为Ⅳ级；细胞相对增殖率0%，细胞毒性为Ⅴ级。

细胞吸附率测定：培养7 d 后，分别取出各孔内玻片，2.5 g/L胰酶消化后反复冲洗，离心收集细胞并计数，记为吸附细胞数，各玻片对应孔分别进行消化并收集剩余细胞、计数记为游离细胞数。材料的细胞吸附率=吸附细胞数/(吸附细胞数+游离细胞数)×100%。

免疫荧光抗体标记：培养第7天时两组各取12片，40 g/L多聚甲醛固定30 min后，分别加入小鼠抗大鼠S-100抗体100 mL(1∶200)，4 ℃冰箱内孵育过夜。次日晨吸去一抗，PBS清洗3遍后加入Alexa fluor® 568 100 μL(1∶500)，避光室温下孵育2 h，相同PBS清洗后封固。最后经PBS洗片后，常规脱水、透明、封固，在吸收光波长为495 nm、激发光波长为596 nm的荧光显微镜下观察并摄片。将荧光显微镜(放大400倍)下拍摄的照片导入图像处理系统，对S-100阳性细胞作形态学观察。应用捷达801系列形态学分析软件，计取每视野内S-100阳性细胞数，并通过图像处理系统得到相应照片中阳性细胞的面积和周长(包括突起)。

1.6 统计学分析实验计量资料以x(_)±s表示，使用SPSS 17.0统计软件进行两两比较(配对t 检验)，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

器官形成与组织修复表现为细胞的生长、迁移、分化和基质的分泌，而这些均与电信号有关，比如自身动作电势的产生标志着细胞的兴奋，表现为肌细胞的收缩、腺细胞的分泌和神经纤维的传导等。此外，相邻细胞之间存在直接的电信号传递，而胞内和胞间的电信号传导是影响细胞行为的重要因素^[10-11]。

脊髓损伤后的修复一直是医学界的难题，而原有电信号传导的中断是影响神经修复的主要原因之一^[12-13]。组织工程修复脊髓损伤的基本原理是将载有种子细胞的支架移植于脊髓损伤区，以促进神经再生和功能恢复^[14-17]。用导电材料来制备支架的优势在于能够使神经恢复电传导性，从而促进神经再生。有研究表明，导电材料被施加电刺激时，可在短时间内增加纤连蛋白的吸收和强化轴突的生长^[18]。另有研究发现，具有电活性的材料能够通过被施加适当的电刺激来控制细胞的生长、增殖及相互作用，并能促进材料的蛋白质吸附，而细胞的行为都是通过被吸附的蛋白质层进行的，蛋白质的吸附在材料-细胞和材料-组织间相互作用中起着关键作用^[19]。此外，通过导电材料施加的电刺激可以集中于材料的周围区域，而不会像使用外源电磁场刺激那样难以定位，从而有利于对加载的刺激进行空间调控^[20]。

目前，导电高分子材料在生物医学方面的应用得到了广泛关注，并被尝试用于神经、心肌及其他组织器官的修复^[21-23]。常用的导电材料包括了聚吡咯、聚噻吩和聚苯胺。有研究证明，聚苯胺及它的衍生物可以使H9c2心脏成肌细胞和PC12细胞在其上良好的黏附、生长和分化^[24-25]。聚吡咯也被证明在电刺激作用下，能够增强神经生长因子对PC12细胞促分化作用^[26]，同时还被证实在电刺激时可以促进材料表面成骨细胞的黏附和增殖^[27]。

聚苯胺作为一种结构型导电高分子材料，具有良好的热稳定性和氧化还原性质，在各个领域得到广泛应用，一直是研究的热点^[28-30]。聚苯胺的优点在于：①分子结构的多样化：聚苯胺不同的氧化还原状态对应着不同的分子结构，材料的导电情况也随之变化；②良好的导电性和稳定性：本征态的聚苯胺电导率很低，但通过质子酸掺杂后，其电导率可以得到显著提高，并且耐热性能良好；③掺杂的可逆性：通常的导电材料掺杂过程中发生的氧化还原反应是不可逆转，并伴有电子的得失，但聚苯胺是通过质子酸掺杂的，掺杂时发生内部氧化，但其电子数目没有改变，而且可以通过氨水的反掺杂实现可逆变化^[31]；④良好的生物相容性：Kamalesh等^[32]将聚苯胺膜植入SD大鼠背侧皮下，观察19-90周，结果显示整个移植期未有明显的排斥反应，移植区未发现炎症反应，证实聚苯胺具有良好的生物相容性。

聚乳酸是具有良好的生物相容性和可降解性的高分子材料，且易被加工成型，常被用于与其他材料制成复合支架^[33]。有学者将聚乳酸和聚苯胺制成复合支架，并发现电刺激能够促进支架上的神经干细胞突起的生长^[34]，也有研究发现聚苯胺-明胶-聚乳酸复合支架与前成骨细胞有良好的生物相容性^[35]。

在此次研究中，以乳液聚合的方法合成聚苯胺/聚乳酸电活性复合物，通过表征分析证明复合物聚合成功，并有一定的导电率。体外复合细胞培养法可以直接观察细胞在生物材料上的生长情况，而通过测定培养后细胞的数目、面积和周长可以直观地评价细胞存活和生长情况，较为客观^[36]。多聚赖氨酸是得到公认的良好细胞载体，因此选择多聚赖氨酸与嗅鞘细胞共同培养作为对照组。在实验中将嗅鞘细胞与聚苯胺/聚乳酸膜混合培养，结果表明嗅鞘细胞能够在上存活和增殖，且能明显增加细胞的黏附率，而生长于聚苯胺/聚乳酸膜上的细胞与多聚赖氨酸组相比在细胞数量、面积无明显统计学差异，而细胞周长明显增加，与聚苯胺/聚乳酸膜上细胞的突起相对较长有关，说明聚苯胺/聚乳酸膜支架的环境有利于嗅鞘细胞的存活与生长。

因此，作者认为聚苯胺/聚乳酸膜复合物与嗅鞘细胞有着良好的生物相容性。当然，为进一步了解的聚苯胺/聚乳酸复合物生物电活性及其对细胞行为的影响，有必要通过体外实验观察不同电刺激下细胞在复合物表面所表现的黏附、生长、迁移、分化和基质分泌等细胞行为的改变，从而为嗅鞘细胞与聚苯胺/聚乳酸复合支架联合移植修复脊髓损伤提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

电活性聚苯胺/聚乳酸支架的制备及生物相容性

Preparation and biocompatibility of an electroactive polyaniline/poly(lactic-acid) scaffold

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