重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.018

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
嗅鞘细胞：是目前所知惟一能够诱导支持周围神经长入中枢神经的胶质细胞，移植入脊髓后不但能诱导神经再生，还能促进损伤脊髓的功能恢复。嗅鞘细胞主要位于嗅神经纤维和嗅球外层，为嗅觉系统中主要的非神经元细胞，与大多数神经元不同的是嗅神经元在机体内，终生保持不断更新再生的能力。
经颅磁刺激：是磁刺激所产生的磁场在脑内诱发出局部的感应电流促使神经细胞去极化，从而起到神经刺激和神经调节作用的一种技术。重复的经颅磁刺激可以调节皮质的兴奋性，称为重复经颅磁刺激。不同的刺激参数，决定重复经颅磁刺激对大脑皮质的兴奋性是增强还是抑制，这种增强或抑制效应在序列刺激结束后仍可存在一段时间，因此重复经颅磁刺激在对机体行为的改善和治疗上具备相应的潜能。重复经颅磁刺激因其具有无创、无痛、不良反应发生率低以及较易对颅脑深部进行刺激等优点而被广泛应用于临床。

摘要
背景：传统观念认为哺乳动物的脑和脊髓损伤后不能再生，脊髓损伤后功能恢复的预后希望很渺茫。
目的：分析经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的修复效果。
方法：对80只大鼠进行脊髓损伤模型制备，随机等分成4组，胸髓横断损伤组、嗅鞘细胞移植组、重复经颅磁刺激组及联合组。各组大鼠行T₁₀全椎板切除建立胸髓横断损伤动物模型，造模24 h后，嗅鞘细胞移植组和联合组大鼠在损伤区附近注射嗅鞘细胞，重复经颅磁刺激组及联合组大鼠于左前囟上方接受重复经颅磁刺激治疗。
结果与结论：移植4周后，与其他3组相比，重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植组大鼠运动功能恢复明显，运动功能BBB评分升高，坐骨神经电生理功能明显恢复，损伤脊髓修复较好。提示重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤可以获得显著疗效，两者联合应用可明显促进脊髓损伤后的轴突再生及功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2351-777X(姜泳)

关键词: 干细胞, 移植, 嗅鞘细胞, 重复经颅磁刺激, 脊髓损伤, BBB评分, 神经电生理学检查, 苏木精-伊红染色, 嗜银染色, 神经丝蛋白, 免疫组化染色

Abstract:

BACKGROUND: Conventional wisdom suggests that the mammalian brain and spinal cord cannot be regenerated after injury and the hope for functional recovery is slim after spinal cord injury.
OBJECTIVE: To test and analyze the therapeutic effect of olfactory ensheathing cell transplantation combined with repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in spinal cord injury rats.
METHODS: Eighty rats were used to make spinal cord injury models by T₁₀ laminectomy and then rat models were equivalently randomized into model, cell transplantation, rTMS, and combined treatment groups. Twenty-four hours after modeling, rats in the latter three groups were given olfactory ensheathing cell transplantation around the injured region, rTMS above the left anterior bregma, or their combination, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks following transplantation, the motor function of rats in the combined treatment group was significantly improved, accompanied by increased Basso, Beattie and Bresnahan score and significantly improved sciatic nerve electrophysiological function. These findings indicate that the olfactory ensheathing cell transplantation combined with rTMS treatment achieves remarkable outcomes, and the combined treatment can significantly improve the axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Spinal Cord Injuries, Transcranial Magnetic Stimulation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

姜泳，迟晓飞，邹喜军，慈元，姚琦，杨茂伟. 重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 98-102.

Jiang Yong, Chi Xiao-fei, Zou Xi-jun, Ci Yuan, Yao Qi, Yang Mao-wei. Combination of olfactory ensheathing cell transplantation and repetitive transcranial magnetic stimulation for the treatment of spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 98-102.

图/表（结果） 1

2.1 嗅鞘细胞的形态 培养7 d时双极细胞为主，细胞密度增加，胞体较亮，突起变长，细胞主要呈双极、三极，胞体立体感强，折光性好，背景清楚，细胞团聚状生长(图1A)，至14 d时，细胞更加密集，双极、三极细胞的胞体折光度稍有降低。胞体变得大小不一，细胞胞体突起可呈现平行排列(图1B)。

2.2 嗅鞘细胞的鉴定 纯化培养10 d时，免疫荧光染色结果表明，培养板内双极和三极细胞呈p75阳性(图2)，证实为嗅鞘细胞，细胞纯度分别94.3%。

2.3 实验动物数量分析 有3只大鼠术中死亡，其余大鼠在术后2 h完全清醒，2只前肢可爬行，均出现典型的截瘫综合征，术后1周内大鼠活动减少，饮食少、常常伴有腹部胀气、大便困难伴硬结、尿潴留、肌张力低、肌力0级、双后肢拖行，4周后逐渐开始恢复排便排尿。整个实验过程中各种原因(如麻醉意外、感染、衰竭等)死亡的大鼠共7只，死亡率19%，其中术中死亡3只(8%)，术后死亡4只(11%)；发生脑脊液漏3只(8%)；发生感染3只(8%)；发生血尿1只(3%)；发生尿潴留3只(8%)；发生下肢溃疡3只(8%)。补充大鼠至每组20只。

2.4 运动功能 造模后2周，4组大鼠后肢均没有任何运动功能，BBB评分为0分；4周后4组大鼠BBB评分较2周时增高(P < 0.01)，且联合组大鼠BBB评分高于其余3组(P < 0.01)，而嗅鞘细胞移植组和重复经颅磁刺激组大鼠BBB评分接近(P > 0.05；表1)，提示重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植可明显促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复。

2.5 神经电生理学检查结果 随着时间的延长，4组大鼠坐骨神经运动诱发电位的峰-峰值增加，且潜伏期缩短；且联合组大鼠运动诱发电位峰-峰值和潜伏期更为显著(P < 0.01；表2，3)。

2.6 脊髓病理形态

2.6.1 苏木精-伊红染色 重复经颅磁刺激组和联合组大鼠脊髓损伤区域细胞走行方向较一致，且神经束明显增多，有神经束跨过损伤区域。胸髓横断损伤组和嗅鞘细胞移植组大鼠脊髓损伤区结构紊乱，纤维走行方向扭曲、不一致，且损伤区内细胞和纤维结构均较少，有许多大小不等的空洞。4组大鼠脊髓空洞和瘢痕面积差异有显著性意义(P < 0.01；表4)。

2.6.2 嗜银染色 重复经颅磁刺激组和联合组大鼠脊髓损伤区内再生神经纤维较多，排列相对整齐；而胸髓横断损伤、嗅鞘细胞移植组的损伤区内神经纤维较少，排列紊乱、扭曲。4组大鼠脊髓损伤区神经纤维线密度差异有显著性(P < 0.01；表4)。

2.6.3 免疫组化染色 重复经颅磁刺激组和联合组大鼠损伤脊髓组织中NF200平均灰度值高于胸髓横断损伤组和嗅鞘细胞移植组(P < 0.01)，重复经颅磁刺激组和联合组大鼠脊髓组织中神经纤维排列相对规律，而胸髓横断损伤组和嗅鞘细胞移植组神经纤维排列较乱。重复经颅磁刺激组和联合组大鼠脊髓损伤远端横切面上神经纤维数量明显多于胸髓横断损伤组和嗅鞘细胞移植组(P < 0.01；表4)。

参考文献

[1] 张骏,邵海宇,陈锦平.诱导多功能干细胞在脊髓损伤修复中的作用[J].中华骨科杂志,2010,30(2):213-215.

[2] Ban DX, Ning GZ, Feng SQ, et al. Combination of activated Schwann cells with bone mesenchymal stem cells: the best cell strategy for repair after spinal cord injury in rats. Regen Med. 2011;6(6):707-720.

[3] 李越,余化霖,陈莉发,等.嗅球成鞘细胞植入大鼠挫伤脊髓内的迁移分布特征[J].中华创伤杂志,2011,27(1):78-82.

[4] Li BC, Xu C, Zhang JY, et al. Differing Schwann cells and olfactory ensheathing cells behaviors, from interacting with astrocyte, produce similar improvements in contused rat spinal cord's motor function. J Mol Neurosci. 2012;48(1): 35-44.

[5] Xu X, Geremia N, Bao F, et al. Schwann cell coculture improves the therapeutic effect of bone marrow stromal cells on recovery in spinal cord-injured mice. Cell Transplant. 2011;20(7):1065-1086.

[6] Deverman BE, Patterson PH. Exogenous leukemia inhibitory factor stimulates oligodendrocyte progenitor cell proliferation and enhances hippocampal remyelination. J Neurosci. 2012; 32(6):2100-2109.

[7] Zonouzi M, Renzi M, Farrant M, et al. Bidirectional plasticity of calcium-permeable AMPA receptors in oligodendrocyte lineage cells. Nat Neurosci. 2011;14(11):1430-1438.

[8] Mekhail M, Almazan G, Tabrizian M. Oligodendrocyte- protection and remyelination post-spinal cord injuries: a review. Prog Neurobiol. 2012;96(3):322-339.

[9] Benito J, Kumru H, Murillo N, et al. Motor and gait improvement in patients with incomplete spinal cord injury induced by high-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation. Top Spinal Cord Inj Rehabil. 2012;18(2):106-112.

[10] Jetté F, Côté I, Meziane HB, et al. Effect of single-session repetitive transcranial magnetic stimulation applied over the hand versus leg motor area on pain after spinal cord injury. Neurorehabil Neural Repair. 2013;27(7):636-643.

[11] 杨浩,王春婷,程华玲,等.嗅神经鞘细胞的培养纯化及体外生长特性[J].细胞生物学杂志,2001,23(1):43-47.

[12] Ramón-Cueto A, Cordero MI, Santos-Benito FF, et al. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 2000;25(2):425-435.

[13] 张新,李建军,霍小林,等.重复经颅磁刺激对脊髓运动功能恢复的影响及其机制的实验研究[J].中国康复理论与实践,2008,14(3): 228-230.

[14] Massie CL, Tracy BL, Malcolm MP. Functional repetitive transcranial magnetic stimulation increases motor cortex excitability in survivors of stroke. Clin Neurophysiol. 2013; 124(2):371-378.

[15] Massie CL, Tracy BL, Paxton RJ, et al. Repeated sessions of functional repetitive transcranial magnetic stimulation increases motor cortex excitability and motor control in survivors of stroke. NeuroRehabilitation. 2013;33(2):185-193.

[16] Jung SH, Shin JE, Jeong YS, et al. Changes in motor cortical excitability induced by high-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation of different stimulation durations. Clin Neurophysiol. 2008;119(1):71-79.

[17] Sasaki N, Mizutani S, Kakuda W, et al. Comparison of the effects of high- and low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation on upper limb hemiparesis in the early phase of stroke. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2013;22(4):413-418.

[18] Di Lorenzo C, Tavernese E, Lepre C, et al. Influence of rTMS over the left primary motor cortex on initiation and performance of a simple movement executed with the contralateral arm in healthy volunteers. Exp Brain Res. 2013; 224(3):383-392.

[19] 叶超群.孙天胜,高尔镜,等.不同方法共移植的嗅鞘细胞和雪旺氏细胞在损伤脊髓内的迁移和对轴突再生的影响[J].中国脊柱脊髓杂志,2010,20(2):138-145.

[20] 袁普卫,贺西京,王国毓.嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后损伤区髓鞘相关轴突生长抑制因子受体表达的影响[J].中国骨伤,2011, 24(1): 51-54.

引言

传统观念认为脊髓损伤后神经不能再生，脊髓损伤后功能的恢复希望渺茫，所以，脊髓损伤的修复一直是临床治疗的一大难点^[1]。传统观点认为，发育成熟的哺乳动物脊髓损伤后，由于神经元自身的再生能力差和胶质微环境抑制作用，损伤的神经是不可再生的^[2]。嗅鞘细胞是目前所知惟一一种能够诱导周围神经长入中枢神经的胶质细胞，移植入脊髓后既能诱导神经再生，又能促进损伤脊髓的功能恢复^[3]。嗅鞘细胞主要位于嗅神经纤维和嗅球的外层，是嗅觉系统中主要的非神经元细胞，但与大多数的神经元细胞不同的是，嗅鞘细胞可以在机体内终生保持不断再生的能力^[4]。Xu等^[5]研究证实嗅鞘细胞可以越过不利于中枢神经系统轴突生长的瘢痕环境，向失神经支配的远端组织中生长。Deverman等^[6]研究表明嗅鞘细胞不但使轴突髓鞘化，同时提高了轴突的传导性。2011年Zonouzi等^[7]将嗅鞘细胞移植入脊髓横断的大鼠体内，所有大鼠在移植后3-7个月内恢复运动能力，而且后肢对轻微的皮肤接触及本体感觉刺激发生反应，实验还发现在损伤的脊髓尾端有较长的运动神经轴突再生。Mekhail等^[8]发现嗅鞘细胞能分泌多种神经营养因子，改变脊髓损伤损伤的局部微环境，有助于损伤轴突的伸长及生长。

重复经颅磁刺激是在经颅磁刺激的基础上发展起来的一种新的电生理技术，利用磁生电流无创地穿过颅骨达到刺激神经系统的作用，同时并不引起头皮的疼痛^[9]。根据设置参数的不同，重复经颅磁刺激可提高或降低大脑皮质的局部兴奋性、皮质代谢和颅脑血供，在精神疾病、癫痫、脑梗死、脊髓损伤等神经系统疾病的治疗方面具有巨大的潜在价值^[10]。脊髓损伤的自然恢复过程中可能存在大脑皮质抑制功能的降低，所以通过调节皮质抑制功能可能是促进脊髓损伤功能恢复，对大脑皮质给予某种刺激从而增加残存皮质脊髓束的驱动能力，会有助于脊髓损伤的功能恢复。作者创新性的将嗅鞘细胞移植和重复经颅磁刺激两项技术结合在一起修复脊髓损伤，并探讨其作用机制，为临床中脊髓损伤的修复提供一个新的思路和方法。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2016年6月在大连市骨科医院动物实验室及大连医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料 ①SPF级大鼠SD大鼠2只，鼠龄1周；②SPF级大鼠SD雄性大鼠80只，鼠龄2个月，体质量(350±20) g，系国家一级实验动物，由大连医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(辽)20013-0002。

1.4 方法

1.4.1 嗅鞘细胞的体外分离与培养 取1周龄的SD大鼠，处死后暴露嗅球，显微镜下剔除白质部分，将嗅黏膜组织在37 ℃、胶原酶Ⅰ(Sigma公司)溶液中孵化10 min，EDTA溶液终止其活性。将消化后的溶液注入带有100 μm筛网的离心管中，300×g离心5 min。弃掉上清液，将离心下来的细胞重新混悬在含体积分数10%胎牛血清(天津生物技术有限公司)和50 g/L庆大霉素(华美生物工程公司)的DMEM-F12培养液中，以50个/mm²密度接种在50 mg/L多聚赖氨酸(Sigma公司)处理过的培养瓶中，采用改良Nash法纯化培养细胞7 d后^[11]，胰蛋白酶(Sigma公司)分离细胞，离心，浓缩成约1×10¹¹ L^-¹细胞浓度备用。将细胞悬液进行免疫p75细胞化学染色，证实90%以上为嗅鞘细胞(计数300个细胞)。

1.4.2 胸髓横断损伤动物模型建立 将80只2个月龄SD雄性大鼠随机分为4组：胸髓横断损伤组、嗅鞘细胞移植组、重复经颅磁刺激组及联合组，各20只。

大鼠氯氨酮/安定腹腔麻醉后，俯卧位固定于手术台上，备皮、常规碘酒、乙醇消毒，铺无菌巾、单，背部正中切口，显露T₁₀行全椎板切除(必要时切除部分T₉及T₁₁部分椎板)，在要切除的T₁₀脊髓部位注射利多卡因，然后用尖刀将脊髓横断，用眼科剪刀深入前方触及椎体反复剪3次，并将远近断端分别提起，以确保脊髓完全横断。

1.4.3 嗅鞘细胞移植 造模24 h后，嗅鞘细胞移植组和联合组在大鼠脊髓远近断端距离挫伤区边缘1 mm的脊髓中线上，深度分别为1.5和0.5 mm处，注入5×10¹⁰ L^-¹细胞悬液各2 μL左右。两断端间注入5 μL细胞悬液^[12]，共9 μL。彻底止血后缝合硬膜及伤口。胸髓横断损伤组和重复经颅磁刺激组注射等量的DMEM培养液。

1.4.4 重复经颅磁刺激治疗 采用YRD CCY-I型磁刺激仪(武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司)，脉冲磁场峰值强度为3 T。造模24 h后，将清醒状态下的重复经颅磁刺激组和联合组大鼠置于固定器中，头部固定，圆形线圈(直径70 mm)磁场中心置于大鼠左前囟上方，应用90%静息运动阈值(造模前，测量大鼠的运动阈值，结果示运动阈值为最大脉冲强度的21%)。刺激频率5 Hz。每序列2 s，间歇28 s，共15 min。1次/d，每周5 d，连续治疗4周。

1.4.5 BBB评分 造模后第2，4，8，16周，将大鼠置于150 cm×100 cm场地上，根据后肢体位、活动方式、活动范围等做BBB 21分测试^[13]。其中没有运动功能为0分，完全正常为21分。

1.4.6 神经电生理学检查 造模后第2，4，8，16周，每组取2只大鼠，应用Powerlab诱发电位仪及BL-410生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)检测坐骨神经运动诱发电位。刺激参数：粗电压，强度3 V，波宽1 ms，频率10 Hz，增益20倍，滤波300 Hz，时间常数0.01 s，扫描速度6.25 ms/div。测量运动诱发电位的潜伏期和峰-峰值。

1.4.7 取材 造模后16周处死各组动物，打开胸腔，暴露心脏，自左心室插管至主动脉，固定插管，剪开右心房放出血液；予肝素钠生理盐水灌注心脏，冲净血管内血液至肝脏发白，以40 g/L多聚甲醛灌注固定后完整取出脊髓，再次固定6 h，置于20%蔗糖溶液中过夜沉底，最后行石蜡切片。

1.4.8 苏木精-伊红染色 取石蜡切片，常规苏木精-伊红染色，观察脊髓损伤区组织的大体结构和形态。计算机彩色图像分析系统(HPAIS-100；上海立光精密仪器有限公司)测量各组瘢痕和空洞的面积，每张切片测5个400倍视野，每个视野测量5次，结果取平均值。

1.4.9 嗜银染色(改良Bieischowsky法) 取石蜡切片，嗜银染色，计算机彩色图像分析系统(HPAIS-100)测量各组神经纤维的密度。

1.4.10 免疫组化染色 取石蜡切片，二甲苯脱蜡，抗原修复，行神经丝蛋白200(neurofilament 200，NF200)免疫组化染色，计算机彩色图像分析系统计算平均灰度值。

1.5 主要观察指标 ①脊髓损伤区组织结构和形态；②神经纤维密度；③NF200表达水平。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0软件行单因素方差分析。

讨论

重复经颅磁刺激就是通过刺激脊髓损伤患者的大脑皮质，产生兴奋效应，促使残余的下行皮质脊髓通路的开放，进而促进脊髓功能的恢复^[14-16]。Sasaki等^[17]研究表明重复经颅磁刺激可以促进大脑皮质局部血流量的增加，并促进颅脑细胞神经递质的表达，重复经颅磁刺激治疗脊髓损伤的生物学机制可能与促进5-羟色胺、生长相关蛋白43、多巴胺等神经递质的表达有关。Di Lorenzo等^[18]研究证实，重复经颅磁刺激刺激胸段脊髓损伤的大鼠，3个月后脊髓损伤的大鼠的下肢运动功能明显改善，损伤脊髓尾端5-羟色胺能神经纤维和生长相关蛋白43水平明显高于正常对照组。

BBB评分是一项针对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的评分标准，主要参照指标是后肢、尾部和下部躯干的活动范围及协调性^[19]。作者对各组大鼠行BBB评分检测结果显示，重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植可明显促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复。体感诱发电位是连续刺激感觉神经纤维在中枢神经系统任何部位诱发的综合电位活动，感觉诱发电位的变化可反映出脊髓传导功能受损的程度。运动诱发电位是指应用电或磁刺激皮层运动区，产生兴奋，通过下行传导径路，使脊髓前角细胞去极化，在相应外周神经或肌肉表面记录到的电位。运动诱发电位的出现与否可推断运动通路的存在与否，从而达到判断脊髓损伤预后的目的。实验中随着时间的延长，4组大鼠运动诱发电位的峰-峰值增加，且潜伏期缩短；且联合组大鼠峰-峰值增加和潜伏期缩短的速度和幅度都比嗅鞘细胞移植组和重复经颅磁刺激组明显，说明重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植对脊髓功能恢复比较显著。脊髓损伤后由于反应性胶质细胞增生导致的胶质瘫痕一直被视为脊髓轴突再生难以逾越的障碍。脊髓损伤区域形成的空洞和瘫痕范围的大小，反映了脊髓损伤的程度和预后^[20]。造模后16周，联合组的空洞和瘫痕面积均远远小于损伤其他3组，且神经纤维密度还是NF200免疫组化染色的神经元和神经纤维灰度检测结果均好于其他3组，说明联合组细胞移植后形成的微环境对脊髓损伤有明显的保护和修复作用，移植的细胞在宿主脊髓内存活，充填了损伤缺口，阻止了空洞和瘫痕形成，为损伤的轴突提供了适合的再生环境，能促进脊髓损伤受损神经组织的修复。

实验说明重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤可以获得显著疗效,两者联合应用可明显促进脊髓损伤后的轴突再生及功能恢复。