过表达缺氧诱导因子1α心肌干细胞能提高心肌梗死后心功能及移植细胞的存活率

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.019

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 103-109.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.019

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过表达缺氧诱导因子1α心肌干细胞能提高心肌梗死后心功能及移植细胞的存活率

李沙，李树仁，郝清卿

河北医科大学附属河北省人民医院心内一科，河北省石家庄市 050051

出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 李树仁，博士，教授，主任医师，硕士生导师，河北医科大学附属河北省人民医院心内一科，河北省石家庄市 050051
作者简介:李沙，女，1986年生，河北省邯郸县人，汉族，河北医科大学在读硕士，主要从事心血管病学方面的研究。
基金资助:
河北省自然科学基金项目(C2015307019)

Effects of hypoxia inducible factor 1alpha gene modified cardiac stem cell transplantation on cardiac function and survival rate of transplanted cells in rats with myocardial infarction

Li Sha, Li Shu-ren, Hao Qing-qing

Department of Cardiology, Hebei Provincial People’s Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Li Shu-ren, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Cardiology, Hebei Provincial People’s Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
About author:Li Sha, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, Hebei Provincial People’s Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. C2015307019

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。
缺氧诱导因子1α：是具有转录活性的核蛋白，具有广泛的靶基因谱，能够控制下游100多种基因的表达，包括血管内皮生长因子、葡萄糖转移酶1、酪氨酸激酶等，这些基因表达后参与血管生成，参与糖的代谢和细胞凋亡等过程，维持组织、细胞在缺氧条件下内环境的稳定。

摘要
背景：干细胞移植后最大的障碍是细胞在缺血、缺氧等恶劣环境下极低的存活率。为解决这一难题，人们尝试基因修饰的方法，即在细胞移植前将抗凋亡基因通过转染或转导的方式，使其基因结构发生改变，进而可能会从根源上解决干细胞的存活、代谢及增生或分化等能力。
目的：经缺氧诱导因子1α基因修饰的心肌干细胞移植入大鼠心肌梗死边缘区后，观察移植后心肌干细胞的存活率及大鼠心功能的变化。
方法：将24只SD大鼠随机等分为3组：缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组、心肌干细胞组和模型组，以开胸结扎冠脉的方法制备心肌梗死模型，2周后分别注射经Ad-HIF1α-eGFP转染的心肌干细胞、Ad-eGFP转染的心肌干细胞及PBS液。
结果与结论：心肌干细胞移植可提高心功能；经缺氧诱导因子1α基因修饰的心肌干细胞移植可较单纯心肌干细胞移植更显著改善心功能；梗死后左室射血分数的改善与梗死边缘区心肌干细胞密度呈正相关。说明过表达缺氧诱导因子1α的心肌干细胞能有效改善心肌梗死大鼠心功能及移植细胞的存活。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0031-2819(李树仁)

关键词: 干细胞, 移植, 缺氧诱导因子1α基因, 细胞培养, 流式细胞术, 心肌干细胞, 基因治疗, 心肌梗死, 免疫组织化学, 河北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The biggest obstacle after stem cell transplantation is the extremely low survival rate of transplanted cells in the severe environments such as ischemia and hypoxia. In order to solve this problem, gene modification is expected to fundamentally improve the survival, metabolism and proliferation/differentiation of stem cells, namely by anti-apoptotic gene transfection or transduction prior to transplantation to vary the gene structure.
OBJECTIVE: To observe the survival rate of transplanted cells and cardiac function in rats undergoing hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) gene modified cardiac stem cell transplantation into the edge area of myocardial infarction.
METHODS: Twenty-four Sprague-Dawley rats were used to make myocardial infarction models by ligation of coronary arteries and then randomized into HIF-1α-transfected cell transplantation group, cell transplantation group and model group (n=8 per group). Two weeks after modeling, model rats were given the injection of Ad-HIF1α-eGFP-transfected cardiac stem cells, Ad-eGFP-transfected cardiac stem cells or PBS, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Cardiac stem cell transplantation improved the rat cardiac function, and HIF-1α transfected cardiac stem cell transplantation showed better effects on cardiac function improvement than simple cell transplantation. Additionally, the improvement in left ventricular ejection fraction was associated with the density of cardiac stem cells in the marginal zone. To conclude, HIF-1α transfected cardiac stem cell transplantation can effectively improve the cardiac function in rats with myocardial infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Myocardial Infarction, Hypoxia-Inducible Factor 1, alpha Subunit, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李沙，李树仁，郝清卿. 过表达缺氧诱导因子1α心肌干细胞能提高心肌梗死后心功能及移植细胞的存活率[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 103-109.

Li Sha, Li Shu-ren, Hao Qing-qing. Effects of hypoxia inducible factor 1alpha gene modified cardiac stem cell transplantation on cardiac function and survival rate of transplanted cells in rats with myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 103-109.

图/表（结果） 2

2.1 培养细胞的生长情况及形态 原代培养时接种两三天后单细胞散在贴壁，组织块初期仍游离在培养液中，四五天后开始贴壁，随后成纤维样细胞和多角形不规则细胞爬出，七八天后圆形、体积小、折光性强的细胞开始爬出(图1A)。原代培养的细胞经消化、接种进行传代培养，细胞容易生长，生长速度增快。传代细胞24 h即开始贴壁，六七天细胞80%-90%贴壁融合。光镜下可观察到体积小、圆形及折光性强的细胞，细胞数量增多。各种悬浮及贴壁的杂细胞数量减少，细胞形态主要以成纤维细胞样和折光性强的圆形小细胞为主，后者在传代培养中保持未分化状态(图1B)。

2.2 心肌干细胞的鉴定结果 免疫荧光染色结果显示，培养的细胞主要为c-kit阳性心肌干细胞(图2)。

2.3 心肌干细胞的纯化结果 流式细胞仪识别并收集c-kit阳性心肌干细胞，培养的细胞中心肌干细胞纯度在11%左右。纯化后心肌干细胞继续贴壁生长，少量心肌干细胞呈规则长梭形，向心肌细胞方向分化(图3)。

2.4 细胞转染效果 选用生长状态良好的第4代心肌干细胞，病毒转染24-48 h后，荧光显微镜下可见带有绿色荧光蛋白标记的心肌干细胞，且细胞排列整齐，形态均一呈长梭状，经最佳MOI值为300(图4)。

2.5 实验动物数量分析 24只SD大鼠接受造模手术，术后共有20只存活。共死亡4只，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组1只结扎前降支过程中导致气胸死亡，心肌干细胞组与缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组各1只于结扎前降支过程中诱发室颤死亡，模型组1只于二次开胸细胞移植后72 h死亡。

2.6 心脏超声影像结果 造模前各组大鼠心功能指标正常，造模后2周各组大鼠左心室射血分数、左心室缩短分数、左心室舒张期末内径、左心室收缩末内径无明显差异(P < 0.05)；移植后1和2周，与模型组相比，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组和心肌干细胞组大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数均显著升高；而缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组与心肌干细胞组相比大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数并无明显差别；移植后3和4周，与模型组相比，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组和心肌干细胞组大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数均显著升高；缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组与心肌干细胞组相比大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数有显著差异；移植后4周，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组与心肌干细胞组相比左心室舒张期末内径及左心室收缩末内径均明显降低，其中以缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组变化更为显著(P < 0.05；表1，图5)。

2.7 移植后心肌干细胞存活率 荧光显微镜下，心肌干细胞存活密度最高处，取200倍视野中心肌干细胞数为心肌干细胞存活密度。缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组和心肌干细胞组可见绿色荧光蛋白标记的移植心肌干细胞(图6)，而模型组中未见绿色荧光蛋白标记的细胞。经统计学分析发现，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组[(12.391± 1.881)/200倍视野]心肌干细胞存活密度显著高于心肌干细胞组[(6.756±1.181)/200倍视野](P < 0.05)，模型组未见到绿色荧光。梗死后左室射血分数的改善与梗死边缘区心肌干细胞存活密度呈正相关(r=0.853，P < 0.05)，回归方程为Y=-1.639+0.853X，其中Y代表左心室射血分数值，X代表心肌梗死边缘区心肌干细胞存活密度。

2.8 心肌病理学变化 移植后4周，Masson染色显示梗死边缘区心肌细胞排列紊乱，红色心肌纤维部分断裂，纤维组织增生呈蓝色，细胞间可见多种炎性细胞浸润，梗死区正常心肌细胞形态消失，代之以成纤维细胞及粗大的胶原纤维束，排列疏松，其中以模型组胶原纤维粗大，排列杂乱；心肌干细胞组比缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组心肌细胞排列紊乱，红色心肌纤维断裂显著，细胞排列疏松；缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组红色心肌细胞在胶原纤维中散在再生(图7)。

参考文献

[1] Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D, et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 2003;114(6):763-776.

[2] Doppler SA, Deutsch MA, Lange R, et al. Cardiac regeneration: current therapies-future concepts. J Thorac Dis. 2013;5(5):683-697.

[3] Tal R. The role of hypoxia and hypoxia-inducible factor-1alpha in preeclampsia pathogenesis. Biol Reprod. 2012;87(6):134.

[4] Hinkel R, Lebherz C, Fydanaki M, et al. Angiogenetic potential of Ad2/Hif-1α/VP16 after regional application in a preclinical pig model of chronic ischemia. Curr Vasc Pharmacol. 2013;11(1):29-37.

[5] 王曼.经Bcl-2修饰的同种异体骨髓间充质干细胞移植对兔心梗后心功能不全的影响[D].石家庄:河北医科大学,2014.

[6] 胡炜,李树仁,张素巧,等.自体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后兔Ryanodine受体及其稳定蛋白表达的影响[J].中国老年学杂志,2012,32(1):110-113.

[7] 乔建晶,李树仁,胡炜,等.自体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心衰家兔炎性因子表达的影响[J].中国老年学杂志,2011, 31(11):2048-2051.

[8] Lloyd-Jones D, Adams R, Carnethon M, et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 2009;119(3):480-486.

[9] Hoover-Plow J, Gong Y. Challenges for heart disease stem cell therapy. Vasc Health Risk Manag. 2012;8:99-113.

[10] Quijada P, Toko H, Fischer KM, et al. Preservation of myocardial structure is enhanced by pim-1 engineering of bone marrow cells. Circ Res. 2012;111(1):77-86.

[11] 王曼,李树仁.基因工程在骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死中的应用[J].中国老年学杂志,2015,35(1):269-271.

[12] Ahluwalia A, Tarnawski AS. Critical role of hypoxia sensor--HIF-1α in VEGF gene activation. Implications for angiogenesis and tissue injury healing. Curr Med Chem. 2012;19(1):90-97.

[13] Xu Y, Zuo Y, Zhang H, et al. Induction of SENP1 in endothelial cells contributes to hypoxia-driven VEGF expression and angiogenesis. J Biol Chem. 2010;285(47):36682-36688.

[14] Semenza GL. Regulation of metabolism by hypoxia-inducible factor 1. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2011;76: 347-353.

[15] Le Moine CM, Morash AJ, McClelland GB. Changes in HIF-1α protein, pyruvate dehydrogenase phosphorylation, and activity with exercise in acute and chronic hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011;301(4):R1098-1104.

[16] 周启璠,于淼,陈国良,等.缺氧诱导因子-1及其抑制剂的研究进展[J].中国药物化学杂志,2014,24(1):48-58.

[17] Chu W, Li X, Li C, et al. TGFBR3, a potential negative regulator of TGF-β signaling, protects cardiac fibroblasts from hypoxia-induced apoptosis. J Cell Physiol. 2011;226(10): 2586-2594.

[18] Zhang Q, Qian Z, Pan L, et al. Hypoxia-inducible factor 1 mediates the anti-apoptosis of berberine in neurons during hypoxia/ischemia. Acta Physiol Hung. 2012;99(3):311-323.

[19] Yang B, He K, Zheng F, et al. Over-expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in vitro protects the cardiac fibroblasts from hypoxia-induced apoptosis. J Cardiovasc Med (Hagerstown). 2014;15(7):579-586.

[20] 李红乐,邢飞跃,孙学刚,等.腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间充质干细胞中高效表达[J].中国病理生理杂志,2003,19(3): 293-296.

[21] 康健,侯洋,周许辉,等.TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的研究[J].中国脊柱脊髓杂志, 2014(2):68-74.

[22] 周青,郭瑞强,陈新,等.经胸超声心动图对3种兔心力衰竭模型的检测[J].中国超声医学杂志,2005,21(5):325-327.

[23] Xu HX, Li GS, Jiang H, et al. Implantation of BM cells transfected with phVEGF165 enhances functional improvement of the infarcted heart. Cytotherapy. 2004;6(3): 204-211.

[24] Sato Y, Yamada T, Taniguchi R, et al. Persistently increased serum concentrations of cardiac troponin t in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy are predictive of adverse outcomes. Circulation. 2001;103(3):369-374.

[25] Dispenzieri A, Kyle RA, Gertz MA, et al. Survival in patients with primary systemic amyloidosis and raised serum cardiac troponins. Lancet. 2003;361(9371):1787-1789.

[26] 刘路平,谢晓林,林玎.联合cTnT?hs-CRP?NT-ProBNP 测定对心力衰竭的诊断及预后判断的意义[J].心脑血管病防治,2011, 11(1):87.

[27] Hudson MP, O'Connor CM, Gattis WA, et al. Implications of elevated cardiac troponin T in ambulatory patients with heart failure: a prospective analysis. Am Heart J. 2004;147(3): 546-552.

[28] Niizeki T, Takeishi Y, Arimoto T, et al. Heart-type fatty acid-binding protein is more sensitive than troponin T to detect the ongoing myocardial damage in chronic heart failure patients. J Card Fail. 2007;13(2):120-127.

[29] Miettinen KH, Eriksson S, Magga J, et al. Clinical significance of troponin I efflux and troponin autoantibodies in patients with dilated cardiomyopathy. J Card Fail. 2008;14(6):481-488.

[30] 葛均波,黄浙勇.干细胞治疗急性心肌梗死:离临床应用还有多远?[J].中国实用内科杂志,2011,31(10):739-742.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2016年5月在河北医科大学附属河北省人民医院实验室完成。

1.3 材料

动物：①清洁级雄性SD大鼠，鼠龄1 d；②清洁级雄性SD大鼠，鼠龄三四个月。2种大鼠均购自河北医科大学动物室，许可证号：SCXK(冀)2008-1-03。

主要试剂和仪器：Ad-eGFP-HIF1α、Ad-eGFP购自上海吉满生物有限公司；IMDM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自wesent公司；胰蛋白酶购自北京索来宝公司；抗c-kit抗体购自Abcam公司；FITC 标记的链亲和素购自Life Technologies公司；DAPI溶液购自北京索来宝公司；生物安全柜购自Heal公司；倒置显微镜购自Olympus公司；荧光显微镜购自德国Leica公司；超净工作台购自日本Sanyo公司；5810R型台式多功能高速冷冻离心机购自eppendorf AG公司；细胞培养箱购自德国Heraeus公司。

1.4 方法

1.4.1 大鼠心肌细胞的分离与培养 取1 d龄大鼠心脏，PBS洗2次，加入含1×10⁵ U/L青霉素及100 mg/L链霉素的PBS 1 mL，剪切组织至1 mm³大小，PBS洗2次，加入无钙镁0.25%胰酶/0.02 % EDTA，37 ℃震荡消化10-15 min，1 000 r/min离心5 min，弃消化液，加入含体积分数20%胎牛血清、1×10⁵ U/L青霉素及100 mg/L链霉素的IMDM培养基37 ℃体积分数5%CO₂饱和湿度孵育。显微镜下每日观察细胞形态和贴壁生长，每两三天更换培养液1次。待细胞出现大量集落，即可进行传代。在倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，当细胞培养至90%融合时，弃培养液，PBS洗2次，加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，显微镜下观察细胞由梭形变为圆形，立即加入等量含10%胎牛血清的IMDM培养液终止消化，收集单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加10 mL含10%胎牛血清的IMDM培养液重悬细胞，按1∶2传代，培养条件与原代培养相同。37 ℃、体积分数5%的CO₂的孵箱中培养，每两三天换培养液1次。

1.4.2 心肌干细胞的鉴定 选择生长良好的传代细胞，接种到多聚赖氨酸包被的盖玻片上贴壁生长。48 h后取出已经贴壁形成单层细胞的玻片进行免疫荧光标记，40 g/L多聚甲醛室温固定1 h；0.5% Triton-100/PBS漂洗5 min×3次，体积分数5%牛血清白蛋白室温封闭1 h后加入1∶100稀释的抗c-kit抗体，湿盒内室温孵育2 h，0.5% Triton-100/ PBS漂洗5 min×3次，加入1∶500稀释的Streptavidin FITC Conjugate，避光室温孵育1 h；1∶1 000的DAPI复染5 min，PBS漂洗5 min×3次，甘油封固，荧光显微镜观察。

1.4.3 流式细胞术提纯心肌干细胞 培养细胞用0.25%的胰酶消化，PBS洗1次，PBS悬浮细胞，加入体积分数2%胎牛血清的PBS封闭1 h，每1×10⁶个细胞加1 μL按1∶100稀释抗c-kit抗体，室温下反应20-60 min，PBS洗1次，加入1∶500稀释的Streptavidin FITC Conjugate混匀，暗室室温下反应30 min，PBS洗1次，重悬成单细胞悬液，上机检测，收集提纯的c-kit阳性心脏干细胞。

1.4.4 重组腺病毒载体转染心肌干细胞 取生长状态良好的第4代心肌干细胞，消化后以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于24孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养24 h后倒掉细胞培养基，PBS洗3次，加入无血清IMDM培养基1 mL，再加入含Ad-eGFP-HIF1α的病毒液，根据感染复数(multiplicity of infection，MOI)梯度(MOI= 100-500)的不同分为5组，每组2孔，每隔15 min摇晃1次。2 h后倒掉转染的病毒液，PBS洗，加入含体积分数10%胎牛血清IMDM培养液继续培养，细胞转染后72 h经荧光显微镜观察转染效率，最后根据转染结果确定最佳MOI。根据最佳MOI，分别加入含Ad-eGFP-HIF1α或Ad-eGFP的病毒液转染心肌干细胞，浓缩至1×10⁶ L^-¹并移植入各组大鼠体内。

1.4.5 实验动物分组及心肌梗死模型的建立 将24只SD大鼠按照数字表法随机等分为3组：模型组、心肌干细胞组和缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组。

大鼠以3%戊巴比妥钠(1 μL/g)行腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，心前区备皮，常规消毒铺巾，在第4-5肋间做切口，逐层分离胸壁，暴露心脏，小心撕开心包，用小棉球轻轻推开心底脂肪垫及左心耳，用眼科带线缝合针沿左心耳的下缘中部进针，进针深度应穿过心肌1 mm左右，结扎冠状动脉左前降支，同步记录大鼠心率及心电图变化，以左心室前壁紫绀变白及同步心电图示S-T段抬高为结扎成功标志^[6-7]。清除胸腔积血，抽出积气，缝合切口。术后肌肉注射青霉素2×10⁵ U，连续3 d。

1.4.6 细胞移植 造模2周后，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组、心肌干细胞组和模型组分别在心肌梗死边缘区域分4点注射1×10⁶ Ad-HIF1α-eGFP转染的心肌干细胞、1×10⁶ Ad-eGFP转染的心肌干细胞及0.1 mL PBS。连续3 d肌注青霉素2×10⁵ U预防感染。

1.4.7 超声心动图评价心脏功能 造模前、造模后2周及移植后1，2，3，4周分别进行心脏超声检测，测量大鼠左心室舒张期末内径和收缩末内径、左心室缩短分数和左心室射血分数。

1.4.8 移植细胞存活情况的检测 移植后4周处死实验动物，心肌取材及制作石蜡切片，经Masson染色后于普通光镜下观察组织学形态变化。

分别留取各组大鼠梗死边缘区心肌组织，制作冰冻切片，荧光显微镜490 nm波长下观察，计数心肌干细胞存活密度：每只大鼠的切片选15处梗死边缘区心肌组织中心肌干细胞存活密度最高处，取200倍视野中心肌干细胞数为心肌干细胞存活密度。将每只大鼠左心室射血分数差值(左心室射血分数差值=移植后4周左心室射血分数-造模后2周左心室射血分数和)与其心肌干细胞存活密度进行相关性分析。

1.5 主要观察指标 ①超声检测心功能；②移植后心脏病理形态；③心肌干细胞存活情况；④左心室射血分数差值与心肌干细胞存活密度相关性。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示。运用 SPSS 13.0软件进行分析。正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析和SNK法两两比较；正态分布但方差不齐的数据采用T 检验两两比较；非正态分布和(或)方差不齐的数据采用秩和检验(Kruskal-Wallis法)和多组秩两两比较；相关变量间采用直线相关分析；P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来随着介入和溶栓等血管再通及冠脉搭桥的广泛开展，已经显著降低冠状动脉粥样硬化性心脏病的死亡率^[8]，但现行的治疗方法不能从根本上修复超过溶栓和介入治疗时间窗的坏死心肌组织，坏死心肌组织被纤维组织替代，因此用干细胞取代坏死心肌细胞，形成新生心肌细胞，成为冠状动脉粥样硬化性心脏病研究的新方向。大量动物实验已证实了干细胞在治疗心肌梗死方面的独特优势。然而，干细胞移植后最大的障碍是细胞在缺血、缺氧等恶劣环境下极低的存活率^[9]。为解决这一难题，人们尝试基因修饰的方法，即在细胞移植前将抗凋亡基因通过转染或转导的方式，使其基因结构发生改变，进而可能会从根源上解决干细胞的存活、代谢及增生或分化等能力。

干细胞移植后在缺血心肌上生存力降低是阻碍其应用的首要障碍，因此有效的促血管新生、抗凋亡基因的导入，改善干细胞的抗缺氧能力将显得尤为重要。研究表明，将Pim-1修饰的细胞移植到体内心肌组织后细胞存活量显著增加且心功能明显改善^[10]。经Bcl-2基因修饰的骨髓干细胞移植可较单纯骨髓干细胞移植到心肌组织后能够显著地减少心肌细胞凋亡、促进血管再生、改善心功能^[11]。然而这些基因产物的生物学特性较为复杂，作用机制也尚未完全明确，因此在发挥抗凋亡作用的同时，常常还可潜在的参与多种恶性肿瘤的形成过程，故而在临床研究中极为受限。

实验通过对大量基因功能研究的成果进行综合整理，发现缺氧诱导因子1α基因在缺氧环境中能够表达，并且能够控制下游多种基因的表达^[3]，包括血管内皮生长因子^[12]、葡萄糖转移酶1、酪氨酸激酶等，这些基因表达后参与红细胞生成和血管生成^[13]，参与核苷、氨基酸、糖的代谢和细胞存活、凋亡等活动^[14-19]，维持组织、细胞在缺氧条件下内环境的稳定。因此，作者利用基因工程的方法，将缺氧诱导因子1α基因转导入心肌干细胞，然而进一步研究发现基因工程中载体的选择是影响目的基因能否发挥作用的关键。常用的表达载体包括病毒载体和非病毒载体，目前病毒载体的种类较为丰富，包括反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。通过对各类型载体功能研究成果的汇总，发现腺病毒转基因效率高^[20]，可转导不同类型的组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高，且可在同一细胞株中用来设计表达多个基因的表达系统，有研究表明绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染细胞在体外4周可以稳定表达绿色荧光，而在体内用腺病毒转染的干细胞也可以表达长达7周之久^[21]。作者设计利用腺病毒载体进行基因重组载体构建，将缺氧诱导因子1α基因和绿色荧光蛋白基因导入腺病毒骨架进行基因重组，进而转染宿主细胞。

研究表明评价左室舒张功能的金指标为有创导管技术测量左室等容舒张期压力衰减时间常数^[22-23]，由于实验条件所限，作者仅利用超声心动图作为心功能的测量指标，其测量数据与有创导管技术测量心功能的一致性尚未做进一步研究，但通过对不同时期心脏超声的统计学分析，各阶段超声测量数据符合动物模型不同阶段的心功能变化。心肌梗死后2周各组大鼠左心室射血分数、左心室缩短分数、左心室舒张期末内径、左心室收缩末内径接近；移植后1和2周，与模型组相比，另2组大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数均显著升高；而缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组与心肌干细胞组大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数接近；移植后3周，与模型组相比，另2组大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数均显著升高；缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组与心肌干细胞组相比大鼠左心室射血分数及左心室缩短分数差异有显著性意义；移植后4周，与心肌干细胞组相比，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组左心室舒张期末内径及左心室收缩末内径均明显降低。说明心肌干细胞移植可提高心功能；经缺氧诱导因子1α基因修饰的心肌干细胞移植可较单纯心肌干细胞移植更显著改善心功能。

实验中借助绿色荧光蛋白观察移植细胞在梗死边缘区域的存活情况，缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组和心肌干细胞组可见绿色荧光蛋白标记的移植心肌干细胞，其中缺氧诱导因子1α转染心肌干细胞组心肌干细胞存活密度显著高于心肌干细胞组，且梗死后左室射血分数的改善与梗死边缘区心肌干细胞存活密度呈正相关。说明经缺氧诱导因子1α基因修饰的心肌干细胞移植可较单纯心肌干细胞移植更显著延长心肌干细胞生存时间。

由于实验条件所限，未采集缺氧诱导因子1α下游蛋白葡萄糖转移酶1、酪氨酸激酶等，这些基因表达后参与红细胞生成和血管生成，参与核苷、氨基酸、糖的代谢和细胞存活、凋亡等活动，维持组织、细胞在缺氧条件下内环境的稳定，也未对梗死边缘去心肌细胞凋亡及心室重构情况进行观察，另有研究指出肌钙蛋白、B型利钠肽等生化指标对于监测心脏功能变化异常灵敏^[24-29]，这些方向为下一步实验提供了新思路。

终上所述，心肌干细胞易于接受基因修饰，不仅可作为组织工程的种子细胞，而且也可作为基因治疗的良好工具。实验为临床心肌梗死的治疗提供了新思路，然而基因修饰干细胞应用于临床前还存在许多问题亟待解决^[30]：例如动物实验所取得的成果能否在临床复制、基因重组干细胞的疗效是否可以长期维持、细胞移植途径等问题。虽然该技术的开展一直饱受争议，然而其在基础研究中取得的进步却不容忽略。有理由相信，随着对心血管疾病分子及细胞水平认识的不断加深和基因修饰技术的不断改进，心脏干细胞移植联合基因工程技术治疗心肌梗死将有更广阔的应用前景。

过表达缺氧诱导因子1α心肌干细胞能提高心肌梗死后心功能及移植细胞的存活率

Effects of hypoxia inducible factor 1alpha gene modified cardiac stem cell transplantation on cardiac function and survival rate of transplanted cells in rats with myocardial infarction

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[1]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[5]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[6]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[7]	轩娟娟, 白鸿太, 张继翔, 王耀权, 陈国勇, 魏思东. 调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1143-1148.
[8]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[9]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[10]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[11]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[12]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[13]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[14]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[15]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.