2.1  细胞形态  通过生物显微镜观察，ATDC5细胞在含ITS的HL-1培养液中培养，细胞形态逐渐发生变化，到第17天时，两组细胞都表现出明显浓聚，出现斑块样改变，施加间歇静水压的ATDC5细胞从第11天起就表现出较明显的斑块样改变和细胞浓聚现象，见图1。

软骨细胞生长的最佳培养环境和培养系统是软骨组织工程要解决的基本而首要的问题。目前，软骨细胞要求的培养环境包括酸碱环境、CO₂体积分数、氧分压、温度、营养成分和无菌环境等条件，而软骨细胞对于微环境的变化非常敏感，特别是应力微环境的改变。软骨细胞通过感应压应力对软骨结构进行调控，维护其正常的功能^[1-3]，应力微环境的变化可诱导软骨细胞表型发生变化，软骨的各项功能均与力学刺激密切相关。许多研究表明，力学刺激对软骨的发育和成熟，软骨细胞生长、分化、表型维持至关重要^[4-5]，缺乏力学刺激的软骨，基质合成能力降低，退变转化为纤维细胞表型^[6-8]。因此，研究机械负荷条件下对软骨分化的影响具有重要的意义。该实验利用ATDC5软骨细胞系，研究在间歇静水压的作用下，软骨细胞特异基因表达的早期变化规律，进一步从基因水平了解间歇静水压这种特殊的力学环境对软骨细胞分化成熟的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  体外细胞学实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年1月至2019年2月在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  细胞  ATDC5细胞系(RIKEN Cell Bank，Tsukuba，Japan)是从AT805胚胎癌细胞分离培养出来的，作为一个前软骨细胞株其分化过程与软骨形成过程类似。ATDC5细胞购买于美国ATCC公司。

1.3.2  实验试剂和仪器  DMEM/F12(Nissui Pharmaceutical Co，Tokyo，Japan)；HL-1培养液(Collaborative Biomedical Products)；RNA提取试剂(Tri-Reagent，Sigma Chemical)；RNA反转录试剂(Applied Biosystems)；ABI Prism 7900HT序列探测系统(Applied Biosystems)；AG210TA自动控制电子万能试验机(Japan)。

1.4  方法

1.4.1  细胞培养  未分化的ATDC5细胞，以4.6×10⁶/   3.5 cm²数量，培养在6孔的插入式培养皿中，设立5组培养皿，共30孔，加入含体积分数为5%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液进行单层培养，细胞相互融合后，更换为含ITS(10 mg/L胰岛素，    5.5 mg/L转移液和6.7 μg/L亚硒酸钠)的HL-1培养液继续培养，以诱导向软骨细胞方向分化，培养72 h后细胞形成复层生长。  

1.4.2  细胞的力学刺激  将已完全复层贴壁生长含ATDC5软骨细胞的插入培养皿消毒干净，放入无菌塑料袋中，加入40 mL含ITS(10 mg/L胰岛素，5.5 mg/L转移液和6.7 μg/L亚硒酸钠)的HL-1培养液培养，去除袋中的空气，袋口加热封存。将封存好的培养袋放入充满水的不锈钢压力容器内，计算机自动控制压力负载结构，这种间歇水压能够使细胞均匀承受由周围水产生的静水压力，通过这种传导受力的方式，使间歇压力不仅可控性好，而且确实可靠。实验设计的力学条件为：10 MPa，1 Hz，每天4 h，共17 d。设立无间歇静水压，且其他条件相同的培养细胞为对照组。

1.4.3  Real-time PCR检测软骨细胞特异基因Aggrecan、COL-2、SOX-9的表达  在第4，7，11，14，17天，将细胞取出，每组取3孔相同条件培养的细胞，提取其RNA，经反转录后，通过Real-time PCR检测软骨细胞特异基因Aggrecan、COL-2、SOX-9的表达。

(1)RNA的提取：取间歇静水压作用后的ATDC5软骨细胞及对照组ATDC5细胞，经Tri-reagent作用并收集细胞，放入tube管中，加入0.1 mL氯仿，震动15 s，室温等待    15 min，4 ℃，1 300 r/min离心5 min，将上层无色水相转移至一Ep管中，加入0.25 mL异丙醇，轻轻震荡，室温放置5 min，弃上层水相，加入0.5 mL体积分数为75%乙醇，冲洗，震荡，再次4 ℃，1 300 r/min离心10 min，倒去乙醇，倒置试管，干燥RNA。

(2)反转录成cDNA：去除样品中的DNA，再次4 ℃，   1 300 r/min离心10 min，加入蒸馏水，放入冰上溶解后，在RNA仪上测量RNA的含量，并将样品调至RNA含量    2 µg/10 µL。应用TaqMan反转录试剂盒，将10 µL RNA与10 µL反转录试剂(包含反转录缓冲液2 µL，dNTP0.8 µL，RNA酶抑制剂1 µL，反转录酶1 µL，无核酸酶蒸馏水    3.2 µL，Oligo(dT)1 µL)相互混合，放入DNA合成仪(Oligo192)，设定25 ℃，1 min，37 ℃，120 min，85 ℃，30 s，4 ℃维持，得到cDNA。

(3)Real-time PCR的检测：软骨细胞中Aggrecan，COL-2，SOX-9及GAPDH引物的设计通过The Primer Express computer program(Applied Biosystems)来完成。引物如下：GAPDH：5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3'(5'端引物)与5'-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3'(3'端引物)；Aggrecan：5'-TGC TAC TTC ATC GAC CCC AT-3'(5'端引物)与5'-AAA GAC CTC ACC CTC CAT CT-3'(3'端引物)；COL-2：5'-TAC GGT GTC AGG GCC AGG ATG C-3'(5'端引物)与5'-CCT TGT CAC CAC GAT CAC CTC T-3'(3'端引物)；SOX-9：5'-ACT CCC AAA ACC GAC GTG CA-3'(5'端引物)与5'-CGT CTT GAT GTG CGT TCG CT-3'(3'端引物)。应用ABI Prism 7900HT Sequence Detection System( Applied Biosystems)来完成Real-time RT-PCR。在反应平板上建立好分组，每孔加入8 µL矿物油后，分别加入Taqmou Master mix    2.5 µL，相应的Aggrecan，COL-2，SOX-9及GAPDH引物0.25 µL，cDNA1 µL，水1.25 µL，设定反应条件，循环次数40次，获得Ct值，并与管家基因GAPDH值比较，作为设定的标准差，得到∆Ct，再获得∆∆Ct值，通过∆∆Ct= ∆Ct(target gene)-∆Ct(reference gene)来计算Aggrecan、COL-2、SOX-9 mRNA在细胞内的表达。

1.5  主要观察指标  ATDC5细胞的形态变化以及细胞内Aggrecan，COL-2，SOX-9的mRNA表达变化。

1.6  统计学分析  采用SPSS软件(SPSS 17.0；SPSS Chicago)进行统计学描述。

在软骨组织工程研究中存在组织工程软骨“空心”，力学强度差以及难以精确塑形问题，这是目前体外软骨构建技术难以突破的瓶颈，而这些都与软骨细胞的发育成熟有直接的关系。软骨细胞的发育成熟是一个复杂的过程，不仅有多种细胞因子等化学方面的参与调节^[9-10]，还有力学刺激等物理方面的作用，这些对软骨的发育和成熟是至关重要的^[11-12]。

从关节软骨的功能来讲，它与力学刺激密切相关，在体内发挥着抗压、缓冲震荡和维持外形等功能，主要经历周期性的流体剪切力、静态液压力或直接动态压缩力，关节软骨自浅至深分为浅表区、中间区、深区及钙化区，这种结构具有抗压和抗剪切功能，能够满足日常活动需要。因此，要构建功能性软骨也离不开力学刺激。当前，国内外在各种力学环境条件下进行了许多软骨细胞在分化方面的研究，但仍然缺乏规律性的认识^[13-14]。

目前，对软骨细胞在不同力学环境下的影响主要从2个方面研究：静态压力和动态压力。CARVER等^[15]研究发现在静态液压力作用下，软骨细胞分泌的硫酸软骨素浓度比对照组提高2倍；ATTILA等^[16]研究表明静态液压力作用使软骨细胞中α5整合素及β1整合素mRNA上调，推断其发挥力学传导器的作用，导致一系列细胞内信号的级联反应；随后MIYANISHI等^[17]研究证实静态压在一定程度上会抑制软骨细胞基质的分泌，影响软骨细胞的分化，而动态压效果较好。在促进功能化软骨形成方面，动态压明显优于其他力学刺激。NAZEMPOUR等^[18]研究发现，在动态压的作用下胞膜信号分子G蛋白表达上调，通过激活磷酯酶C进一步传导，促进其下游蛋白质的磷酸化，使得力学信号进一步传向细胞核。在动态剪切力研究方面：MALAVIYA等^[19]将3.5 Pa的流体剪切力作用到单层培养的牛原代关节软骨细胞上，96 h后发现流体剪切力可明显促进软骨细胞的增殖，施加剪切力组培养液中的转化生长因子β1是静止组的3.5倍；而后有学者通过动态高流体剪切力的研究进一步证明动态高流体剪切力对软骨细胞有害，对单层软骨细胞施加1.6 N/m²剪切力，发现糖胺多糖增加2倍，但前列腺素E2和金属蛋白酶抑制剂1各增加10倍和9倍，表明细胞产生炎症反应^[20]。还有研究表明动态间歇静水加压却能促进软骨细胞基质的分泌^[21-22]，作者据此进一步应用ATDC5软骨细胞系，施加间歇静水压，从软骨特异基因表达方面进行软骨细胞分化的研究。

实验结果显示：ATDC5细胞在施加间歇静水压作用后，不仅在细胞形态上发生变化，从培养第11天起，施加间歇静水压组较对照组较早表现出明显的斑块样改变和细胞浓聚现象，而且在基因表达水平上也出现明显的差异，从第7天开始到第14天时，Aggrecan、COL-2基因表达较对照组均明显升高，说明ATDC5细胞在施加间歇静水压的刺激作用下，向有利于软骨细胞的分化发展，随着培养时间的延长，Aggrecan表达持续升高，从第14天开始又有所下降，而SOX-9开始施加作用力后，出现先下降而后又逐渐升高的趋势，而后保持平稳，这些结果表明间歇静水压促进软骨细胞的分化成熟，是一种必要的生理性刺激因素，可以在一定程度上克服传统软骨细胞培养条件的不足，是影响软骨细胞分化的重要影响因素^[23-24]。从实验结果进行分析，Aggrecan、COL-2、SOX-9基因表达并不是平稳的升高，不同时间变化的幅度差别较大，表明软骨细胞的分化成熟除力学因素以外，存在其他多种因素作用的结果，这些因素构成了软骨细胞分化的微环境。

间歇静水压这种力学刺激，是力学信号转化成生物学信号的表现，这种信号的传导通路在影响细胞分化的力学微环境当中起着非常重要的作用。力学刺激影响软骨细胞分化基因表达的信号传导通路一般认为主要集中2个方面：①整合素-细胞骨架通路：研究表明整合素的聚集和整合素与其细胞外基质配体形成新的连接是软骨细胞响应各种机械应力的起始^[25-27]，这为机械力在细胞内的传导提供了物理途径。同时，细胞骨架参与细胞分裂、物质的运输及其运动，对信号转导的各个环节均有重要调节作用，研究表明适宜的压力作用使软骨细胞中α5整合素及β1整合素mRNA上调，推断其发挥力学传导器的作用，导致一系列细胞内信号的级联反应^[28-29]；②另一方面，G蛋白通路也显示出影响软骨细胞分化的特殊作用。研究发现，在力学刺激作用下软骨细胞胞膜信号分子G蛋白表达上调^[19，30]，通过激活磷酯酶C进一步传导，促进其下游蛋白质的磷酸化，使得力学信号进一步传向细胞核。对于间歇静水压通过何种信号通路来影响软骨细胞的分化，又如何按照时间和空间的顺序性、程序性启动软骨细胞的分化基因，使软骨标志性蛋白持续表达，向成熟软骨细胞分化，还需值得进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

间歇静水压：软骨细胞的新陈代谢及发育，除了有必要的营养成分支持外，力学刺激也是必不可少的，而力学刺激又有许多方式，如剪切力、流水动力、持续压力、间歇压力等，这些力学刺激对软骨细胞的诱导分化结果不尽相同，而最接近生理状态下的力学刺激最有利于软骨细胞的发育与分化，间歇静水压就是模仿关节运动的方式，把细胞放在培养液里间断对细胞进行力学刺激，进而促进细胞分化和发育。

软骨组织工程：软骨组织损伤后很难再生，如何修复受损伤的软骨组织是目前国际关注的焦点，利用工程学原理，重新构建新的软骨组织，是修复软骨组织最有效的方法，但构建新的软骨组织非常复杂，需要能够分化成软骨细胞的干细胞，需要分化所必需的培养液、培养支架、力学环境等因素，还需要稳定的生长发育环境，因此从种子细胞到软骨细胞，最后形成软骨组织是一个复杂的生物工程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

组织工程技术为软骨缺损的理想修复提供了新的思路和手段，由于软骨细胞来源不足，如何利用具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞作为种子细胞进行定向诱导成软骨分化，是组织工程研究的重要领域。目前的研究方向，除了应用各种生长因子、营养成分等进行系统研究，力学作用方向越来越被重视，力学刺激对软骨的发育和成熟至关重要，构建功能性软骨必须通过力学刺激，因此，研究机械负荷条件下对软骨分化的影响具有重要的意义。力学刺激形式多样,如剪切力、静态液压力或直接动态压缩力等，哪一种作用于干细胞更有利于其定向软骨分化是目前研究的热点和难点，人们就此开展了大量的工作，试图揭示力学刺激究竟何种程度影响到干细胞向软骨方向分化的基因水平表达，正是这篇论文的研究意义。

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