低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖及其机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.020

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5375-5381.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖及其机制

卓毅¹，李璇²，段答¹，葛丽特¹，袁挺¹，吴沛¹，王昊¹，龙浪¹，卢明¹

¹湖南师范大学第二附属医院(解放军第163医院) 神经外科，湖南省长沙市 410003；²湖南省肿瘤医院(中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院)，湖南省长沙市 410003

修回日期:2017-07-29 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 卢明，博士，教授，湖南师范大学第二附属医院(解放军第163医院)神经外科，湖南省长沙市 410003
作者简介:卓毅，男，1988年生，湖南省张家界市人，土家族，2016年湖南师范大学医学院毕业，硕士，医师，主要从事神经外科学及神经损伤修复研究。并列第一作者：李璇，女，1987年生，湖南省长沙市人，汉族，2016年湖南师范大学医学院毕业，硕士，医师，主要从事血液肿瘤及干细胞修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81371358)；湖南省自然科学基金(14JJ2060)；湖南省教育厅研究生创新项目(CX2015B188)

Hypoxic microenvironment promotes the proliferation of human olfactory mucosa mesenchymal stem cells and its associated mechanism

Zhuo Yi¹, Li Xuan², Duan Da¹, Ge Li-te¹, Yuan Ting¹, Wu Pei¹, Wang Hao¹, Long Lang¹, Lu Ming¹

¹Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Hunan Normal University (the 163^rd Hospital of Chinese PLA), Changsha 410003, Hunan Province, China; ²Hunan Cancer Hospital, the Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410003, Hunan Province, China

Revised:2017-07-29 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Lu Ming, M.D., Professor, Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Hunan Normal University (the 163rd Hospital of Chinese PLA), Changsha 410003, Hunan Province, China
About author:Zhuo Yi, Master, Physician, Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Hunan Normal University (the 163 rd Hospital of Chinese PLA), Changsha 410003, Hunan Province, China. Li Xuan, Master, Physician, Hunan Cancer Hospital, the Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410003, Hunan Province, China. Zhuo Yi and Li Xuan contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371358; the Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 14JJ2060; the Postgraduate Innovative Project of Hunan Provincial Education Department, No. CX2015B188

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
低氧微环境：不同氧体积分数下的细胞具有不同存活能力、增殖潜能、分化倾向以及迁移能力。目前，低氧微环境对干细胞分化影响的研究主要集中在成软骨、成骨、成脂方面，对其向多巴胺能神经元分化的影响报道少见；有研究证实在3%O₂体积分数下细胞的增殖能力以及活性均最佳，所以实验选取了此氧体积分数为实验的低氧微环境。
HIF-1：是Semenza等在研究缺氧刺激红细胞生成素基因表达时发现的一种DNA结合蛋白，HIF-1可与低氧反应元素相结合后进一步使下游靶基因激活。HIF-1具有一系列的靶基因谱，如酪氨酸羟化酶、红细胞生成素、血管内皮生长因子、干细胞因子、基质细胞源性因子1等。这些因子在组织、细胞适应缺血缺氧的环境中具有重要的作用。

摘要
背景：人嗅黏膜间充质干细胞不仅具有一般间充质干细胞的基本特征，因其来源于外胚层，还能更多地向神经元方向分化，是一种用于神经损伤修复与再生的理想种子细胞。常规细胞体外培养的氧气体积分数约为21%，而人体正常组织和组织间隙中的氧气体积分数为3%-9%。低氧对人嗅黏膜间充质干细胞增殖及活性的影响尚未见报道。
目的：探讨低氧微环境对人嗅黏膜间充质干细胞增殖、活性的影响及其相关机制。
方法：分离培养人嗅黏膜间充质干细胞，应用流式细胞学和免疫荧光方法分别进行鉴定；实验将第4代人嗅黏膜间充质干细胞分成3组：体积分数为21%O₂组(常氧组)、体积分数为3%O₂组(低氧组)、体积分数为3%O₂+20 µmol/L YC-1(HIF-1α抑制剂)组(抑制剂组)，干预72 h后采用流式细胞技术检测各组细胞的细胞周期和细胞凋亡情况；采用Western blot方法检测增殖细胞核抗原的蛋白表达；采用Q-PCR及Western Blot 分别检测HIF-1α和TWIST的mRNA及蛋白表达。
结果与结论：①分离培养出了人嗅黏膜间充质干细胞，第4代人嗅黏膜间充质干细胞的纯度达97%以上；②低氧组比常氧组的增殖系数大(P < 0.05)，且两组间的存活细胞及总体的凋亡细胞(机械死亡+早期凋亡+晚期凋亡)比例差异无显著性意义(P > 0.05)；③低氧组的增殖细胞核抗原蛋白表达显著增高，与常氧组和抑制剂组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；④低氧组中HIF-1α和TWIST mRNA和蛋白表达显著上调，与常氧组和抑制剂组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤低氧微环境能促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖而对其细胞活性无明显影响，且此过程与人嗅黏膜间充质干细胞内HIF-TWIST信号通路被激活有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7894-5811(卓毅)

关键词: 干细胞, 培养, 人嗅黏膜间充质干细胞, 低氧, 低氧诱导因子, 增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human olfactory mucosa mesenchymal stem cells (hOM-MSCs) not only have the basic characteristics of mesenchymal stem cells, but also originate from the ectoderm and are prone to differentiate into neurons, which are a kind of ideal seed cells for nerve repair and regeneration. Cells are conventionally cultured in about 21% in vitro, while only 3%-9% oxygen is found in the human body and tissue space. There is still no report on the effect of hypoxia on the proliferation and activity of hOM-MSCs.
OBJECTIVE: To explore whether hypoxic microenvironment can promote hOM-MSCs proliferation and activity and the related mechanism.
METHODS: hOM-MSCs were isolated, cultured and identified by flow cytometry and immunofluorescence. The passage 4 hOM-MSCs were divided into three groups: 21% O₂ group, 3% O₂ group and 3% O₂+20 µmol/L YC-1 (HIF-1α inhibitors) group. Proliferation and apoptosis of hOM-MSCs was detected by flow cytometry after 72 hours of culture. The proliferating cell nuclear antigen protein expression was detected by western blot. The mRNA and protein expression of HIF-1α and TWIST were detected by Q-PCR and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The purity of hOM-MSCs was up to 97%, as defined by flow cytometry. The proliferation index of 3% O₂ group was higher than the 21% O₂ group (P < 0.05), and cell survival and apoptosis ratio (apoptotic cells included mechanical death + early apoptosis + late apoptosis) between the two groups had no significant difference (P > 0.05). Western blot results showed that the proliferating cell nuclear antigen protein expression in the 3% O₂ group was significantly higher than that in the other groups (P < 0.05). The HIF-1α and TWIST expressions at mRNA and protein levels in the 3% O₂ group were significantly higher than those in the other groups (P < 0.05). To conclude, hypoxic microenvironment can promote the hOM-MSCs proliferation and has no effect on the apoptosis, and the HIF-TWIST signal pathway plays an important role in this progress.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cell Hypoxia, Olfactory Mucosa, Mesenchymal Stem Cells, Hypoxia-Inducible Factor 1, alpha Subunit, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

卓毅，李璇，段答，葛丽特，袁挺，吴沛，王昊，龙浪，卢明. 低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖及其机制[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5375-5381.

Zhuo Yi, Li Xuan, Duan Da, Ge Li-te, Yuan Ting, Wu Pei, Wang Hao, Long Lang, Lu Ming. Hypoxic microenvironment promotes the proliferation of human olfactory mucosa mesenchymal stem cells and its associated mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5375-5381.

图/表（结果） 3

2.1 人嗅黏膜间充质干细胞培养及鉴定结果 组织块贴壁七八天后有细胞爬出，细胞呈梭形、多角形，传代后细胞纯度提高，形态均一，以平行排列生长为主，或呈漩涡状生长(图1A)；细胞免疫荧光鉴定表达STRO-1(图1B)；经流式细胞术检测，细胞表面不表达CD34、CD45表面标记物，却表达CD73、CD90以及CD105基质细胞标记物，传至第4代的细胞纯度达97%以上(图1C)。

2.2 低氧微环境下人嗅黏膜间充质干细胞的细胞周期变化 各组细胞干预7 h后用流式细胞技术检测细胞周期。图2为各组细胞周期检测结果。表1为各实验组细胞周期统计结果及增殖系数(PI)比较，PI={(S+G₂/M)÷(G_0/1+S+ G₂/M)}× 100%，结果显示低氧组的增殖系数值大于常氧组。

2.3 低氧微环境对人嗅黏膜间充质干细胞活性的影响 实验各组细胞干预72 h后用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡情况，见图3。结果显示各组存活细胞及总体的凋亡细胞(机械死亡+早期凋亡+晚期凋亡)比例差异无显著性意义。

2.4 Western blot检测各组增殖细胞核抗原的蛋白表达 低氧组中增殖细胞核抗原的蛋白表达最高，抑制剂组的表达介于中间，而常氧组的表达最少，此结果进一步证实了低氧微环境具有促进人嗅黏膜间充质干细胞增殖的作用，见图4。

2.5 低氧微环境下人嗅黏膜间充质干细胞内HIF-1α及其下游靶基因TWIST的表达 低氧组中HIF-1α及其下游靶基因TWIST表达量均显著上调，抑制剂组中的表达量接近于常氧组，而常氧组中HIF-1α及TWIST表达均最低，见图5。

2.6 低氧微环境下人嗅黏膜间充质干细胞内HIF-1α与TWIST的蛋白表达 Western blot检测结果与Q-PCR结果基本一致，低氧组中HIF-1α及TWIST的蛋白表达量均显著上调，与抑制剂组和常氧组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图6。

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引言

随着对干细胞研究的深入，神经损伤修复与再生已成为可能。间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还具有自我复制、造血支持以及免疫调节等功能^[1-2]。间充质干细胞可用于组织修复、器官再生、基因治疗等，被用来解决许多医学难题，如自身免疫性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、神经系统疾病等。现阶段，研究比较广泛的间充质干细胞主要有骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞及脐带间充质干细胞3种，但是这些细胞仍有不少问题存在，如伦理问题、免疫排斥问题以及细胞来源不足等。为寻求得到一种更为理想的间充质干细胞，课题组成功培养出人嗅黏膜间充质干细胞(human olfactory mucosa mesenchymal stem cells，hOM-MSCs)也称为外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells，OE-MSC)^[3-4]。人嗅黏膜间充质干细胞不仅具有一般间充质干细胞的基本特征，因其来源于外胚层，还能更多地向神经元方向分化，是一种用于神经损伤后修复与再生的理想种子细胞。

干细胞的增殖、分化、迁移等生物学特性均是在体内一系列环境因素作用下完成的，影响间充质干细胞增殖、分化、凋亡的因素很多，主要有氧气体积分数、温度、生长因子、pH值等。其中氧气体积分数为非常关键的作用因素，常规细胞体外培养的氧气体积分数约为21%，CO₂体积分数约为5%，而人体正常组织和组织间隙中的氧气体积分数为3%-9%^[5]。有研究已证实了低氧能显著影响骨髓间充质干细胞与人胚胎干细胞的增殖及细胞因子的分泌功能^[6-8]，但低氧对人嗅黏膜间充质干细胞增殖及活性的影响尚未见报道。

作者利用氮气饱和法构建物理性低氧模型，采用体积分数约为3% O₂微环境培养人嗅黏膜间充质干细胞，研究低氧微环境对人嗅黏膜间充质干细胞增殖、凋亡等生物学特性的影响及其相关机制，为人嗅黏膜间充质干细胞后续的定向诱导分化及临床应用提供重要的理论和实验基础。

材料方法

1.1 设计 实验首先对后续所要研究的细胞进行细胞学鉴定，再对低氧微环境下人嗅黏膜间充质干细胞增殖、凋亡及可能存在的相关机制进行实验性研究及分析。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至12月在湖南师范大学第二附属医院神经外科实验室完成，实验室为湖南师范大学重点实验室。

1.3 材料 高糖DMEM-F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125%胰蛋白酶消化液购自美国Gibco公司；Nestin一抗、STRO-1一抗、PCNA一抗、TWIST一抗、HIF-1α一抗及HIF-1α抑制剂(YC-1)均购自Abcom公司；DEPC、EDTA、Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉双丙烯酰胺等均购自Sigma公司；琼脂糖、反转录试剂盒购自北京康为世纪公司；SYBGREEN PCR Mix、Trizol购自Invitrogen公司；DL2000 DNA Marker、dNTP、Taq酶购自北京Genstar公司。

1.4 方法

1.4.1 人嗅黏膜间充质干细胞的取材和培养 鼻中隔偏曲手术患者签署志愿同意书，获取组织块前两三天开始鼻腔内滴入氯霉素眼药水等抗生素进行术前准备，每天三四次。获取组织块时，用丁卡因进行局部麻醉，于中鼻甲内侧根部，取约0.5 cm²×2块组织。获取组织块后用无菌PBS平衡盐溶液(含青霉素200 U/mL和链霉素200 U/mL)漂洗3-5次，将组织块上的血迹洗净为止，再将获取的鼻内组织块转移至体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12培养基中，并用眼科剪剪成0.5 mm³小组织块后立刻转移至离心管内进行离心，离心弃掉上清后接种于培养瓶底部，动作轻柔以便更好地贴壁，待组织块贴壁后缓慢地将培养瓶移至体积分数为5% CO₂、37 ℃培养箱内进行培养。待细胞从组织块里爬出时开始换液，每3 d换液1次，每次换液2 mL，当细胞爬出并增殖到培养瓶底部50%面积时开始传代，实验选用第4代或第5代细胞。

1.4.2 实验分组 实验将第4代人嗅黏膜间充质干细胞分成3组：体积分数为21%O₂组(常氧组)、体积分数为3%O₂组(低氧组)、体积分数为3%O₂+20 µmol/L YC-1(HIF-1α抑制剂)组(抑制剂组)。干预时间均为72 h。

1.4.3 细胞免疫荧光鉴定 对第4代人嗅黏膜间充质干细胞进行细胞免疫荧光鉴定。步骤如下：先使细胞在盖玻片上爬片，用40 g/L多聚甲醛固定15 min；体积分数为0.5% H₂O₂甲醇室温孵育30 min；0.2% Triton X-100室温10 min；山羊血清封闭20 min；兔抗STRO-1(1︰1 000)4 ℃过夜，山羊抗兔荧光二抗20 min，DAPI染核5 min。

1.4.4 人嗅黏膜间充质干细胞表面标记物鉴定 取第4代人嗅黏膜间充质干细胞，用PBS洗涤3次，0.25%胰蛋白酶37 ℃消化后，含血清培养基终止消化，分为每管0.1 mL。阴性对照管加入抗IgG-FITC，IgG-ECD和IgG-PC7；其他管分别加入鼠抗人抗体CD34-ECD，CD45-PC7，CD73-FITC，CD90-FITC，室温孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.4.5 Q-PCR检测目的基因表达 引物设计：在NCBI上搜索目的基因序列，运用primer5软件设计引物，由南京金斯瑞合成引物。human HIF-1α-F：5’-TGC TTG GTG CTG ATT TGT GA-3’；human HIF-1α-R：5’-GGT CAG ATG ATC AGA GTC CA-3’，引物长度210 bp；human TWIST-F：5’-CCA GGT CCT CCA GAG CGA CGA G-3’；human TWIST-R：5’-CCA TCC TCC AGA CCG AGA AGG C-3’，引物长度98 bp；actin-F：5’-CAT CCT GCG TCT GGA CCT GG-3’；actin-R：5’-TAA TGT CAC GCA CGA TTT CC-3’，引物长度116 bp。

各组细胞干预72 h后，Trizol提取细胞总RNA，吸取2 μL RNA溶液于石英比色皿中，用无酶水定容至100 μL，在 260 nm与280 nm处测其吸光度值，并计算其浓度和纯度。RNA浓度(mg/L)=A₂₆₀×稀释倍数×40，RNA纯度= A₂₆₀/A₂₈₀，比值在1.8-2.0之间均可。反转录按试剂盒说明进行操作。PCR 反应总体积为30 μL，包括 cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR H₂O 13 μL，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。反转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20 ℃长期保存。

1.4.6 Western-blot 检测目的蛋白表达 各组细胞干预72 h后，按照BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)使用说明操作，提取细胞总蛋白。根据蛋白定量结果，第一孔加入 maker，其他每孔用 5×loading buffer 配平总量为20 μg上样于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝至凝胶底部时，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。用1×TBST配制5%脱脂奶粉液室温封闭2 h后，将膜浸入，室温放置1 h。再加入一抗4 ℃摇床孵育过夜，用TBST洗膜3次，用1×TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例1∶4 000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45-60 min。孵育结束，1×TBST洗3次，每次15 min。使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3 min，用吸水纸吸尽液体，用保鲜膜包裹杂交膜，在暗盒内与X射线片曝光数秒至数分钟；显影冲洗。

1.4.7 流式细胞周期检测 各组细胞干预72 h后，将细胞用胰蛋白酶消化5 min，离心得细胞沉淀，PBS洗2次或3次，制成单细胞悬液。加入1 mL预冷PBS重悬细胞，800 r/min×5 min，吸净上清，加入400 μL PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，逐滴加入预冷的体积分数为100%乙醇1.2 mL，4 ℃放置过夜固定。取出固定的样品，800 r/min离心5 min，弃上清。加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min，离心收集细胞。重复1次或2次，去除乙醇加入150 μL碘化丙啶工作液，4 ℃避光染色30 min。转至流式检测管，上机检测，排除粘连细胞和碎片后分析荧光直方图上各细胞周期的百分率。

1.4.8 流式细胞凋亡检测 各组细胞干预72 h后，将细胞用胰蛋白酶消化5 min，离心得细胞沉淀，PBS洗2次或3次，制成单细胞悬液(胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性)；用PBS洗涤细胞2次(2 000 r/min离心5 min)收集(1-5)×10⁵细胞；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5-15 min；于1 h内进行荧光显微镜或流式细胞仪观察和检测。

1.5 主要观察指标 实验各组的增殖系数、增殖细胞核抗原的蛋白表达、细胞凋亡情况以及HIF-1α及其下游靶基因TWIST的mRNA和蛋白表达。

1.6 统计学分析 用SPSS 18.0软件包进行t 检验，以双侧α=0.05为检验水准。数据均以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞为分布比较广泛的成体干细胞家族之一，且具有快速增殖及多方向分化的生物学特性。它即可以分化为脂肪组织、骨组织等中胚层的组织细胞，也被证实能够向神经元、胶质细胞等外胚层的细胞分化^[3]。人嗅黏膜间充质干细胞在鼻腔内分布比较广泛，于鼻中隔、上、中、下鼻甲的黏膜内均有分布^[9]。实验采用流式细胞仪检测证实人嗅黏膜间充质干细胞表面不表达CD34、CD45表面标记物，却表达CD73、CD90以及CD105基质细胞标记物，且传至第4代的细胞纯度达97%。嗅黏膜间充质干细胞不仅具有间充质干细胞的一般生物学特性，还有其他诸多优势：①来源稳定，嗅黏膜终生可更新；②细胞提取步骤简单有效；③安全性高，染色体核组分析和肿瘤基因分析显示体外无限传代后没有基因变异^[10]；④避免了伦理和法律问题；⑤自体移植，无免疫排斥反应，而这一点正是许多其他来源种子细胞不能比拟的。此外，嗅黏膜间充质干细胞还具有向内、中、外3个胚层分化的能力^[11]。且与骨髓间充质干细胞比较具有更强的增殖、促髓鞘形成以及轴突延长的能力^[12]。上述诸多优点都使其成为促进神经损伤修复的理想种子细胞。

通常将小于10%体积分数的氧气称为低氧，但此体积分数仍比人体正常组织及组织间隙的氧气体积分数要高，人体正常组织及组织间隙中的氧气体积分数为3%-9%，血液中氧体积分数为1%-13%，而骨髓腔内氧气体积分数仅1%-7%^{[5, 13]}，所以实验选取体积分数3%O2微环境来培养人嗅黏膜间充质干细胞，同时观察研究低氧对其细胞增殖能力及细胞活性的影响。有研究已证实低氧环境下培养能促进间充质干细胞增殖，Wang等^[14]在体外用低氧持续培养骨髓间充质干细胞时发现，低氧能够提高其增殖率；Nekanti等^[15]证实了低氧环境也能促进人Wharton's间充质干细胞的增殖。因此，研究低氧微环境对人嗅黏膜间充质干细胞的影响有重要的临床意义。

Semenza等^[16]在研究缺氧刺激红细胞生成素基因表达时发现一种HIF-1结合蛋白，可通过与低氧反应元素结合，使下游靶基因表达上调。HIF-1具有广泛的靶基因谱：酪氨酸羟化酶(TH)、红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)、基质细胞源性因子1(SDF-1)等，且这些细胞因子能帮助组织和细胞适应低氧微环境，并对细胞和组织起到重要的保护作用^[17-18]。有研究发现在低氧微环境下的细胞培养基中HIF-1高表达，HIF-1高表达对细胞在缺血缺氧环境下有抗凋亡的作用，并且低氧微环境下HIF-1表达上调能够促进细胞自我更新的信号通路激活与抑制凋亡信号通路^[14^，^19]。有研究证实低氧能促进间充质干细胞的增殖主要与HIF-TWIST信号通路和ERK信号通路的激活及调控有关，其中TWIST是HIF-1α下游的靶基因，低氧微环境能使HIF-1α表达上调，进而激活下游靶基因TWIST，细胞内E2A的表达下调可以解除对细胞增殖的抑制作用，TWIST又能与E2A的启动子结合进一步负性调控E2A的表达，从而使细胞处于增殖状态的时期延长^[20-22]。实验结果显示：低氧组比常氧组的增殖系数大(P < 0.05)；采用Western blot检测显示低氧组的增殖细胞核抗原蛋白表达显著增高，常氧组的表达最少，而抑制剂组介于两者之间(P < 0.05)。低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖是否与HIF-TWIST信号通路激活有关，实验通过Q-PCR检测各组HIF-1α 与TWIST mRNA表达，结果显示：低氧组中HIF-1α与TWIST表达量最高，常氧组和抑制剂组中的mRNA表达较低。同时采用Western Blot方法进一步验证了HIF-1α与TWIST蛋白表达，其结果与Q-PCR结果基本一致。因此，可以认为HIF-TWIST信号通路是低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞增殖过程中激活的重要通路之一。促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路是细胞内信号传递网络中的一条关键途径，其在细胞内的基因调控中起着极其重要的作用^[23]。多种细胞功能均与MAPK信号通路有关，包括细胞生长、增殖、分化、炎症反应及细胞凋亡等^[24-25]。在哺乳动物中，存在3个重要的MAPK通路：ERK、JNK、P38MAPK，其中ERK信号途径主要对细胞的生长、分化具有调控作用^[26-27]。有研究证实低氧能够抑制ERK1和ERK2的磷酸化而下调pl6基因，从而抑制了pl6-Rb旁路ROS介导的细胞衰老过程来调控细胞的增殖^[28-29]。ERK信号途径是否与低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞增殖有关，需要进一步研究证实。

目前有研究显示低氧能加速细胞凋亡的进程，Nekanti等^[15]学者研究显示缺血缺氧会导致组织细胞的凋亡。实验采用流式细胞技术检测低氧微环境下培养72 h后的人嗅黏膜间充质干细胞凋亡细胞比例及活细胞比例，研究结果显示：实验各组的存活细胞及总体的凋亡细胞(机械死亡+早期凋亡+晚期凋亡)比例差异均无显著性意义(P < 0.05)。Bax和bcl-2两个基因是人体内各种细胞调控自身凋亡的一对癌基因，其中Bax基因能够加速细胞凋亡进程，而bcl-2基因则能够减慢细胞的凋亡进程。Cao和Zhu等^[30-31]学者采用持续低氧环境培养骨髓间充质干细胞发现：低氧环境下骨髓间充质干细胞内bcl-2表达明显上调，而bax的表达显著下调，所以认为低氧可以通过调节bax与bcl-2而减慢骨髓间充质干细胞的凋亡进程，但其确切机制需要进一步研究探讨。

总之，结合上述实验结果作者认为体积分数为3%O₂的低氧微环境能促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖而对其细胞活性无明显影响，且此过程与人嗅黏膜间充质干细胞内HIF-TWIST信号通路被激活有关。研究低氧微环境对人嗅黏膜间充质干细胞的生物学作用对其在以后细胞替代治疗中的应用具有重要的意义。

低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖及其机制

Hypoxic microenvironment promotes the proliferation of human olfactory mucosa mesenchymal stem cells and its associated mechanism

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