Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.021

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5382-5387.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.021

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Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化

朱喜忠¹，刘子铭²，吴术红¹，熊华章¹，杨继滨¹，李豫皖¹，尤奇¹，金瑛¹，左晨³，刘毅¹

¹遵义医学院附属医院骨科，贵州省遵义市 563000；²重庆医科大学第一附院关节外科，重庆市 400000；³重庆医科大学生命科学院骨再生与发育研究平台，重庆市 400000

修回日期:2017-08-01 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 刘毅，教授，硕士生导师，遵义医学院附属医院骨科，贵州省遵义市 563000
作者简介:朱喜忠，男，1993年生，河南省开封市人，汉族，遵义医学院在读硕士，主要从事干细胞与组织工程，运动医学的研究。
基金资助:
贵州省科技厅联合基金(黔省专合字(2012)172号，黔科合LH字[2016]7477号，和黔科合支撑[2017]2882号)

Enhanced tenogenic differentiation by Scleraxis overexpression in human amniotic mesenchymal stem cells

Zhu Xi-zhong¹, Liu Zi-ming², Wu Shu-hong¹, Xiong Hua-zhang¹, Yang Ji-bin¹, Li Yu-wan¹, You Qi¹, Jin Ying¹,Zuo Chen³, Liu Yi¹

¹Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; ²Department of Orthopaedics, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400000, China; ³Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400000, China

Revised:2017-08-01 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Liu Yi, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Zhu Xi-zhong, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Joint Fund of Guizhou Provincial Science and Technology Department, No. (2012)172, [2016]7477, [2017]2882

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
慢病毒载体：是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。
肌腱：是肌腹两端的索状或膜状致密结缔组织，便于肌肉附着和固定。一块肌肉的肌腱分附在2块或2块以上的不同骨上，是由于肌腱的牵引作用才能使肌肉的收缩带动不同骨的运动。肌腱细胞是肌腱的基本功能单位，它合成和分泌胶原等细胞外基质，维持肌腱组织的新陈代谢。

摘要
背景：Scleraxis作为肌腱细胞特异性表达分子，不仅参与肌腱祖细胞的聚集及分化，还影响肌腱细胞外基质的形成。人羊膜间充质干细胞具有多向分化潜能，在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨及其他结缔组织。
目的：探讨Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞能否向肌腱细胞定向分化并观察其分化效果。
方法：取足月产胎盘羊膜组织，两步酶消化法分离人羊膜间充质干细胞并采用倒置相差显微镜观察和流式细胞鉴定。取第3代细胞分3组进行培养，单纯人羊膜间充质干细胞培养组为空白组，人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染后为过表达组，人羊膜间充质干细胞经不携带Scleraxis基因慢病毒感染后为空质粒组。细胞培养7 d内CCK-8法检测各组细胞增殖能力细胞。细胞培养后3 d和7 d，分别进行实时荧光定量PCR和Western Blot检测评价各组细胞向肌腱细胞定向分化的效果。
结果与结论：①CCK-8检测显示：培养7 d内，过表达组、空质粒组与空白组细胞在增殖能力上无明显差异(P > 0.05)；②Westen blot检测显示：过表达组Scleraxis蛋白表达水平明显高于空质粒组和空白组(P < 0.05)；③实时荧光定量PCR显示：3 d时，过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白及肌腱蛋白C mRNA表达水平明显高于空质粒组(P < 0.05)，而腱调蛋白的表达与空质粒组无明显差异(P > 0.05)；7 d时，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C及腱调蛋白的表达水平明显高于空质粒组(P < 0.05)；④结果提示：人羊膜间充质干细胞经Scleraxis慢病毒基因感染后可向肌腱细胞定向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8116-604X(刘毅)

关键词: 干细胞, 分化, 人羊膜间充质干细胞, Scleraxis, 慢病毒感染, 体外诱导, 肌腱细胞, 定向分化, 慢病毒转染

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) are adult stem cells with multipotential differentiation, which can be induced to differentiate into bone, cartilage and other connective tissues. Meanwhile, as a highly specific marker of tenocytes, Scleraxis is involved in aggregation and differentiation of tendon progenitor cells as well as the formation of tendon extracellular matrix.
OBJECTIVE: To investigate whether hAMSCs have the ability of differentiation into tenocytes by ectopic expression of Scleraxis.
METHODS: Agreed by puerpera, the amniotic membrane from the full-term placenta was separated, and hAMSCs were isolated by a two-step enzyme digestion, observed under inverted phase contrast microscope, and identified by flow cytometry. Passage 3 cells were induced via plasmid-mediated Scleraxis overexpression in overexpression group. Untransfected cells cultured in normal medium served as blank control group, and those with empty plasmid transfection were defined as empty plasmid group. Cell proliferation was tested in each group using cell counting kit-8 within 7 days of culture. Real-time quantitative PCR and western blot were used to assess the tenogenic differentiation of hAMSCs in each group at 3 and 7 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Findings from the cell counting kit-8 indicated that the cell viability had no significant differences among the groups within 7 days of culture (P > 0.05). Western blot results showed the protein expression of Scleraxis in the treatment group was significantly higher than that in the other two groups (P < 0.05). Real-time PCR results showed, at 3 days of culture, the expression of collagen type I, collagen type III, Fibronectin and Tenascin-C in the overexpression group was significantly higher than that in the empty plasmid group (P < 0.05), but the expression of Tenomodulin had no difference (P > 0.05); at 7 days of culture, the expressions of collagen type I, collagen type III, Fibronectin, Tenascin-C and Tenomodulin in the overexpression group were significantly higher than those in the empty plasmid group (P < 0.05). In summary, hAMSCs can be differentiated into tenocytes by ectopic expression of Scleraxis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cell Differentiation, Amnion, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

朱喜忠，刘子铭，吴术红，熊华章，杨继滨，李豫皖，尤奇，金瑛，左晨，刘毅. Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5382-5387.

Zhu Xi-zhong, Liu Zi-ming, Wu Shu-hong, Xiong Hua-zhang, Yang Ji-bin, Li Yu-wan, You Qi, Jin Ying,Zuo Chen, Liu Yi. Enhanced tenogenic differentiation by Scleraxis overexpression in human amniotic mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5382-5387.

图/表（结果） 2

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态及流式细胞学鉴定 倒置相差显微镜显示人羊膜间充质干细胞原代时多成椭圆形、多角形贴壁生长；传代培养后多成长梭形、漩涡状贴壁生长。P3代细胞经流式细胞检测CD44、CD90、CD105、CD73表达阳性；CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR表达阴性(图1)。

2.2 慢病毒包装载体的构建、包装与滴度检测 酶切产物及菌液PCR检测条带符合目的条带大小，目的条带大小为600 bp(图2A，B)；病毒梯度法感染293T细胞96 h后，荧光显微镜观察目的荧光表达量：0.033 μL/孔表达约50%，0.11 μL/孔表达量约80%，0.33 μL/孔表达量约95%(图3 Aa，Bb，Cc)。

2.3 感染人羊膜间充质干细胞检测 6.5 μL病毒原液感染人羊膜间充质干细胞96 h后荧光显示感染率良好(图3 Dd)；实时定量PCR显示过表达组Scleraxis表达量在3 d和7 d均高于空质粒组(P < 0.05)，7 d时Scleraxis表达量高于3 d(P < 0.05)(图2 C)；Westen blot显示过表达组Scleraxis 蛋白表达量明显高于空白组和空质粒组(图2 D)。

2.4 实时荧光定量PCR检测肌腱细胞相关基因表达 组间比较：3 d时，过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白及肌腱蛋白C表达高于空质粒组(P < 0.05)；而腱调蛋白的表达无明显差异(P > 0.05)(图4 A)。7 d时，过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、肌腱蛋白C、纤连蛋白及腱调蛋白表达高于空质粒组(P < 0.05)(图4B)。组内比较：空质粒组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C及肌腱蛋白的mRNA相对表达随时间增加呈逐渐上升趋势，时间点比较均有差异(P < 0.05)(图4C)。过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C及腱调蛋白的mRNA相对表达随时间增加呈逐渐上升趋势，各时间点比较差异均有显著性意义(P < 0.05)(图4D)。

2.5 CCK-8检测细胞活性 各组细胞于培养6 d左右达到增殖高峰，此后保持增殖速度；培养7 d内，各组细胞增殖能力无明显差异(图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年11月至2017年5月在遵义医学院附属医院细胞工程实验室完成。

1.3 材料 实验用1个胎盘来自于遵义医学院附属医院产科足月产产妇，无其他基础疾病，术前已签署知情同意书，符合遵义医学院附属医院伦理委员会要求。

主要试剂和仪器：L-DMEM/F12培养液(美国GIBCO公司)；胰蛋白酶、EDTA、Ⅱ型胶原酶、polybrene及puromycin(美国HYCLONE公司)；CCK-8试剂盒(索莱宝试剂公司)；293T细胞(汉恒生物有限公司)；RNAiso plus、转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本TAKARA公司)；Westen Blot试剂盒(美国BIORAD公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BECKMAN公司)；超净工作台(北京冠鹏净化设备公司)；冷冻离心机(德国EPPENDORF公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；CO₂恒温箱(美国THERMOSCIENTIFIC公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞分离与培养 根据课题组前期研究的方法分离培养人羊膜间充质干细胞。主要操作：收集1个胎盘，将羊膜从胎盘上剥离，PBS反复冲洗，剪成碎片，0.02% EDTA- 0.05%胰蛋白酶消化2次，PBS漂洗后，用0.75 g/L胶原酶，于37 ℃水浴震荡消化2.5-3.0 h，至肉眼看不到羊膜碎片，收集细胞滤液，4 ℃ 1 500 r/min离心6 min。弃上清，用含体积分数10%FBS的L-DMEM/F12培养基重悬细胞、接种，置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱培养。每48 h更换1次培养基，倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

1.4.2 细胞的传代 镜下观察细胞融合率80%-90%时，加入0.125%胰酶置于孵箱中消化3 min，使贴壁细胞脱落、变圆，然后加入等体积含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM/F12培养基终止消化，以1 500 r/min的转速离心6 min，弃上清液，加入LG-DMEM/F12培养基吹打重悬细胞。进行细胞计数，细胞数(/mL)=(4个大格的总数/4)× 10⁴。以1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于75 cm²培养瓶中，人羊膜间充质干细胞传至第3代细胞种板进行试验。

1.4.3 流式细胞术鉴定 取融合率达到85%以上第3代人羊膜间充质干细胞，弃去培养液，PBS清洗3次，加入浓度为0.125%胰酶-0.02%EDTA消化液，放入37 ℃孵箱内消化3 min后，加入等体积终止液终止消化，将消化的细胞吹打混匀，以1 500 r/min的转速离心6 min，弃去上清液，PBS吹打重悬细胞，再以1 500 r/min的转速离心6 min，重复2次，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-1，装入流式管中，每管加入100 μL细胞悬液，室温下避光分别加入鼠抗人单克隆抗体CD44-PE，CD90-FITC，CD105-PerCP-Cy，CD73-APC和阴性对照混合液CD34-PE，CD19-PE，CD45-PE，CD11b-PE，HLA-DR，室温避光孵育30 min，每个流式管中均加入2 mL PBS，充分震荡，1 500 r/min离心6 min，弃去上清，加入250 μL PBS重悬细胞后行流式细胞仪鉴定，计算细胞表面抗原阳性率。

1.4.4 慢病毒包装载体的构建与包装 将pHBLV- CMVIE-ZsGreen-Puro载体及含有酶切位点及3xFlag标签的Scleraxis多核苷酸序列(三博远志生物技术公司)分别经EcoRI、XbaI酶切后纯化(40 μL体系：2 μL载体，1 μL EcoRI，2 μL XbaI，8 μL 10×buffer，27 μL H₂O；37 ℃，作用2 h)，纯化后载体及目的片段用T₄ 连接酶连接后 (20 uL体系：2 uL酶切后片段，100-200 ng酶切后载体，2 μL ligase buffer，1 μL T4 ligase，15 μL H₂O；16 ℃过夜)，使用大肠杆菌DH5α感受态细胞转化后，进行挑单克隆及质粒抽取，测序确定目的片段已转入质粒载体。当293T细胞(贴壁细胞培养法：使用含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM/F12培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱培养；当细胞融合率80%时进行0.125%胰酶消化并传代培养)汇合率约60%时，参照Lipofectamine^TM 2000转染说明书，将空质粒和pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro-3XFLAG-SCX质粒分别与pSPAX2，pMD2G质粒共转染入293T细胞。转染后48、72 h分别收集上清，放入4 ℃离心机，20 000 r/min，离心120 min，用无血清培养液溶解病毒沉淀后分装保存于-80 ℃冰箱。

1.4.5 慢病毒滴度测定与感染人羊膜间充质干细胞 将293T细胞以4×10⁴/孔接种于96孔板，24 h后准备6个EP管，第1个EP管中加入10 μL病毒液，做3倍梯度稀释，共6个稀释度，将病毒稀释液加入培养基中至总体积为100 μL。24 h后，加入完全培养基100 μL。96 h后，观察荧光表达情况，计算荧光(细胞)百分比在10%-30%的孔的病毒滴度。滴度(TU/mL)=细胞数x荧光(细胞)百分比×MOI(1)x病毒稀释倍数×10³。取P3人羊膜间充质干细胞代以3×10⁵/孔接种于6孔板，24 h后当汇合率接近50%-60%时，加入6.5 uL病毒浓缩液及1.2 μL聚凝胺(5 mg/L)，感染24 h后，换液。感染48 h后，将细胞传至10 cm培养皿，待感染后细胞汇合度为60%时，以3.5×10^-3 mg/L浓度的嘌呤霉素对感染细胞进行筛选，从而获得稳定过表达SCX蛋白的人羊膜间充质干细胞。

1.4.6 实验分组 实验共分为3组：单纯人羊膜间充质干细胞培养组为空白组，人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染后为过表达组，人羊膜间充质干细胞经不携带Scleraxis基因慢病毒感染后为空质粒组。各组细胞培养至细胞融合率约80%时进行消化、离心并计数铺板，用于后续实验。

1.4.7 CCK-8检测 取各组细胞，消化并制细胞浓度为1×10⁷ L^-1的细胞悬液，100 μL/孔，同时设置3副孔，加入96孔板，96孔板的四边孔(共36孔)加入100 μL的PBS，于37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱中培养24 h后，向其中5个副孔中小心加入10 μL的CCK-8液，将培养板在培养箱内孵育3.0-4.0 h，酶标仪测定波长为450 nm处的吸光度值，每24 h测定1次，连续测7 d。记录数据并绘制增殖曲线。

1.4.8 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 培养后3 d和7 d分别取各组细胞，PBS洗3遍，标准Trizol法提取各组细胞的RNA。紫外分光光度计检测RNA提取质量。以反转录(RR037A试剂盒，Takara)得到的cDNA为模板, 进行实时荧光定量PCR(RR420A试剂盒，Takara)检测(表1)。以GAPDH为内参，通过2^-^??Ct法计算目标基因相对表达量。引物在NCBI基因库中对比后，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4.9 Western Blot检测蛋白的表达 细胞培养后3 d和7 d分别取各组细胞，PBS冲洗2次。加入细胞裂解液RIPA和PMSF混合液(RIPA∶PMSF=100∶1)，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清液，测定蛋白浓度(BCA蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio)。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。4 ℃下转膜，根据分子量大小选择PVDF膜孔径(0.22 nm和0.45 nm)；封闭牛奶室温作用1 h；弃去封闭液，加兔抗人Scleraxis蛋白抗体4 ℃孵育16-18 h，TBST洗3次，10 min/次，加入鼠抗兔荧光二抗室温孵育2 h，避光洗涤，曝光显影。

1.5 主要观察指标 ①人羊膜间充质干细胞的形态与表型鉴定；②Scleraxis基因慢病的构建与检测；③人羊膜间充质干细胞经Scleraxis基因慢病毒感染后向肌腱细胞定向分化的效果。

1.6 统计学分析 采用SPSS18.0统计软件对数据进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

既往研究报道，人羊膜间充质干细胞增殖能力比骨髓间充质干细胞，且具有高丰度、高活力和高纯度等特点^[13-14]。人羊膜间充质干细胞不仅表达成体干细胞特性且具有低免疫原性并向多系分化的潜能^[15]。实验结果显示倒置相差显微镜下人羊膜间充质干细胞原代时多成椭圆形、多角形或不规则形态，贴壁生长；传代后多成长梭状、漩涡状生长。流式细胞术检测表明，人羊膜间充质干细胞表达 CD44、CD73、CD90、CD105，不表达CD19、CD34、CD45及HLA-DR，符合间充质干细胞的表型特征，这与课题组之前的鉴定结果相同实验结果^[16]。Scleraxis是Ⅰ型basic Helix-Loop-Helix家族的成员,而bHLH家族中转录因子对细胞分化及增殖至关重要^[17-18]。有研究发现Scleraxis在四肢和肌腱形成部位显著表达且一直持续表达于分化的整个时期^[19-20]。因此实验就利用Scleraxis转染人羊膜间充质干细胞，观察Scleraxis能否诱导人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞分化。

Ⅰ、Ⅲ型胶原是肌腱和韧带细胞外基质的主要组成部分，其对肌腱和韧带的强度至关重要^[21]。而肌腱损伤所形成的瘢痕组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显降低，提示Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量对于肌腱损伤修复的重要性^[22]。细胞纤连蛋白是由不同类型的细胞合成的，包括成纤维细胞、星状胶质细胞、早期间充质细胞、巨噬细胞、肥大细胞和培养的上皮细胞等以不同形式沉积于细胞表面、细胞外基质、细胞间隙、基膜和结缔组织中，可使细胞发生黏连并建成组织^[23]。肌腱蛋白C是近年来发现的新型细胞外基质成分之一，主要参与胚胎形成、肿瘤的发生、增殖及其转移，组织创伤后的修复和纤维化及细胞衰老等过程^[24-25]。腱调蛋白是Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要在肌腱和韧带以及骨骼肌的肌外膜中表达，是肌腱分化的特异性标记^[26-27]。当前实验结果显示，人羊膜间充质干细胞在感染后表现出了肌腱特异性增加，即过表达组肌腱特异性蛋白Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C 及腱调蛋白mRNA表达水平较空质粒组升高，提示人羊膜间充质干细胞分化成为成熟的肌腱细胞。值得注意的是，腱调蛋白的mRNA相对表达水平在3 d时无明显差异；而在7 d时发生显著变化，这可能与腱调蛋白的表达时期有关。因为腱调蛋白已被证明为成熟肌腱细胞的特异性分子^[28]。

综上所述，体外Scleraxis的过表达可以促进人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞定向分化，研究丰富了对于肌腱发育的认知，为肌腱损伤修复和重建提供一定的理论基础。但此方法促进人羊膜间充质干细胞分化的长期有效性，植入体内后分泌特异性蛋白的能力等还有待进一步探讨。此外课题组将对Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞定向分化的相关分子机制进行深入研究。

Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化

Enhanced tenogenic differentiation by Scleraxis overexpression in human amniotic mesenchymal stem cells

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