神经干细胞移植帕金森病模型大鼠行为学及对炎症因子的调节效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
神经干细胞移植治疗帕金森的机制：目前尚不清晰，可能包括以下几种方式：补充缺失的神经细胞，改善微环境；促进内源性神经干细胞的分化；抑制神经细胞凋亡，延缓疾病的发展；促进血管再生，重建突触及血脑屏障。
细胞因子与神经干细胞移植的关联：细胞因子构成的炎症免疫微环境与神经干细胞移植效果密切相关，细胞移植后与宿主间发生相互作用，上调或下调特定细胞因子水平，进一步影响细胞的存活、迁移及分化。肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β为常见的促炎性因子，肿瘤坏死因子α可抑制中枢神经的发生，白细胞介素1β可促进神经前体细胞的凋亡。白细胞介素4为抗炎因子，可促进神经再生。干扰素γ虽为促炎因子，但与白细胞介素4联合可促进神经的发生。

摘要
背景：研究证实，干细胞移植可抑制帕金森病模型动物多巴胺能神经元的丧失，改善其行为学症状，具有一定的治疗作用。
目的：观察神经干细胞移植后帕金森病大鼠行为学及炎症因子的变化。
方法：将108只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组及干细胞移植组，每组36只。模型组及干细胞移植组在脑内纹状体内注射6-羟基多巴胺建立帕金森病模型，造模成功后即刻，干细胞移植组于纹状体内注射1×109 L-1的神经干细胞悬液5 μL，模型组注射等量的生理盐水。细胞移植后1，2，4周，3组每个时间点各取大鼠6只，腹腔注射0.5 mg/kg的阿扑吗啡，注射后10 min开始计数旋转圈数，计时5 min；ELISA法检测脑组织内肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、干扰素γ及白细胞介素4水平。
结果与结论：①正常对照组未发生旋转行为。干细胞移植组与模型组出现旋转行为，干细胞移植组于移植后2周开始旋转次数明显减少，干细胞移植组移植后2，4周的旋转次数明显低于模型组(P < 0.05)，且组内移植后2，4周的旋转次数明显低于移植后1周(P< 0.05)；②与正常对照组比较，模型组移植后不同时间点的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，干细胞移植组移植后不同时间点的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平明显降低(P < 0.05)；③与正常对照组比较，模型组移植后不同时间点的干扰素γ、白细胞介素4水平均明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，干细胞移植组移植后1，4周的干扰素γ、白细胞介素4水平均明显升高(P < 0.05)；④结果表明，神经干细胞移植可改善帕金森病大鼠的行为学症状，降低其脑内促炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平，提高抗炎因子白细胞介素4的水平。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3512-7541(周靖)

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 帕金森病, 大鼠, 行为学, 炎症因子

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation can inhibit the loss of dopaminergic neurons and improve behavioral symptoms in an animal model of Parkinson’s disease, which has a certain therapeutic effect.
OBJECTIVE: To observe the changes of behavior symptoms and inflammatory factors in Parkinson’s disease rats after neural stem cell transplantation.
METHODS: Totally 108 Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, model group and stem cell transplantation group, 36 rats in each group. In the model and stem cell transplantation groups, 6-hydroxydopamine was injected into the striatum of rats to establish Parkinson’s disease models, immediately followed by normal saline (5 μL) and 1×10⁹/L neural stem cell suspension (5 μL), respectively. Six rats from each group was taken at each time point (1, 2, 4 weeks after cell transplantation) and subjected to intraperitoneal injection of 0.5 mg/kg apomorphine, followed by a 5-minute rotation test at 10 minutes after injection. ELISA was used to detect the levels of tumor necrosis factor α, interleukin-1β, interferon γ and interleukin-4 in the brain.
RESULTS AND CONCLUSION: Rats in the normal control group had no rotation, while those in the stem cell transplantation and model groups presented with rotation behaviors. Moreover, the number of rotations was dramatically reduced in the stem cell transplantation group at 2 weeks after transplantation, which was significantly lower than that in the model group at 2 and 4 weeks after transplantation (P < 0.05). In both model and stem cell transplantation groups, the number of rotations was reduced significantly at 2 and 4 weeks as compared with that at 1 week after transplantation (P < 0.05). Compared with the normal control group, the levels of tumor necrosis factor α and interleukin-1β were significantly increased in the model group at different time after cell transplantation (P < 0.05); compared with the model group, these levels were significantly decreased at different time after stem cell transplantation (P < 0.05). Compared with the normal control group, the levels of interferon γ and interleukin-4 were significantly increased in the model group at different time after transplantation; compared with the model group, these levels were significantly increased at 1 and 4 weeks after stem cell transplantation (P < 0.05). To conclude, neural stem cell transplantation can improve the behavior symptoms of Parkinson’s disease rats, decrease the levels of tumor necrosis factor α and interleukin 1β (pro-inflammatory factors), and increase the levels of interferon γ and interleukin-4 (anti-inflammatory factors).

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Parkinson Disease, Neurobehavioral Manifestations, Tumor Necrosis Factor-alpha, Interleukin-1beta, Interleukin-4, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

周靖，包丽雯，梁静. 神经干细胞移植帕金森病模型大鼠行为学及对炎症因子的调节效应[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5299-5304.

Zhou Jing, Bao Li-wen, Liang Jing. Behavior improvement and inflammatory regulation in Parkinson’s disease rats after neural stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5299-5304.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 108只大鼠均进入结果分析。

2.2 神经干细胞移植对帕金森病大鼠行为学的影响 正常对照组未发生旋转行为。干细胞移植组与模型组出现旋转行为，干细胞移植组于移植后2周开始旋转次数明显减少，干细胞移植组移植后2，4周的旋转次数明显低于模型组(P < 0.05)，且移植后2，4周的旋转次数明显低于移植后1周(P < 0.05)，见图1。

2.3 神经干细胞移植对帕金森病大鼠脑内肿瘤坏死因子α水平的影响 与正常对照组比较，模型组移植后不同时间点的肿瘤坏死因子α水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，干细胞移植组移植后不同时间点的肿瘤坏死因子α水平明显降低(P < 0.05)；与正常对照组比较，干细胞移植组移植后2周的肿瘤坏死因子α水平明显降低(P < 0.05)，其余时间点两组间比较差异无显著性意义，见表1。

2.4 神经干细胞移植对帕金森病大鼠脑内白细胞介素1β水平的影响 与正常对照组比较，模型组移植后不同时间点的白细胞介素1β水平均明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，干细胞移植组移植后不同时间点的白细胞介素1β水平均明显降低(P < 0.05)；与正常对照组比较，干细胞移植组移植后2，4周的白细胞介素1β水平变化较大(P < 0.05)，见表2。

2.5 神经干细胞移植对帕金森病大鼠脑内干扰素γ水平的影响 与正常对照组比较，模型组移植后不同时间点的干扰素γ水平均明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，干细胞移植组移植后1，4周的干扰素γ水平均明显升高(P < 0.05)，移植2周时两组间比较差异无显著性意义；与正常对照组比较，干细胞移植组移植后不同时间点的干扰素γ水平均明显升高(P < 0.05)，见表3。

2.6 神经干细胞移植对帕金森病大鼠脑内白细胞介素4水平的影响 与正常对照组比较，模型组移植后不同时间点的白细胞介素4水平均明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，干细胞移植组移植后1，4周的白细胞介素4水平均明显升高(P < 0.05)，移植2周时两组间比较差异无显著性意义；与正常对照组比较，干细胞移植组移植后不同时间点的白细胞介素4水平均明显升高(P < 0.05)，见表4。

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引言

帕金森病是好发于中老年的神经系统变性疾病，以男性多见，主要表现为静止性震颤、动作迟缓、肌张力增高、姿势不稳等。由于帕金森病的确切发生发展机制还不十分清楚，到目前为止仍没有有效阻止帕金森病发生和发展的方法。现阶段的药物治疗和脑深部电刺激术均以控制和改善症状为治疗目的，不能阻止神经元的持续变性。因此，目前学者们致力于细胞移植治疗^[1-10]，如：谢姜等^[1]采用人脐带间充质干细胞源多巴胺分泌细胞移植治疗帕金森模型大鼠，发现人脐带间充质干细胞源多巴胺分泌细胞可改善阿扑吗啡诱发的帕金森模型大鼠的旋转行为，并认为可能与提高毁损侧纹状体内多巴胺、胶质细胞源性神经营养因子表达水平，保护神经元有关；马国祥等^[2]采用脐血干细胞源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病模型大鼠，结果发现帕金森模型大鼠的症状明显减轻，行为明显改善；肖振勇等^[3]采用人胎盘底蜕膜间充质干细胞纹状体移植治疗帕金森病模型大鼠，结果发现人胎盘底蜕膜间充质干细胞移植能够抑制帕金森病模型大鼠多巴胺能神经元丧失，改善大鼠的行为学症状，具有一定的治疗作用；王晓晓等^[4]发现慢病毒介导核受体相关因子1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的行为学症状明显改善，大鼠脑内纹状体和黑质区核受体相关因子1和酪氨酸羟化酶的表达明显增加。

神经干细胞具有与中枢神经系统神经细胞相似生物学特性，即自我更新和多向分化能力，并且能够通过对称分裂和不对称分裂维持自身的稳定。张海龙等^[5]移植EGFP基因修饰胎中脑神经干细胞可改善帕金森病大鼠的运动障碍。但是神经干细胞移植治疗帕金森病也有诸多局限，分化为多巴胺能神经元比率较低，体内存活能力较差，与其所处局部微环境密切相关，研究发现干细胞与宿主损伤组织间的相互作用可导致一些炎症因子的表达变化，这些因子的变化对神经功能的恢复发挥着积极的作用^[6]。实验采用神经干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠，观察帕金森病模型大鼠行为学及炎症因子的变化，以期为帕金森病的临床治疗提供依据。

材料方法

1.1 设计 随机分组，对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年10月至2017年1月在湖北职业技术学院医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 三四月龄SD大鼠108只，雌雄不限，体质量200-230 g，由湖北职业技术学院医学院实验动物中心提供，随机分为正常对照组、模型组及干细胞移植组，每组36只。

1.3.2 主要试剂与仪器 鼠神经干细胞(上海易路安生物科技有限公司)；6-羟基多巴胺、阿扑吗啡、戊巴比妥钠(Sigma公司)；ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；脑立体定向仪(上海玉研科学仪器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 建立帕金森病模型 取模型组与干细胞移植组大鼠，以戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠，将头固定于脑立体定位仪上，消毒，除去头顶部毛，剪开皮肤，去除结缔组织，充分暴露前后囟，参照大鼠立体定位图谱，在大鼠右侧纹状体内两点注射6-羟基多巴胺，每点4 μL，1 μL/min缓慢注射，注射完毕后留针6 min再拔针^[7]。

造模成功标准：术后第7天，开始进行旋转测试：向大鼠腹腔注射0.5 mg/kg阿扑吗啡，10 min后开始记录旋转圈数，计时5 min，以后每周1次，连续测试6次，以每分钟向左侧旋转圈数≥7圈作为建模成功的标准。对于造模失败的大鼠则按照相同造模方式给予补足。

1.4.2 神经干细胞的复苏与培养

复苏细胞：将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37 ℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4 mL培养基混合均匀。1 000 r/min离心4 min，弃去上清液，添加1.0-2.0 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10 cm培养皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜)。第2天换液并检查细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达80%-90%时，即可进行传代培养。取生长状态良好的第3代神经干细胞进行移植实验。

1.4.3 神经干细胞移植 造模成功后即刻，以戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠，将头固定于脑立体定位仪上，参照大鼠立体定位图谱，干细胞移植组于右侧纹状体内注射1×10⁹ L^-1的神经干细胞悬液5 μL，模型组注射等量的生理盐水。

1.5 主要观察指标

1.5.1 行为学检测 细胞移植后1，2，4周，3组每个时间点各取大鼠6只，腹腔注射0.5 mg/kg的阿扑吗啡，进行旋转测试，注射后10 min开始计数旋转圈数，并计数5 min。

1.5.2 ELISA法检测脑内炎症因子水平 细胞移植后1，2，4周，3组每个时间点各取大鼠6只，以戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠，处死后取脑，所有操作均在冰上进行，分离出纹状体，称质量，加入组织裂解液、蛋白酶抑制剂、PMSF，匀浆，冰上裂解30 min后，移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心20 min，取上清液冻存备用。使用BCA蛋白定量试剂盒进行组织蛋白定量，按说明书操作稀释标准品及绘制标准曲线，计算出样品浓度，将所有样品冻存备用。严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、干扰素γ及白细胞介素4水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，检测数据以x(_)±s表示，多组资料比较采用重复测量方差分析，两组间结果比较采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前用于治疗帕金森病的干细胞主要有间充质干细胞、胚胎干细胞及神经干细胞^[8-17]。神经干细胞具有较强的增殖及分化能力，不易成瘤，免疫原性低，是干细胞治疗理想的首选细胞之一^[18-21]。因此实验选择神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠。目前神经干细胞移植治疗帕金森病的机制尚不清晰，可能包括以下几种方式^[22-25]：补充缺失的神经细胞，改善微环境；促进内源性神经干细胞的分化；抑制神经细胞凋亡，延缓疾病的发展；促进血管再生，重建突触及血脑屏障。

研究显示，神经干细胞移植可显著改善帕金森病患者的运动功能障碍^[26-27]。刘定华等^[28]将42例帕金森病患者采用随机数字表法分为移植组及对照组，两组均给予常规药物治疗及康复干预，移植组在此基础上辅以自体骨髓来源神经干细胞移植治疗，于治疗前、治疗4周、治疗后3个月时采用帕金森病综合评分量表(UPDRS)对两组患者进行疗效评定，结果显示，治疗4周、治疗后3个月的帕金森病综合评分量表评分均低于治疗前(P < 0.05)，并且移植组治疗不同时间点的帕金森病综合评分量表评分明显低于对照组(P < 0.05)，证实自体骨髓来源神经干细胞移植可显著改善帕金森病患者的症状；王明国等^[29]采用多巴胺神经元联合中脑神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠，同样发现细胞移植能显著改善帕金森病大鼠的运动障碍。本研究采用腹腔注射0.5 mg/kg的阿扑吗啡诱导帕金森病大鼠旋转，发现干细胞移植组于移植后2周开始旋转次数明显减少，干细胞移植组移植后2，4周的旋转次数明显低于模型组(P < 0.05)，且组内移植后2，4周的旋转次数明显低于移植后1周(P < 0.05)，亦证明了神经干细胞移植可显著改善帕金森病大鼠的行为学症状。以上研究显示，神经干细胞移植在改善帕金森病运动障碍方面具有确定的疗效。

研究发现，细胞因子构成的炎症免疫微环境与神经干细胞移植效果密切相关，细胞移植后与宿主间发生相互作用，上调或下调特定细胞因子水平，进一步影响细胞的存活、迁移及分化^[30-39]。肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β为常见的促炎性因子，肿瘤坏死因子α可抑制中枢神经的发生^[40-41]，白细胞介素1β可促进神经前体细胞的凋亡^[42-45]。白细胞介素4为抗炎因子，可促进神经再生。干扰素γ虽为促炎因子，但与白细胞介素4联合可促进神经的发生^[46-47]。实验结果显示，模型组大鼠脑内肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平较正常对照组明显升高(P < 0.05)，说明帕金森病发生后，大鼠脑内肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平升高；干细胞移植后，肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平较模型组明显降低(P < 0.05)，说明神经干细胞移植可显著抑制肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平的升高，减轻炎症水平；相对于模型组，干细胞移植组移植后1，4周的干扰素γ、白细胞介素4水平均明显升高(P < 0.05)，说明神经干细胞移植后，抗炎因子白细胞介素4的升高抑制了促炎因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β的升高，同时结合少量的干扰素γ影响脑内细胞和免疫微环境，进而影响细胞的移植状态，改善大鼠的行为学症状。

实验也有不足之处，未检测神经干细胞移植后的分化情况，后期将分析神经干细胞移植后分化情况与炎症因子及行为学的关联。

综上所述，神经干细胞移植可改善帕金森病大鼠的行为学症状，降低其脑内促炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平，提高抗炎因子白细胞介素4的水平。