丹参注射液对神经干细胞移植治疗颅脑损伤的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.020

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
神经干细胞移植治疗脑损伤：神经干细胞是一种可向神经元分化的干细胞，该细胞还可以进行自我更新和自我维持，并分泌多种神经因子以改善颅脑损伤。但是由于神经干细胞在移植过程中存活有限，其移植的治疗效果也受到了较大限制。而丹参注射液则可通过增殖神经干细胞促进后者移植的疗效。
丹参的功效：丹参可以缓解内皮损伤，抵抗炎症反应，改善微循环，调节糖脂体内代谢，此外研究表明。丹参在治疗神经性疾病方面疗效显著。丹参提取液可显著提高神经干细胞的增殖活性，改善神经干细胞移植的存活。

摘要
背景：丹参提取液可显著提高神经干细胞的增殖活性，改善神经干细胞移植的存活。
目的：探讨丹参注射液对神经干细胞蛛网膜下腔移植治疗大鼠颅脑损伤的影响。
方法：选取87只成年SD大鼠制成重型液压颅脑损伤模型，将建模成功的80只随机分4组干预，
脑损伤组蛛网膜下腔注射DMEM培养液，1次/d；丹参注射液组腹腔注射丹参注射液，1次/d；干细胞组蛛网膜下腔注射CM-Dil标记的神经干细胞悬液，1次/d；联合组蛛网膜下腔注射CM-Dil标记神经干细胞细胞悬液的同时腹腔注射丹参注射液，1次/d，各组连续干预3 d。干预后3 d及1，2，3，4周行神经学缺损评分；干预21-28 d进行为期7 d的Morris水迷宫实验；干预后4周进行脑组织病理组织学观察、神经干细胞存活与分布观察、RT-PCR及Western blot检测。
结果与结论：①神经学缺损评分：联合组神经学缺损评分始终优于其余3组(P < 0.05)；②Morris水迷宫实验：联合组干预后3-5 d的平均潜伏时间明显短于其他3组(P < 0.05或P < 0.01)，穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于其他3组(P < 0.05或P < 0.01)；③脑组织病理组织学观察：脑损伤组可见脑损伤区组织空洞明显，丹参注射液组、干细胞组脑损伤区组织空洞较小，联合组脑损伤区组织空洞几乎消失；④神经干细胞存活与分布：联合组CM-Dil标记阳性细胞数多于干细胞组；⑤RT-PCR及Western blot检测：联合组脑组织突触素及生长相关蛋白43表达高于其他3组(P < 0.05)，丹参注射液组、干细胞组高于脑损伤组(P < 0.05)；⑥结果表明：丹参注射液联合神经干细胞蛛网膜下腔移植可能通过促进大鼠脑损伤区脑组织突触素及生长相关蛋白43 的表达，改善重型颅脑损伤模型大鼠的神经功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3252-1452(刘晓)

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 丹参注射液, 移植, 颅脑损伤, 突触素, 生长相关蛋白43, 蛛网膜下腔

Abstract:

BACKGROUND: Danshen injection can dramatically enhance the proliferation and survival of neural stem cells (NSCs) after transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Danshen injection with NSCs transplantation in rats with craniocerebral injury.
METHODS: Eighty-seven adult Sprague-Dawley rats were used to build severe traumatic brain injury models. After successfully modeling, the model rats were randomized into craniocerebral injury group (the subarachnoid injection of DMEM medium; n=20), Danshen injection group (the intraperitoneal injection of Danshen injection; n=20), and NSCs group (the subarachnoid injection of CM-Dil-labeled NSCs suspension; n=20) and combined group (intraperitoneal injection of Danshen injection plus the subarachnoid injection of CM-Dil-labeled NSCs suspension; n=20). The injection in each group was performed once a day for 3 consecutive days. The modified neurological severity scores were tested after 3 days, 1, 2, 3 and 4 weeks of the transplantation. The Morris water maze test was performed at 21-28 days of transplantation. NSCs survival and distribution were detected by fluorescence microscope and the pathologic changes of brain tissues were observed at 4 weeks after intervention. The expressions of synaptophysin and growth associated protein 43 at gene and protein levels were tested in the brain injury zone by RT-PCR and western blot assay respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The modified neurological severity scores in the combined group were significantly lower than those in the other groups (P < 0.05). In the Morris water maze test, the average escape latencies in the combined group was significantly shortened in the combined group after 3-5 days of transplantation in comparison with the other three groups (P < 0.05 or P < 0.01); the frequency of passing through the platform and the percentage of the swimming distance at the target quadrant in the total swimming distance were significantly higher in the combined group than in the other groups (P < 0.05 or P < 0.01). The hematoxylin-eosin staining results showed the tissue voids in the Danshen injection and NSCs group were relatively smaller than those in the craniocerebral injury group, and the voids almost disappeared in the combined group. There were more CM-Dil positive cells in the combined group than the NSCs group. RT-PCR and western blot assay showed that the gene and protein expression levels of synaptophysin and growth associated protein 43 in the combined group were the highest followed by NSCs and Danshen injection groups, and the lowest expression levels were observed in the craniocerebral injury group. In summary, the Danshen injection combined with the NSCs transplantation can improve the neurological function of rats with severe craniocerebral injury, which might function by increasing the expression levels of synaptophysin and growth associated protein 43.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Neural Stem Cells, Drugs, Chinese Herbal, Cell Transplantation

中图分类号:

R394.2

刘晓，王虎. 丹参注射液对神经干细胞移植治疗颅脑损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4709-4715.

Liu Xiao, Wang Hu. Effect of Danshen injection with neural stem cells transplantation in rats with craniocerebral injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4709-4715.

图/表（结果） 2

2.1 神经干细胞的形态观察 培养1 d后，神经干细胞增多、较小、形状不规则，小部分细胞团贴壁；培养5 d后，神经干细胞增多，为较大、形状规则的球形，见图1A。免疫荧光染色显示，神经干细胞球呈CM-Dil强阳性表达。神经干细胞的标记，CM-Dil标记的神经干细胞在荧光显微镜下呈红色荧光，见图1B。研究证实，CM-DiI标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达97%以上，标记细胞形态良好，能有效观察细胞在体外的诱导分化情况。

2.2 神经学缺损评分检测结果 从整个神经学功能障碍评分实验期看来，随着细胞移植干预后时间的延长，各组大鼠神经功能均在逐渐恢复正常。在干细胞移植3 d之后，联合组神经学缺损评分显著低于其他各组(P < 0.05)，丹参注射液组和干细胞组干预后2，3，4周的神经缺损评分显著低于脑损伤组(P < 0.05)，见表1。

2.3 Morris水迷宫实验结果 Morris水迷宫实验中，随着实验时间的延长，各组大鼠平均逃逸潜伏期潜伏时间逐渐缩短；实验开始的一二天，各组之间无显著差异(P > 0.05)；3-5 d时，联合组平均潜伏时间较丹参注射液组及神经干细胞移植组缩短(P < 0.05)，较脑损伤组明显缩短(P < 0.01)；六七天时，各组间差异较小，见表2。

联合组穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于丹参注射液组及干细胞组(P < 0.05)，明显高于脑损伤组(P < 0.01)，见表3。

2.4 苏木精-伊红染色观察病理学改变 脑损伤组大鼠脑组织疏松，损伤区的空洞较为明显，细胞之间的间隙增大，神经细胞的胞体皱缩，神经细胞出现坏死崩解；与颅脑损伤组相比，丹参注射液组及干细胞组脑损伤区组织空洞较小，坏死崩解的神经细胞较少，而联合组脑损伤区组织空洞几乎消失，见图2。

2.5 神经干细胞存活及分布情况 神经干细胞移植4周之后在CM-Dil阳性细胞方面，联合组的(26.37±3.41)%显著高于干细胞组(12.67±2.07)%、脑损伤组(0)及丹参注射液组(0)，见图3。

2.6 各组突触素及生长相关蛋白43基因转录的表达 联合组突触素及生长相关蛋白43表达显著高于脑损伤组、丹参注射液组和干细胞组(P < 0.05)，干细胞组、丹参注射液组突触素及生长相关蛋白43表达高于脑损伤组(P < 0.05)，见图4。

2.7 各组突触素及生长相关蛋白43蛋白的表达 联合组突触素及生长相关蛋白43高于其他3组(P < 0.05)，干细胞组、丹参注射液组突触素及生长相关蛋白43表达高于脑损伤组(P < 0.05)，见图5。

参考文献

[1] Diaz-Arrastia R,Kenney K.Epidemiology of traumatic brain injury.Handb Clin Neurol.2015;127:3-13.

[2] Haring RS,Narang K,Canner JK,et al.Traumatic brain injury in the elderly:morbidity and mortality trends and risk factors.J Surg Res.2015;195(1):1-9.

[3] Fernandezrodriguez E,Bernabeu I,Castro AI,et al. Hypopituitarism after traumatic brain injury.Endocrinol Metab Clin North Am.2015;44(1):151-159.

[4] 黄卫,岑丹辉,黄远德.颅脑损伤治疗进展[J].基层医学论坛,2014, 18(1):107-109.

[5] Yoshida Y,Yamanaka S.Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell–based regeneration. Circulation. 2010;122(1): 80-87.

[6] 刘伟.神经干细胞研究进展及前景[J].科技信息,2011,28(16): 10172-10172.

[7] Gage FH,Temple S.Neural stem cells:generating and regenerating the brain.Neuron.2013;80(3):588-601.

[8] 贾璐,闫春华,吴丽娥.神经干细胞研究进展[J].医学综述, 2010,16(8):1149-1151.

[9] Kim SU.Neural stem cell-based gene therapy for brain tumors.Stem Cell Rev Rep.2011;7(1):130-140.

[10] 方庆,陈新生.神经干细胞相关研究进展[J].中国医药指南, 2011,9(8):44-46.

[11] Xie C,Cong D,Wang X,et al.The effect of simvastatin treatment on proliferation and differentiation of neural stem cells after traumatic brain injury.Brain Res.2014;1602:1-8.

[12] Ahmed A,Shtaya A,Zaben M,et al.Activation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.Lancet.2014；383(383):S18.

[13] Goodus MT,Guzman AM,Calderon F,et al.Neural stem cells in the immature,but not the mature,subventricular zone respond robustly to traumatic brain injury.Dev Neurosci.2015;37(1): 29-42.

[14] Liu S,Li Z,Fu J,et al.The effects of harvesting media on biological characteristics and repair potential of neural stem cells after traumatic brain injury.Plos One.2014;9(9): e107865-e107865.

[15] Ye YQ,Xu HY,Zhang X,et al.Association between Toll-Like Receptor 4 Expression and Neural Stem Cell Proliferation in the Hippocampus Following Traumatic Brain Injury in Mice.Int J Mol Sci.2014;15(7):12651-12664.

[16] Jiang S,Chen W,Zhang Y,et al.Acupuncture Induces the Proliferation and Differentiation of Endogenous Neural Stem Cells in Rats with Traumatic Brain Injury.Evid Based Complement Alternat Med.2016;2016(4):1-8.

[17] Thomaidou D.Neural Stem Cell Transplantation in an Animal Model of Traumatic Brain Injury.Methods Mol Biol. 2014; 1210: 9-21.

[18] Haus DL,López-Velázquez L,Gold EM,et al.Transplantation of human neural stem cells restores cognition in an immunodeficient rodent model of traumatic brain injury.Exp Neurol.2016;281:1-16.

[19] Aligholi H,Rezayat SM,Azari H,et al.Preparing neural stem/progenitor cells in PuraMatrix hydrogel for transplantation after brain injury in rats:A comparative methodological study.Brain Res.2016;1642:197-208.

[20] Addington CP,Heffernan JM,Millarhaskell CS,et al.Enhancing neural stem cell response to SDF-1α gradients through hyaluronic acid-laminin hydrogels. Biomaterials.2015; 72: 11-19.

[21] 樊欣鑫,李宇龙,万兴,等.神经干细胞移植治疗颅脑损伤后神经功能缺失的研究进展[J].现代医学,2013,41(4):274-278.

[22] 刘兴华.神经干细胞移植在颅脑损伤后神经功能缺失中的应用研究进展[J].中国处方药,2015,13(10):20-21.

[23] 赵宁,杨万章,李娇,等.丹参注射液对脑梗死患者自体外周血干细胞旁分泌BDNF的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013 11(1):49-51.

[24] 赵宁,陆琳,杨万章,等.丹参注射液对急性脑梗死大鼠脑组织VEGF表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013,11(5): 584-586.

[25] 林惠,杨万章.丹参注射液对脑梗死大鼠SVZ干细胞增殖作用的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2014,12(3):350-352.

[26] Wang Y,Jiang YF,Huang QF,et al.Neuroprotective effects of salvianolic acid B against oxygen-glucose deprivation/ reperfusion damage in primary rat cortical neurons.Chin Med J(Engl).2010;123(24):3612-3619.

[27] 林惠.丹参注射液干预脑梗死大鼠SVZ干细胞增殖作用的研究[D].湖南中医药大学,2014.

[28] 周学萍.重型颅脑损伤诊治进展[J].当代医学,2011,17(28): 20-21.

[29] 李坚.重型颅脑损伤的治疗进展[J].齐齐哈尔医学院学报,2011, 32(2):317-319.

[30] 刘旭.颅脑损伤治疗的进展研究[J].中国实用神经疾病杂志,2011, 14(17):89-91.

[31] 黄海亮.丹参的化学成分分离及其抗氧化活性研究[J].中国现代药物应用,2015,9(21):277-278.

[32] 贾巧.丹参制剂及桑白皮的抗氧化药效评价[D].重庆大学,2014.

[33] 朱黎霞,王利胜,张英丰.丹参总酚酸、山楂总黄酮组分配伍对高脂血症大鼠血脂、超氧化物歧化酶及丙二醛的影响[J].中国医药导报,2014,11(20):9-12.

[34] 周茹,何耀,和丽芬,等.丹参水提物对大鼠心肌缺血-再灌注损伤氧化应激的影响[J].中药药理与临床,2014,30(2):76-78.

[35] Lim DA,Alvarez-Buylla A.Adult neural stem cells stake their ground.Trends Neurosci.2014;37(10):563-571.

[36] Kosztowski T,Zaidi HA,Quiñoneshinojosa A.Applications of neural and mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.Expert Rev Anticancer Ther.2014;9(5):597-612.

[37] Bond AM,Ming GL,Song L,et al.Adult Mammalian Neural Stem Cells and Neurogenesis:Five Decades Later.Cell Stem Cell.2015;17(4):385-395.

[38] Gnanapavan S,Yousaf N,Heywood W,et al.Growth associated protein (GAP-43):Cloning and the development of a sensitive ELISA for neurological disorders.J Neuroimmunol. 2014; 276(1-2):18-23.

[39] 韦理,张俐.丹参注射液对急性脊髓损伤大鼠突触体素和突触素的作用及机制[J].中华中医药杂志,2013,28(6):1870-1872.

[40] 郭怀兰,张吉才,王建洲,等.碘过量对仔鼠脑突触素表达影响及硒干预作用[J].中国公共卫生,2010,26(1):91-92.

[41] Griva M,Lagoudaki R,Touloumi O,et al.Long-term effects of enriched environment following neonatal hypoxia-ischemia on behavior, BDNF and synaptophysin levels in rat hippocampus: Effect of combined treatment with G-CSF.Brain Res. 2017.pii: S0006-8993(17)30184-1.

[42] Xia WG,Zheng CJ,Zhang X,et al.Effects of "nourishing liver and kidney" acupuncture therapy on expression of brain derived neurotrophic factor and synaptophysin after cerebral ischemia reperfusion in rats.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci.2017;37(2):271-278.

[43] Xiao Z,Peng J,Wu L,et al.The effect of IL-1β on synaptophysin expression and electrophysiology of hippocampal neurons through the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in a rat model of mesial temporal lobe epilepsy. Neurol Res. 2017:1-9.

[44] Chen YY,Zhang L,Shi DL,et al.Resveratrol Attenuates Subacute Systemic Inflammation-Induced Spatial Memory Impairment via Inhibition of Astrocyte Activation and Enhancement of Synaptophysin Expression in the Hippocampus.Ann Clin Lab Sci.2017;47(1):17-24.

[45] Li X,Wang C,Wang W,et al.Neonatal exposure to BDE 209 impaired learning and memory, decreased expression of hippocampal core SNAREs and synaptophysin in adult rats.Neurotoxicology. 2017;59:40-48.

[46] Matsukuma K,Olson KA,Gui D,et al.Synaptophysin-Ki67 double stain: a novel technique that improves interobserver agreement in the grading of well-differentiated gastrointestinal neuroendocrine tumors. Mod Pathol.2017;30(4):620-629.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年1月至2016年10月在天津医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：2月龄健康成年SD大鼠87只，体质量约 300 g，雌雄各半，由天津医科大学动物实验室提供，生产许可证：SCXK(津)2013-0003，实验动物使用许可证号：SYXK(津)2013-0076。所有大鼠于室温25 ℃、湿度50%-80%、SPF环境下自由饮水和采食。

主要试剂及仪器：胰蛋白酶由美国Sigma公司购进；细胞培养箱购买自Heraeus Sepatech 公司；DMEM培养基、胎牛血清和PBS均购自Hyclone；Trizol试剂盒购自Invitrogen；BCA蛋白浓度测试试剂盒(增强型)、5×SDS蛋白上样缓冲液、20×TBS缓冲液等均购买于南京建成生物；细胞处理等过程中使用的超净工作台提供自艺斯高上海贸易有限公司；生长相关蛋白43、突触素一抗为兔抗人多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔多克隆抗体，GAPDH一抗为单克隆小鼠抗人抗体，GAPDH的二抗为HRP标记的山羊抗小鼠的多克隆抗体，所有抗体都购于艾康生物技术(杭州)有限公司；丹参注射液购买自四川升和药液股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 建立大鼠模型及实验分组 取87只成年SD大鼠，制作重型液压颅脑损伤模型。所有大鼠均根据重型颅脑损伤国际标准采用液压颅脑损伤仪给与其高压冲击，构建重型液压颅脑损伤模型。

造模后根据大鼠的感觉和运动能力将之分为6级：1级，在笼内亦可以正常活动；2级，活动量减少；3级，活动量明显减少且运动失调；4级，背部放在笼底时可以正常滚动，但不能站立；5级，背部触底后不可翻滚，但具有肢体疼痛回缩反应；6级，对任何刺激无反应。实验以4级和5级损伤作为纳入标准。在建模过程若出现大鼠自主呼吸困难，立即对其实施小动物面罩吸氧进行抢救。在该过程当场死亡2只大鼠，建模后12 h死亡5只，造模成功大鼠为80只。将筛选存活下来的80只大鼠随机分为4组：脑损伤组、丹参注射液组、干细胞组及联合组，每组20只。

1.4.2 神经干细胞的体外培养及CM-Dil标记 将购买自中国医学科学院的冻存原代神经干细胞置于60 ℃恒温水浴箱，30 s内进行神经干细胞快速复苏。将融化之后的神经干细胞迅疾转入EP管并加入DMEM培养基，并且多次重复小心吹打细胞使其均匀分布，随后离心弃上清液。将复苏后的细胞用DMEM完全培养基调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹。培养3代后，胰蛋白酶溶液消化2.0-3.0 min后终止消化；离心弃上清重悬细胞。调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，培养7 d。经过3次洗涤之后将神经干细胞浓度调整到8×10⁸ L^-¹，随后向细胞悬液中精确加入5 μL CM-DiL进行目标细胞标记；随后置于培养箱中标记孵化25-30 min，离心弃上清，PBS重悬，重复标记2次，显微镜下观察细胞标记的情况。镜下可见神经干细胞标记显现出鲜艳的橘红色且颜色均匀，备用。

脑损伤后24 h，脑损伤组从枕骨大孔处以1 μL/min的注射速度蛛网膜下腔注射10 μL细胞培养液，1次/d；丹参注射液组腹腔注射丹参注射液0.5 g/kg，1次/d；干细胞组蛛网膜下腔缓慢注入10 μL神经干细胞悬液(3×10⁶ L^-¹)，1次/d；联合治疗组蛛网膜下腔缓慢注入10 μL神经干细胞悬液(3×10⁶ L^-¹)的同时腹腔注射丹参注射液0.5 g/(kg·d)，1次/d，各组连续干预3 d。

1.5 主要观察指标

1.5.1 干预后3 d及1，2，3，4周行动物神经学缺损评分测试 神经学缺损NSS评分参考5分制评分体系进行操作，分别于干预后3 d和1-4周(每周最后1 d)测定，其评分标准为：0分，无神经系统损伤体征，1分，手术对侧前爪有明显的伸直障碍；2分，向手术对侧转圈；3分，向手术对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。

1.5.2 干预后21-28 d行Morris水迷宫实验 首先向水迷宫装置中加入大约1 kg奶粉，随后加水使其高度超过安全平台大约1 cm。随后在水迷宫的池壁上标记4个入水点(根据东西南北的方位分别标记1，2，3，4)；依照4个出水点将水迷宫的水池均等分为4个象限并将安全平台置于东北象限离箱壁15 cm的地方以备实验。迷宫上方安置与电脑系统相连接的摄像机,可同步记录大鼠运动轨迹及寻找平台潜伏期等。

定位航行实验：从各组分别随机选取6只大鼠进行实验，该实验需进行7 d(每天上下午各进行1次，每次训练2遍)。训练之前首先将所有参与实验的大鼠放到安全平台上停留2.0-3.0 min，使之熟悉实验状况和实验环境。实验进行时随机择取一入水点，将大鼠从此入水点背对池水入水，并使同次实验中大鼠的入水点一致；开始记录实验动物从入水点入水后到达平台的时间间隔(此即逃逸潜伏期)。如果入水90 s之后实验动物仍未到目标地点，则应将之引至平台，而本次时间间隔则记录为90 s。将每天4次的逃逸潜伏期的算术平均值作为这一天的学习成绩。

1.5.3 干预后4周通过苏木精-伊红染色观察病理学改变 每组麻醉处死大鼠3只并取出颅脑损伤组织，用体积分数10%甲醛固定组织制备颅脑组织切片；使用由低浓度到高浓度的乙醇作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于既溶于乙醇，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的乙醇，随后进行浸蜡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8 μm厚薄片。将薄片烫平，再贴到载玻片上，45 ℃恒温烘干。脱蜡后，进行苏木精-伊红染色法染色。染色后的切片经纯乙醇脱水，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶干燥后，荧光显微镜下观察各组大鼠颅脑损伤病理学变化。

1.5.4 荧光显微镜观察CM-Dil标记的神经干细胞存活及分布情况 干预4周后，采集大鼠颅脑损伤区域组织，制作大鼠颅脑损伤组织冰冻切片并进行4’，6-二脒基-2苯基吲哚染色。干燥后，显微镜下观察时，随机选取每张冷冻切片的3个视野并且对之进行拍照记录；假设每张照片的总亮度为1，每张照片选取一个光亮度点，利用ACDsee 5.0软件确定其坐标值。在图像中随机选取8个视野，计算颅脑损伤组织中的神经干细胞标记率。

1.5.5 RT-PCR检测大鼠脑伤区周围突触素及生长相关蛋白43基因转录的表达水平变化干预4周后，取4组大鼠同一部位的颅脑损伤组织，采用RT-PCR法检测颅脑损伤组织中生长相关蛋白43和突触素基因相对表达水平。每个检测重复3次。通过Oligo 7.36 Demo软件设计引物，突触素，上游引物：5’-CAG CCG TGT TCG CTT TCA T-3’，下游引物：5’-CCA CCC GTG GGA TCT TCA T-3’，扩增片段650 bp；生长相关蛋白43，引物序列上游：5’-AGG AAA GGA GAG AAG GCA GG-3’；下游：5’-GCA GGA GAG ACA GGG TTC AG-3’，扩增片段长度778 bp；内参GAPDH，上游引物：5’-GTG CTG AGT ATG TCG TGG A-3’，下游引物：5’-CAC AGT CTT CTG AGT GGC A-3’，扩增片段121 bp。提取细胞RNA并反转录为cDNA，采用2^-^??Ct分析法，以GAPDH基因作为内参，测定生长相关蛋白43和突触素mRNA相对表达水平。

1.5.6 Western blot检测大鼠脑伤区周围突触素及生长相关蛋白43蛋白的表达水平变化 干预4周后，提取并测定颅脑损伤组织蛋白浓度，将细胞裂解之并将之稀释至相同的蛋白浓度，100 ℃煮沸5 min，使蛋白变性。每组取蛋白40 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；转膜(200 mA，3 h)至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h(或4 ℃过夜)；一抗1∶500，室温孵育2 h(或4 ℃过夜)；TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次；之后进行蛋白免疫印迹的反应，拍照记录之后进行软件的图像分析，测定各组颅脑损伤组织中生长相关蛋白43和突触素蛋白相对表达水平。

1.6 统计学分析 实验所有数据资料的组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)程序分析，实验结果以x(_)±s表示，并规定P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

颅脑损伤会引起神经细胞不可重建性的损伤，诱发脑组织中的氧化应激等，进而威胁患者的生命安全^[28-30]。丹参中含有多种抗氧化成分，可抵抗氧化应激以缓解颅脑损伤^[31-34]；此外其对神经干细胞的增殖活化，通过促进神经干细胞的作用以修复损伤的神经细胞。神经干细胞是一种可以向神经元分化的干细胞，该细胞还可以进行自我更新和自我维持，并分泌多种神经因子以改善颅脑损伤^[35-37]。但由于神经干细胞在移植过程中存活有限，其移植的治疗效果也受到了较大限制。而丹参注射液则可通过增殖神经干细胞促进后者移植的疗效。此次研究的目的在观察二者相联合对颅脑损伤的影响。

此次研究显示，丹参注射液与神经干细胞移植相联合显著降低了大鼠神经功能缺损评分，而两单独治疗组对神经损伤的功能恢复也优于颅脑损伤组，这提示联合治疗提高了颅脑损伤大鼠的神经功能。而Morris水迷宫实验结果表明，联合组3-5 d时平均潜伏时间较丹参注射液组及干细胞组缩短，较脑损伤组明显缩短，穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于丹参注射液组及干细胞组，明显高于脑损伤组，这提示丹参注射液和神经干细胞移植联合可有效促进颅脑损伤大鼠的记忆能力和行为能力。而苏木精-伊红染色结果显示丹参注射液组及干细胞组脑损伤区组织空洞较小，联合组脑损伤区组织空洞几乎消失，脑损伤组可见脑损伤区组织空洞明显，这表明联合治疗促进了颅脑组织的修复和神经细胞的分化增殖。实验中观察到丹参注射液显著促进了外源性神经干细胞移植后的存活和分布，这提示丹参注射液可通过提高神经干细胞增殖和存活提高其疗效。据实验结果可知，丹参注射液显著提高了神经干细胞在脑损伤区域中的存活和分布，这与文献的研究较为一致^[26-27]，丹参注射液的应用解决了神经干细胞在移植过程中存活率低的问题。神经干细胞通过参与神经损伤修复显著改善了脑损伤大鼠的行为学能力。这一机制可能与神经干细胞对神经调节因子的表达的促进作用有关。研究表明，神经干细胞可显著提高生长相关蛋白43和突触素的分泌。这与实验联合组观察的变化较为一致。联合组中生长相关蛋白43和突触素的表达水平明显较高。生长相关蛋白43是广泛存在于神经细胞中神经调节因子，其可促进脑损伤后的神经系统的修复，并被认为是神经再生的标志^[38]。该结果提示联合治疗缓解了脑水肿，并促进了神经细胞的生长和修复，对脑梗死起到了治疗作用。突触素是突触小泡中的功能性蛋白，其可作为神经系统中突触的分子标记和功能性标志，其表达水平可体现出突触的数量和功能^[39-46]。这表明联合治疗在重建神经细胞和修复神经功能方面疗效显著。据此可知，经过丹参注射液的促进作用，神经干细胞的增殖活化能力得到了提高，其改善了神经调节因子的分泌和表达，提高后的生长相关蛋白43和突触素缓解了大鼠的神经损伤，促进了神经细胞的修复和生长，明显增加了神经突触的数量，提高了神经突触的功能。进而，丹参注射液与神经干细胞联合治疗显著改善了大鼠行为学和记忆能力，缓解了大鼠脑组织损伤。

实验通过丹参注射液与神经干细胞移植治疗颅脑损伤大鼠，改善了重型颅脑损伤模型大鼠的神经功能，此可能通过促进大鼠脑损伤区脑组织突触素及生长相关蛋白43 的表达水平发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程