自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗长骨干骨折术后骨不连

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.021

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨不连：是指骨折9个月未愈合，并且已观察3个月没有进一步愈合的倾向，称为骨不连。
自体富血小板血浆：是将自体外周血经过离心后得到的富含高浓度血小板的血浆，其主要成分为血小板、白细胞和纤维蛋白。高浓度的血小板被激活后可释放大量的细胞因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1等，这些因子在在骨与软组织的修复过程中起着重要的调控作用，加速基质干细胞的分化，促进成骨细胞和成纤维细胞的增殖，加快纤维蛋白与细胞外基质的合成。

摘要
背景：研究显示自体富血小板血浆和骨髓间充质干细胞具有一定的骨修复作用，但临床上少见自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗长骨干骨不连的研究。
目的：对比自体骨髓间充质干细胞及自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗长骨干骨不连的效果。
方法：将47例长骨骨干骨折术后骨不连患者随机分为单一治疗组(n=22)和联合治疗组(n=25)，单一治疗组骨折端断注射自体骨髓间充质干细胞，联合治疗组骨折端断注射自体富血小板血浆与自体骨髓间充质干细胞。随访观察两组临床骨折愈合时间、治疗后局部并发症发生情况、患侧肢体功能分级及治疗后3个月的骨痂评分。
结果与结论：①临床骨折愈合：联合治疗组临床愈合时间短于单一治疗组[(4.2±1.5)，(5.6±1.1)个月，P < 0.05]、骨折愈合率高于单一治疗组(92%，86%，P < 0.05)，骨痂评分高于单一治疗组(2.74±0.36，2.32±0.53，P < 0.05)；②患肢功能恢复：单一治疗组患侧肢体功能恢复优良率低于联合治疗组(77%，84%，P < 0.05)；③局部并发症：两组患者骨髓穿刺及治疗局部皮肤无红肿、无感染；④结果表明：自体骨髓间充质干细胞及自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞移植两种方法治疗长骨干骨折术后骨不连均有一定的疗效，联合治疗的效果更好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5165-7430(张松)

关键词: 干细胞, 移植, 自体富血小板血浆, 骨髓间充质干细胞, 骨不连, 长骨干骨折

Abstract:

BACKGROUND: Autologous platelet rich plasma and bone marrow mesenchymal stem cells have certain effects on bone repair, but there are rare reports on the clinical treatment of long shaft fracture bone nonunion using autologous platelet rich plasma combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of autologous platelet rich plasma combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on long shaft fracture bone nonunion.
METHODS: Forty-seven patients with long shaft fracture bone nonunion were randomly divided into two groups: monotherapy group (n=22) and combination group (n=25). In the monotherapy group, autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was performed in the bone nonunion site. In the combination group, autologous platelet rich plasma combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was implemented in the bone nonunion site. Callus score, clinical healing time, local complications and limb function grade were recorded and compared between the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: The healing properties and limb function in the combination group were significantly superior to those in the monotherapy group [healing time: (4.2±1.5) vs. (5.6±1.1) months, P < 0.05; healing rate: 92% vs. 86%, P < 0.05; callus score: 2.74±0.36 vs. 2.32±0.53, P < 0.05; limb function recovery rate: 77% vs. 84%, P < 0.05]. Complications like local skin redness or infection were not found in the two groups. In conclusion, both of the two methods can promote bone healing, but autologous platelet rich plasma combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation has a better clinical effect on bone healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Platelet-Rich Plasma, Stem Cells, Fractures, Bone, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张松，张涛，付桂红，李顺华，周学儒, 陈隆坤. 自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗长骨干骨折术后骨不连[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4716-4721.

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图/表（结果） 2

2.1 参与者数量分析 47例患者全部获得随访，随访时间9-15个月，平均10.3个月，均进入结果分析。

2.2 随机分组流程图 见图1。

2.3 基线资料比较 两组患者性别分布、年龄及患病部位等资料比较差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性，见表1。

2.4 两组骨折临床愈合能力的比较 单一治疗组临床骨折愈合时间为4-9.7个月，末次随访时19例临床愈合，3例未愈合，骨折愈合率为86%。联合治疗组骨折临床愈合时间为3-9.2个月，末次随访时23例临床愈合，2例未愈合，骨折愈合率为92%。联合治疗组骨折临床愈合时间短于单一治疗组(P < 0.05)，骨折愈合率高于单一治疗组(P < 0.05)，见表2。

2.5 两组治疗后3个月时的骨痂评分比较 单一治疗组治疗后3个月时骨痂评分低于联合治疗组(P < 0.05)，见表2。

2.6 两组治疗后患侧肢体功能恢复情况比较 单一治疗组患侧肢体功能评级，优13例，良4例，可3例，差2例，疗效优良率是77%，联合治疗组患侧肢体功能评级，优17例，良4例，可2例，差2 例，疗效优良率是84%，两组间优良率比较差异有显著性意义，见表3。

2.7 治疗后局部并发症发生情况 两组患者骨髓穿刺及治疗局部皮肤无红肿、无感染。

2.8 典型病例 45岁女性患者，2014 年10月外伤致左侧桡骨骨骨折，行左侧桡骨骨折复位钢板内固定术，术后10个月突发左侧前臂疼痛，活动异常，行X射线检查发现左侧桡骨骨不连伴内固定断裂，给予妥善外固定，并于断端注射自体富血小板血浆及骨髓间充质干细胞，同时指导功能锻炼。注射治疗后6个月复查，骨折愈合良好，后取出内固定，其治疗前后的影像学图片，见图2。

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引言

骨折是一类常见的骨科疾病，骨折的愈合也是涉及复杂的生理机制，它不仅与患者全身状况有关，也受骨折局部因素的影响，上述任何因素的干扰都有可能导致骨折的不愈合，甚至骨不连^[1-2]。尽管临床工作中，医生采取一系列措施如稳定骨折、改善患者全身状况等以加快骨痂形成，促进骨折愈合，但骨折延迟愈合和骨不连的发生率仍为2.5%，伴随开放性骨折和软组织损伤，发生率上升为13%-16%^[3-4]。且长骨干骨折如胫骨下段、股骨干、肱骨干骨折等发生骨不连的报道较多^[5]。

造成骨折不愈合或延迟愈合的原因众多，骨折端局部生物学反应能力降低和多种生长因子活性不足或缺乏也是一个主要原因^[6]。目前对于骨折延迟愈合/骨不连的治疗手段包括手术治疗、生物刺激、物理治疗和中医药治疗等^[7-8]，其中生物刺激、物理治疗和中医药治疗尽管有一定的治疗作用，但疗效不确切，个体差异较大；手术治疗尽管目前是治疗的首选，但内固定治疗具有损伤大、费用高或进行多次手术等缺点，外固定治疗周期长，可能会导致针道感染、畸形愈合和肢体功能丧失等并发症，因而有研究者不断探索更加合理有效的治疗方案^[9-10]。近年来，随着组织工程与再生医学技术的快速发展，对运动系统的损伤修复也逐渐产生了新的治疗理念、治疗手段^[11]。有研究试图采用组织工程与再生医学技术加速骨损伤修复的过程，其中包含自体富血小板血浆和骨髓间充质干细胞的研究^[12-13]。自体富血小板血浆是自体外周血经离心后所获得的部分，内含多种可促进修复的生长因子，近年来在整形外科、骨骼肌肉及运动系统等缺损修复中得到应用^[14-15]。骨髓间充质干细胞在一定诱导条件下可分化为成骨细胞和成软骨细胞，因而越来越多地被应用于临床，在治疗骨不连中有一定的作用^[16-17]。自体富血小板血浆和骨髓间充质干细胞取材方便，无免疫排斥反应，治疗时创伤较小，但目前关于自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗骨不连的疗效很少且不明确。

研究观察了自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗长骨干骨折术后骨不连的疗效，为骨折术后骨不连的治疗提供参考^[18-19]。

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材料方法

1.1 设计 随机对照，对比观察实验。

1.2 时间及地点 试验于2015年3月至2016年3月在贵州省骨科医院完成。

1.3 对象 选择2015年3月至2016年3月贵州省骨科医院骨外科收治的长骨骨干骨折术后骨不连患者。

纳入标准：诊断为长骨骨干骨折骨不连；骨折固定稳妥；骨折断端间隙≤4 mm；骨不连时间≤11个月；能够服从试验安排，定期随访并签署知情同意书；经贵州省人民医院伦理委员会同意批准。

排除标准：年龄<15岁或>75岁；自身免疫疾病或近期接受免疫抑制治疗患者；孕妇；恶性肿瘤及其放疗化疗患者；全身或骨折部位严重感染者；开放性骨折的Gustillo分类ⅢB和ⅢC型，需进行损伤血管修复和软组织瓣移植覆盖；病理性骨折、骨代谢疾病患者；血液系统异常：血小板计数<110×10⁹ L^-¹，血清血红蛋白<110 g/L，红细胞压积< 34%，血小板功能障碍综合征，纤维蛋白合成障碍；服用影响骨代谢的药物，如在过去6个月内服用泼尼松、肾上腺皮质激素、降钙素等超过7 d，在过去12个月内服用双膦酸盐类，骨治疗剂量的氟化物超过30 d，使用万古霉素患者；不能耐受手术者。

研究中共纳入47例长骨骨干骨折骨不连患者，其中胫骨骨不连25例，股骨骨不连14例，肱骨骨不连5例，尺桡骨骨不连3例；随机将患者分为单一治疗组(n=22)和联合治疗组(n=25)。

1.4 方法

1.4.1 自体骨髓间充质干细胞的分离和提取 患者取侧卧位，局麻下用骨穿针从患者两侧髂后上棘抽取骨髓血60-80 mL。抽取时将骨穿针刺入髓腔深部，抽取5 mL后改变穿刺方向，每20 mL将针退出1 cm，继续按前述方法调整方向抽取，将穿刺得到的骨髓血保存在1个含肝素抗凝剂的玻璃瓶内待用。将采集的骨髓血进行过滤，分离细胞集合物和脂肪，用血细胞分离机进行离心。弃多核细胞层、无核红细胞层以及上清液，得到浓集后的骨髓间充质干细胞约5 mL。

采用流式细胞技术检测发现，(87.2±9.4)%的细胞CD34、CD45阴性，CD29、CD44、CD73阳性，符合骨髓间充质干细胞特征。

1.4.2 自体富血小板血浆的制备 采用山东威高制备的富血小板血浆制作包，用采血针和50 mL注射器(预先装有枸橼酸钠抗凝剂)抽取患者自体静脉血50 mL，进行第1次离心，离心完毕后抽取最下层红细胞层弃掉，摇匀离心管内剩余血液后进行二次离心，吸取大部分上清液弃掉，剩余部分震荡摇匀，即为富血小板血浆。用1 mL注射器抽取配制好的凝血酶，将富血小板血浆与凝血酶比例为10∶1进行混合，形成富血小板血浆凝胶。

1.4.3 治疗方案

单一治疗组：给予骨髓间充质干细胞骨折端断注射治疗。在骨折断端处常规消毒铺巾后，行局部麻醉，并在X射线透视下，采用9号注射器针头对骨折断端的纤维瘢痕组织和硬化组织进行一定程度的松解，然后用针头对骨折线定位，确认针尖处于骨折缝隙后，经定位针头将分离培养得到的骨髓间充质干细胞浓集液推入骨折端断。注射完毕后，将穿刺针头退出，无菌敷料加压包扎。

联合治疗组：给予自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞端断注射治疗。在患者骨折断端处常规消毒铺巾、局部麻醉，在X射线透视下，用9号注射器针头先对骨折断端的纤维瘢痕组织和硬化组织进行松解，后用针头定位，确认针尖处于骨折缝隙，先将上述制备好的自体富血小板血浆凝胶注射入骨折局部，再将骨髓间充质干细胞浓集液经定位针头推入骨折断端。退出穿刺针头，无菌敷料加压包扎伤口。

1.4.4 疗效观察

骨折临床愈合：所有患者治疗后3，6，9个月复查X射线片，部分患者延长至12个月及以上复查，观察骨折愈合及骨痂生成情况。骨折临床愈合标准：骨折局部无压痛，无纵向叩击痛；骨折局部无异常活动。

骨痂情况：按照Fernadez-esteve评价标准评估治疗后3个月时X射线片中骨痂情况^[20]，骨折端无放射学骨痂为Ⅰ级，计0分；骨折端云雾状骨痂为Ⅱ级，计1分；骨折端正侧位片两侧其中有一侧形成骨痂为Ⅲ级，计2分；骨折端的正侧位两侧均形成骨痂为Ⅳ级，计3分。

患侧肢体恢复：按照Johner-Wruhs功能分级标准评估患侧肢体恢复情况^[21]，主要分为优、良、可、差4级：①优：骨不连愈合，无畸形，关节活动自如，无局部疼痛，姿势或步态正常，可参与剧烈运动；②良：骨不连愈合，轻度畸形，关节活动轻微受限，偶有局部疼痛，姿势或步态正常，剧烈运动受限；③可：骨不连愈合，肢体畸形，关节活动中度受限，常有局部疼痛，不明显的姿势或步态异常，剧烈运动严重受限；④差：骨不连未愈合，严重肢体畸形，关节活动明显受限，严重的局部疼痛，明显的姿势或步态异常，无法参与剧烈运动。

1.5 主要观察指标 观察并比较两组治疗后3个月时骨痂评分、临床愈合时间、治疗局部并发症发生情况及患侧肢体功能分级。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0对所得的数据进行统计学处理。计量资料以x(_)±s的形式表示，组间比较采用独立样本t 检验。计数资料以频数或率表示，比较采用χ²检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

骨折是骨科的常见疾病，因骨折部位的不同，临床愈合的时间也多有不同。发生在长骨干的骨折骨皮质横断，骨折端血供容易遭到破坏，因此较其他部位需要更长的愈合时间，加之有些长骨干皮肤薄，供给营养血管分支少(如胫骨中下1/3骨折)，因此骨折后发生骨不连的机会较大^[22-23]。目前常用的治疗骨不连的方法包括手术治疗、物理刺激治疗(如电磁场刺激治疗、脉冲超声波、体外冲击波)等，其中传统的并为多数人接受的仍是手术治疗^[24-25]。手术治疗中常需要植骨，无免疫原性反应且具有良好骨诱导作用的自体骨是治疗过程中最为常用移植骨^[26-27]，但有不少研究报道这种方法可造成取骨部位的后遗症，如感染、疼痛和神经损伤等^[28-29]。近年来，随着组织工程与再生医学技术的快速发展，有研究试图采用组织工程方法治疗骨不连，其中包含自体富血小板血浆和骨髓间充质干细胞的研究^[30-31]。

自体富血小板血浆是将自体外周血经过离心后得到的富含高浓度血小板的血浆，其主要成分是血小板、白细胞和纤维蛋白^[32-33]。高浓度的血小板被激活后可释放大量的细胞因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1等，这些因子在在骨与软组织的修复过程中起着重要的调控作用，加速基质干细胞的分化，促进成骨细胞和成纤维细胞的增殖，加快纤维蛋白与细胞外基质的合成^[34-35]。基于上述作用，富血小板血浆在整形外科、骨骼肌肉及运动系统等学科的缺损修复中得以应用，也有研究者将其应用于骨不连的治疗^[36-37]。研究证实自体富血小板血浆能够促进骨修复，对治疗骨不连有一定疗效^[38-40]。

骨髓间充质干细胞是存在于成年动物或人的骨髓里的一种干细胞，具有多向分化潜能及迁移性^[41-43]。骨髓间充质干细胞取材方便，可在特定条件下诱导分化为多种间充质细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等，并具有自我更新能力，能够分泌生长因子、细胞因子及其他生物活性因子等^[44-45]。目前骨髓间充质干细胞被研究者用于骨与软骨修复、神经修复、减轻炎症反应等方面，也有将其应用于临床治疗骨折骨不连的报道，但其治疗骨不连的效果并不相同^[46-47]。

研究比较了单一骨髓间充质干细胞注射和自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗长骨干骨折术后骨不连的疗效，旨在为长骨骨干骨不连治疗提供新的思路。通过比较发现经过一段时间随访后，两组治疗后都有患者达到临床愈合，说明两种治疗方法都能促进骨折断端修复。联合治疗组较单一治疗组达到临床愈合的比例更高，且联合治疗组临床愈合时间较对照组要短，说明联合治疗的两者在促进骨修复中具有协同作用，能够更有效加快临床愈合。治疗后3个月时两组骨痂评分也可以很好地说明这一点，治疗3个月时，单一治疗组骨痂评分为(2.32±0.53)分，低于联合治疗组的(2.74±0.36)分，说明联合治疗组骨痂形成加快。通过分析认为，骨髓间充质干细胞移植到骨折断端时可能在局部环境诱导下向成骨细胞方向分化形成骨细胞，促进骨折修复，因而在骨折断端注射骨髓间充质干细胞后随访可见到骨折断端有骨痂形成。当自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞移植时，自体富血小板血浆中含有的多种细胞因子可能具有促进骨髓间充质干细胞转化成骨细胞的作用，加速骨痂形成，促进临床愈合。尽管目前尚无相关临床研究证实上述分析，但有动物实验可从某种程度上反映这一点。徐翔等^[48]将骨髓间充质干细胞加入富血小板血浆的L-DMEM完全培养基进行培养后发现，山羊富血小板血浆能明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。进一步比较两组患者治疗后患侧肢体功能评级后发现，联合治疗组患侧肢体功能恢复较单一治疗组好，说明联合治疗组疗效更好。两组治疗后治疗局部无红肿、无感染，说明两种方法治疗的安全性可靠。

此次研究观察了单一骨髓间充质干细胞注射和自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞移植两种方法治疗长骨干骨折术后骨不连的疗效，研究证实两种方法均有一定的治疗效果，但联合治疗效果更好。上述治疗方法取材方便，不会引起免疫排斥反应且创伤轻，患者痛苦小，操作简单安全。但仍有不少问题需要进一步研究，如注射到骨折局部间充质干细胞和富血小板血浆与骨折愈合的量效关系、注射频率对疗效的影响及移植后的细胞如何在体内追踪、标记等问题。两种治疗方法应用时有一定的适应证，仅适用于骨折固定稳妥、骨折断端间隙≤ 4 mm、骨不连时间≤11个月尚未形成髓腔封闭的患者。

综上所述，单一骨髓间充质干细胞注射和自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞移植对长骨干骨不连均有一定的治疗效果，而自体富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗长骨干骨不连的效果更好，但由于本组病例数较少，其临床应用价值仍有需要进一步研究加以明确。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程