HBV感染者脂肪间充质干细胞体外诱导为肝样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂肪间充质干细胞分离方法：有胶原酶消化法、组织块贴壁法、吸附柱法、直接离心法、机械振荡法、胎牛血清法等，研究表明利用0.075%Ⅰ型胶原酶在37 ℃下振荡消化1 h，是分离人脂肪干细胞的最好方法。
间充质干细胞在肝脏疾病中的应用：间充质干细胞既能在体外/内环境下分化为肝细胞又能归巢到受损肝脏，在肝组织内分泌细胞因子减轻炎症反应，抑制细胞凋亡，改善肝功能，还可分泌抗纤维化物质，产生抗纤维化的作用，间充质干细胞移植在肝脏疾病治疗方面显示出良好的应用价值。

摘要
背景：有报道显示，人脂肪间充质干细胞在体外特定为环境下可诱导分化为具有白蛋白合成功能及分泌尿素功能的肝样细胞。
目的：探讨乙型肝炎病毒感染者皮下脂肪组织间充质干细胞体外向肝样细胞分化的潜能。
方法：胶原酶消化乙型肝炎病毒感染者脂肪组织，结合贴壁培养法获得脂肪间充质干细胞。采用三阶段诱导法诱导脂肪间充质干细胞向肝样细胞分化，观察其形态变化，免疫组织化学染色检测肝细胞相关蛋白甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18表达，糖原染色法检测细胞糖原合成功能。
结果与结论：脂肪间充质干细胞经3阶段诱导培养后，大部分细胞成多角形，类肝细胞形态；免疫组织化学染色结果显示，诱导培养后脂肪间充质干细胞白蛋白、细胞角蛋白18和甲胎蛋白染色阳性，且细胞白蛋白和细胞角蛋白18的表达随着诱导培养时间的延长逐渐增加；诱导培养后的脂肪间充质干细胞具有糖原合成功能，过碘酸雪夫试剂染色阳性。结果表明，乙型肝炎病毒感染者皮下脂肪组织间充质干细胞经成肝诱导培养后可分化为有功能的肝样细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0347-6691(王彦会)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 间充质干细胞, HBV感染, 脂肪, 肝样细胞

Abstract:

BACKGROUND: It has been reported that human adipose-derived mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into hepatocyte-like cells with the function of albumin synthesis and urea secretion in vitro.
OBJECTIVE: To investigate the potential of adipose-derived mesenchymal stem cells differentiating into hepatocyte-like cells in vitro.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from the subcutaneous fat of hepatitis B virus infection patients by collagenase digestion and adherent method. Adipose-derived mesenchymal stem cells
were induced by three-phase induction method and observed morphologically. The expression levels of alpha-fetoprotein, albumin and cytokeratin 18 were detected by immunohistochemical staining and glycogen synthesis function was detected by glycogen staining method.
RESULTS AND CONCLUSION: Most of adipose-derived mesenchymal stem cells induced by three-phase induction method were differentiated into hepatocyte-like cells with polygonal morphology. Immunohistochemistry staining results showed that hepatocyte-like cells expressed alpha-fetoprotein, albumin and cytokeratin 18, and the expression levels of albumin and cytokeratin 18 increased with the culture time. The induced cells had the function of glycogen synthesis and were positive for periodic acid Schiff staining. These results showed that the subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells could be induced into functional hepatocyte-like cells in hepatitis B virus infection patients.

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Key words: Mesenchymal Stem Cells, Subcutaneous Fat, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王彦会，王志茹，孙岩，赵文静，杨姝媛，赵淑丽. HBV感染者脂肪间充质干细胞体外诱导为肝样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3983-3988.

Wang Yan-hui, Wang Zhi-ru, Sun Yan, Zhao Wen-jing, Yang Shu-yuan, Zhao Shu-li. Adipose-derived mesenchymal stem cells from hepatitis B virus infection patients differentiate into hepatocyte-like cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 3983-3988.

图/表（结果） 2

2.1 hADSCs的分离培养 Ⅳ型胶原酶消化脂肪组织获得的细胞培养48 h后，镜下观察，贴壁细胞大多数呈梭形，少数细胞呈多角形，培养7-10 d单层生长细胞达80%-90%融合，呈旋涡状排列。10例供者的hADSCs全部培养成功，成功率为100%，原代培养时间为(8.3±1.2) d。传代培养的hADSCs贴壁较快，呈梭形的成纤维细胞样细胞，研究分离获得的10例hADSCs在体外连续传代培养15代无衰老征象，生长状态良好，见图1。

2.2 hADSCs细胞的生长曲线 体外培养的hADSCs生长曲线均呈“S”形，3代和5代hADSCs细胞的生长曲线基本相同，细胞增殖速度快，传代周期较短，培养三四天进入对数生长期，第7天进入平台期，见图2。

2.3 hADSCs表面抗原测定 流式细胞仪检测结果显示，5代hADSCs高表达间充质干细胞的特征性表面抗原，(93.5±2.9)%的细胞表达CD44，100%的细胞表达CD29，(90.1±3.6)%的细胞表达CD105，仅有(1.4±0.7)%的细胞表达造血干细胞的特征性表面标志CD34，见图3。

2.4 hADSCs体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞 实验结果显示，在成脂诱导培养第3周，实验组大部分细胞油红O染色阳性，镜下观察细胞胞浆内有橘红色脂肪滴，对照组细胞油红O染色阴性；成骨诱导第2周，实验组大部分细胞碱性磷酸酶染色阳性，镜下观察细胞胞浆内可见有灰黑色沉淀，对照组细胞碱性磷酸酶染色阴性，见图4。

2.5 hADSCs体外诱导分化为有功能的肝样细胞 hADSCs经三阶段诱导培养后，大部分细胞呈多角形，类肝细胞形态，细胞形态变化与文献报道相同^[24]。免疫组织化学染色结果显示，实验组诱导培养后hADSCs白蛋白、细胞角蛋白18和甲胎蛋白染色阳性，镜下观察细胞胞浆内可见黄棕色沉淀，且细胞白蛋白和细胞角蛋白18的表达随着诱导培养时间的延长逐渐增加；对照组细胞白蛋白、细胞角蛋白18和甲胎蛋白染色阴性，见图5。过碘酸雪夫染色染色结果显示，对照组细胞过碘酸雪夫染色阴性；实验组诱导培养后hADSCs过碘酸雪夫染色阳性，镜下观察细胞胞浆内可见紫色沉淀，见图5。结果提示hADSCs体外可以诱导分化为具有糖原合成功能的肝样细胞。

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引言

乙型肝炎病毒HBV感染是重要公共卫生问题，世界卫生组织报道，全球约3.5亿慢性HBV感染者^[1-3]。中国属HBV高流行区，2006年流行病学会调查显示，1-59岁人群中血清乙肝表面抗原携带率为7.18%，HBV感染者约9 300万人，其中慢性乙肝患者约2 000万例^[4]。中国每年约有30万人死于慢性HBV感染导致的肝衰竭、肝硬化和肝癌等终末期肝病^[5]，对终末期肝病尚无有效的治疗手段，总体治疗效果不佳，病死率很高^[6-7]。近年来干细胞在再生医学领域取得取得重大进展，以干细胞为支撑的再生医学有望为终末期肝病的治疗提供新思路。

间充质干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能的细胞，在体内或体外特定诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、神经、肝、心肌和内皮等多种组织细胞，可从骨髓、肌肉、脐血、外周血、脂肪等组织中分离得到^[8-13]。研究表明间充质干细胞既能在体外/内环境下分化为肝细胞又能归巢到受损肝脏，在肝组织内分泌细胞因子减轻炎症反应，抑制细胞凋亡，改善肝功能，还可分泌抗纤维化物质，产生抗纤维化的作用^[14]，间充质干细胞移植在肝脏疾病治疗方面显示出良好的应用价值。自体骨髓间充质干细胞移植治疗终末期肝病的临床试验结果初步证实了间充质干细胞移植治疗的有效性和安全性^[15]，但对乙型肝炎肝硬化患者自体骨髓间充质干细胞移植的临床疗效尚存在争议^[16]，HBV感染可能影响骨髓间充质干细胞的生物学特性^[17]，对于乙型肝炎肝硬化患者需寻找其他的间充质干细胞来源。

2001年Zuk等^[18]首次从脂肪组织分离得到间充质干细胞，命名为人脂肪来源间充质干细胞(human adipose- derived mesenchymal stem cells，hADSCs)。hADSCs与骨髓间充质干细胞生物学特性类似，具有多向分化潜能，但其具有取材方便、患者痛苦小、体外扩增迅速等优点。2005年Seo等^[19]报道hADSCs在体外特定为环境下可诱导分化为具有白蛋白合成功能及分泌尿素功能的肝样细胞。关于HBV感染者hADSCs的生物学特性及体外成肝细胞分化潜能尚未见报道。研究采用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，结合贴壁培养法分离乙型肝炎肝硬化皮下hADSCs，建立hADSCs体外分离培养和快速扩增的方法，采用特定培养基体外诱导分化为肝样细胞并鉴定，为HBV感染者应用自体hADSCs治疗提供实验基础和理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年6月至2016年6月在吉林省肝胆病医院科研室完成。

1.3 材料 皮下脂肪组织来源于2015年6至8月在吉林省肝胆病医院10例行门静脉分流术的乙型肝炎肝硬化患者，其中男6例，女4例，年龄35-55岁。乙型肝炎肝硬化诊断标准符合2015年版《中国慢性乙型肝炎防治指南》^[20]，患者血清HBV DNA平均浓度为8.5×10⁸ IU/mL，HBsAg、HBeAg和HBcAb 阳性。研究方案经吉林省肝胆病医院伦理委员会批准，患者知情并签署知情同意书。无菌操作取患者腹部皮下脂肪组织约30 g，置于装有生理盐水的无菌离心管内，用标本运送箱运送至实验室进行分离培养。

主要试剂和仪器：Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；低糖DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；鼠抗人-AFP、ALB、CK-18单抗(美国Santa Cruz公司)；过碘酸雪夫试剂染色试剂盒、成脂诱导培养基、成骨诱导培养基(广州赛业生物技术有限公司)；即用型快捷免疫组织化学MaxVision^TM 试剂盒(福州迈新)；hADSCs成肝细胞诱导培养所需试剂(美国Peprotech公司)；CO₂培养箱(美国Thermo公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 hADSCs的分离培养 参照文献[21-22]描述的hADSCs分离培养方法。以0.1%的Ⅰ型胶原酶消化剪碎的脂肪组织，37 ℃震荡消化60 min，无菌吸管吸取底层细胞层，200目筛网过滤，加入等体积培养基2 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗2遍。细胞接种于60 mm培养皿中(每皿为6×10⁵个细胞)，置于体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中培养，48 h后换液，待细胞生长达80%-90%融合后，0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA消化1∶3传代培养。

1.4.2 hADSCs细胞增殖能力、表面抗原及多向分化潜能检测

细胞增殖能力检测：MTT法检测3代和5代hADSCs的体外增殖能力，以培养时间作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制细胞生长曲线^[23]。

细胞表面抗原检测：收集第5代hADSCs制成单细胞悬液，去1×10⁶个细胞悬于500 μL PBS内，分别加入单克隆抗体或同型对照5 μL(CD34-PE、CD29-PE、CD44-FITC、CD105-FITC、PE-IgG1和FITC-IgG1)，4 ℃避光染色30 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清，500 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

多向分化潜能检测：取生长良好的第5代 hADSCs细胞，接种于6孔板内，每孔2×10⁵个细胞，实验组培养24 h更换培养基为成脂诱导培养基和成骨诱导培养基，对照组仍采用含体积分数10%胎牛血清的完全DMEM培养基培养，连续诱导培养3周后行油红O和碱性磷酸酶染色鉴定。

1.4.3 体外诱导hADSCs向肝样细胞分化 参照参考文献[24]的三步诱导法，取生长良好的第5代hADSCs，接种于24孔板内，每孔2×10⁴个细胞，孔内预先放置无菌盖玻片，培养24 h更换培养基，具体诱导方案如下：①采用诱导培养基培养4 d，培养基为含体积分数5%胎牛血清的高糖DMEM，添加100 μmol/L抗坏血酸-2-磷酸、1×ITS，0.67 mg/L亚硒酸钠、50 μg/L活化素A和20μg/L成纤维细胞生长因子4；②采用诱导培养基培养7 d，培养基为含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM，添加100 μmol/L抗坏血酸-2-磷酸、1 μmol/L地塞米松、10 nmol/L烟酰胺、20 μg/L肝细胞生长因子、20 μg/L成纤维细胞生长因子4、20 μg/L表皮细胞生长因子和20 μg/L抑瘤素M；③采用诱导培养基培养7 d，培养基为含体积分数10%FBS的低糖DMEM，添加100 μmol/L抗坏血酸-2-磷酸、1 μmol/L地塞米松、1%DMSO、20 μg/L肝细胞生长因子、20 μg/L成纤维细胞生长因子4、20 μg/L表皮细胞生长因子和20 μg/L抑瘤素M。

严格按照诱导方案的时间规定更换培养基及添加相应的细胞因子和诱导剂，诱导培养过程中观察细胞形态变化，培养结束后取出细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定。同时设阴性对照组，采用同批次细胞常规培养基培养。

1.5 主要观察指标

免疫组织化学染色法检测细胞甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18表达：已固定细胞爬片，0.5%Txiton-100室温处理20 min，体积分数3%过氧化氢甲醇液室温处理20 min，湿盒内37 ℃封闭液封闭30 min，分别鼠抗人AFP(1∶200稀释)、ALB(1∶100稀释)和CK-18(1∶200稀释), 37 ℃水浴箱内孵育2 h，PBS冲洗，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育1 h，DAB显色，苏木精复染细胞核。

过碘酸雪夫试剂染色(PAS)检测细胞糖原合成功能：已固定细胞爬片，PBS湿化，采用PAS染色试剂盒染色，严格按照说明书操作，显微镜下观察。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

终末期肝病是各种肝病的最后阶段，肝功能严重受到损害，死亡率比较高，其病因主要是病毒感染，其中乙肝病毒感染是最常见，其治疗手段主要有抗病毒治疗、免疫治疗、人工肝治疗、肝移植等，但这些治疗措施均只能改善肝功能衰竭的临床症状，对于已经坏死的肝细胞没有逆转作用。近年来研究者对不同组织来源间充质干细胞开展了大量的研究工作，间充质干细胞在再生医学领域的研究成果为终末期肝病的治疗带来了曙光。目前临床应用于治疗终末期肝病的的间充质干细胞主要有自体骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞。由于骨髓间充质干细胞含量极少，在短期内不能扩增培养得到移植需要的细胞数量，达不到预期的临床疗效^[25]，另有学者发现乙型肝炎肝硬化患者骨髓间充质干细胞体外难培养，增殖速度慢，细胞表面的细胞因子受体表达下降^[18]。理想的种子细胞应该是来源丰富、容易获得、取材时痛苦小并且体外易于分离培养和大量扩增。研究表明1 g脂肪可以得到(1.0-2.0)×10⁶个间充质干细胞^[26]，脂肪间充质干细胞具有获取方便、来源充分、创伤较小、涉及医学伦理学问题少和增殖快速等优点引起了极大的关注^[27]。

目前hADSCs分离方法有胶原酶消化法、组织块贴壁法、吸附柱法、直接离心法、机械振荡法、胎牛血清法等^[28-29]，研究表明利用0.075%Ⅰ型胶原酶在37 ℃下振荡消化1 h，是分离人脂肪干细胞的最好方法^[30]。胶原酶消化获得混合细胞群，脂肪干细胞仅占10%左右，还包括脂肪前体细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞，如果把未经纯化的基质血管成分细胞作为脂肪干细胞研究，可能对细胞表型、增殖和分化等一系列研究结果产生混淆，因此需对脂肪干细胞进行纯化。一般利用脂肪干细胞的贴壁特性进行纯化，有学者认为原代培养48 h后，所有贴壁的活细胞均为脂肪干细胞^[31]。

研究采用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，结合贴壁培养法分离培养乙型肝炎肝硬化患者皮下脂肪组织间充质干细胞，10例供者的hADSCs全部培养成功，成功率为100%；hADSCs原代培养时间为7-10 d，传代hADSCs增殖速度快，传代周期较短,在短时间内既可以获得大量hADSCs。本研究分离培养的hADSCs在体外连续传代培养15代，生长状态良好，无衰老征象。研究表明hADSCs高表达CD105、SH3、Stro-1、CDl3、CD90、CD44等间充质干细胞的特异性细胞表面抗原，低表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR^[32]，具有与骨髓间充质干细胞相似的形态特征和多向分化潜能。研究分离培养的hADSCs呈梭形的成纤维细胞样细胞，高表达CD44、CD29和CD105，低表达造血干细胞的特征性表面标记CD34；体外具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能，研究结果与文献报道一致^[33]。研究结果胶原酶消化法结合贴壁培养法相结合可获得高纯度hADSCs，乙型肝炎肝硬化患者hADSCs表达间充质干细胞的特征性细胞表型，具有向脂肪细胞和成骨细胞分化潜能，体外培养增殖速度快，在短期内即可获得大量的细胞。

Talens-Visconti等^[34]从吸脂术获得脂肪组织中分离hADSCs，体外采用两部诱导法诱导其分化为具有白蛋白和糖原合成功能肝细胞样细胞。Lee等^[24]从人大腿脂肪组织分离培养hADSCs，采用三步诱导法诱导hADSCs成肝细胞分化，从基因、蛋白和细胞功能等多方面证实分化的hADSCs表达肝细胞系特异性标志物，具有成熟肝细胞的糖原和蛋白质合成功能及分泌尿素功能。甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18是肝细胞特异的标记蛋白，白蛋白的合成与分泌及糖原合成功能是成熟肝细胞功能最可靠的评价指标^[35]，乙型肝炎肝硬化患者脂肪间充质干细胞能否分化为有功能的肝样细胞？研究参照Lee的三步法体外诱导培养乙型肝炎肝硬化患者hADSCs，观察诱导培养过程中细胞形态变化，检测肝细胞系特异性标志物甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18表达及细胞的糖原合成功能。结果显示，hADSCs体外成肝细胞诱导培养后细胞形态发生明显变化，由梭形成纤维细胞样细胞逐渐分化为多角形，类肝细胞形态，免疫组织化学染色结果显示，诱导培养后hADSCs表达肝细胞特异性标志物甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18，且白蛋白和细胞角蛋白18随着诱导培养时间的延长逐渐增加，诱导培养后hADSCs具有肝细胞特有的糖原合成功能，过碘酸雪夫染色阳性。实验结果显示三步法体外成功诱导乙型肝炎肝硬化患者hADSCs分化为功能性的肝样细胞。

综上所述，研究建立了乙型肝炎肝硬化患者皮下脂肪组织间充质干细胞的分离培养方法和体外扩增体系，胶原酶消化结合贴壁培养法可高效分离HBV感染者脂肪间充质干细胞，HBV感染者脂肪间充质干细胞体外易于分离培养，增殖迅速，在短期内即可获得大量的细胞，对HBV感染者而言脂肪组织是一种较为理想的干细胞来源，同时体外采用三步诱导法诱导hADSCs分化为具有糖原合成功能的肝样细胞，为临床肝病患者应用自体来源hADSCs治疗提供了依据，后续将在现有工作的基础上开展乙型肝炎肝硬化患者脂肪hADSCs治疗终末期肝病的动物和临床试验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程