生长相关蛋白43基因修饰脂肪间充质干细胞对视网膜色素变性的修复及保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 3977-3982.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.007

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生长相关蛋白43基因修饰脂肪间充质干细胞对视网膜色素变性的修复及保护

高俊彦¹，张芸²，李明¹，刘学敏¹，武志兵¹，曹燕飞³

长治医学院，¹解剖教研室，³生化教研室，山西省长治市 046000；²长治医学院附属和平医院，山西省长治市 046000

修回日期:2017-03-15 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 曹燕飞，副教授，长治医学院生化教研室，山西省长治市 046000
作者简介:高俊彦，男，1979年生，汉族，山西省阳泉市人，讲师，硕士，主要从事人体解剖方面研究。
基金资助:
2016年度山西省高等学校科技创新项目(2016175)；长治医学院校级创新团队支持项目(CY201414)

Growth-associated protein-43 gene modified adipose-derived mesenchymal stem cells protect against retinitis pigmentosa

Gao Jun-yan¹, Zhang Yun², Li Ming¹, Liu Xue-min¹, Wu Zhi-bing¹, Cao Yan-fei³

¹Department of Anatomy, ³Department of Biochemistry, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, Shanxi Province, China; ²Heping Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, Shanxi Province, China

Revised:2017-03-15 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Cao Yan-fei, Associate professor, Department of Biochemistry, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, Shanxi Province, China
About author:Gao Jun-yan, Master, Lecturer, Department of Anatomy, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, Shanxi Province, China
Supported by:
the Scientific Innovation Project of Shanxi High Education in 2016, No. 2016175; Innovation Team Supporting Project of Changzhi Medical College, No. CY201414

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
生长相关蛋白43：可参与细胞的吞噬作用，能够调节神经胶质细胞和神经元的形态变化，在视网膜的发育中也具有重要作用，在视觉系统的发展阶段主要在视网膜神经节细胞中表达，在光感受器细胞中几乎不表达，在成熟的视网膜中不表达，在视神经的再生中只在神经纤维层和神经节细胞层有表达；能够表达生长相关蛋白43的视网膜细胞具有比较高的可塑性，在维持视网膜结构完整上具有重要作用。
视网膜色素变性的基因治疗：是利用RNA干扰技术置换致病基因，使致病基因沉默，或者将载体DNA整合到视网膜细胞内，不同视网膜变性阶段采用不同的基因治疗方法，当视网膜细胞结构完整时，可通过RNA干扰技术抑制突变体转录或者使用基因替代遗传缺陷；当视网膜细胞的功能结构发生变化时，主要通过转导表达神经营养因子及抗凋亡基因发挥视网膜保护作用。

摘要
背景：研究发现基因治疗和细胞移植治疗视网膜色素变性有效果，而且二者相结合治疗视网膜色素变性效果更为显著，但其作用机制有待深入研究。
目的：探讨生长相关蛋白43基因修饰脂肪间充质干细胞对视网膜色素变性大鼠视网膜的保护作用。
方法：分离和培养视网膜色素变性大鼠脂肪间充质干细胞，以生长相关蛋白43慢病毒载体转染脂肪间充质干细胞。将60只视网膜色素变性大鼠分3组干预，实验组视网膜下腔注射生长相关蛋白43慢病毒载体转染的脂肪间充质干细胞，对照组注射脂肪间充质干细胞，假手术组注射PBS，注射后3，7，14，21 d，观察眼球组织脂肪间充质干细胞变化及视网膜生长相关蛋白43表达；注射后28 d，观察视网膜Rho蛋白、GS蛋白表达及外核层厚度。
结果与结论：①实验组脂肪间充质干细胞移植后，随着时间的延长，生长相关蛋白43表达量逐渐升高，不同时间点间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；②实验组、对照组Rho蛋白和GS蛋白表达量高于假手术组(P < 0.05)；实验组Rho蛋白表达量高于对照组(P < 0.05)，GS蛋白表达量低于对照组(P < 0.05)；③实验组、对照组视网膜外核层厚度高于假手术组(P < 0.05)，实验组视网膜外核层厚度高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，生长相关蛋白43基因修饰的脂肪间充质干细胞，对视网膜色素变性大鼠模型视网膜具有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8380-8600(高俊彦)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 生长相关蛋白43基因, 脂肪间充质干细胞, 大鼠, 视网膜, Rho蛋白, GS蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Gene therapy and cell transplantation therapy, especially their combined use, have certain therapeutic effects on retinitis pigmentosa. However, little attention has been paid to the combination of gene therapy and cell transplantation in the treatment of retinitis pigmentosa.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) modified by growth-associated protein-43 (GAP-43) gene on the retina of rats with retinitis pigmentosa.
METHODS: ADMSCs from rats with retinitis pigmentosa were isolated and cultured, and then transfected with GAP-43 lentiviral vector. Sixty retinitis pigmentosa rats were randomized into experimental group (subretinal injection of GAP-43-transfected ADMSCs), control group (subretinal injection of ADMSCs) and sham operation group (PBS injection). The expressions of GAP-43 protein, Rho protein and GS protein in the retina of rats were determined by western blot. The outer nuclear layer thickness of the retina was determined by hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: After transfected cell transplantation, the expression of GAP-43 protein in the retina was gradually increased with time and showed significant differences at different time post-transplantation (P < 0.05). The expression levels of Rho protein and GS protein in the retina of experimental and control groups were higher than that in the sham operation group (P < 0.05). The expression of Rho protein in the retina of the experimental group was higher than that in the control group (P < 0.05). The expression of GS protein in the retina of the experimental group was lower than that in the control group (P < 0.05). The thickness of retinal outer nuclear layer was ranked as follows: the experimental group > the control group > the sham group, and there was significant difference between groups (P < 0.05). These results show that the ADMSCs modified by GAP-43 gene have protective effect on the retina of rats with retinitis pigmentosa.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, GAP-43 Protein, Retinal Degeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

高俊彦，张芸，李明，刘学敏，武志兵，曹燕飞. 生长相关蛋白43基因修饰脂肪间充质干细胞对视网膜色素变性的修复及保护[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3977-3982.

Gao Jun-yan, Zhang Yun, Li Ming, Liu Xue-min, Wu Zhi-bing, Cao Yan-fei. Growth-associated protein-43 gene modified adipose-derived mesenchymal stem cells protect against retinitis pigmentosa[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 3977-3982.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪间充质干细胞的培养及鉴定 脂肪间充质干细胞原代培养过程中逐渐贴壁，48 h后换液去掉未贴壁生长细胞，贴壁脂肪间充质干细胞呈梭形；当脂肪间充质干细胞培养至第3代时，细胞呈规则的梭形生长，见图1。

脂肪间充质干细胞CD29、CD90、CD49d呈阳性表达，阳性表达率分别为98.34%、99.47%、87.02%；CD106呈阴性表达(0.82%)。表明培养的为脂肪间充质干细胞。

2.2 Western Blot检测脂肪间充质干细胞GAP-43蛋白表达情况 感染LV5-GAP病毒的脂肪间充质干细胞可表达GAP-43蛋白，表达量为(96.26±5.24)%，阴性对照组和空白对照组脂肪间充质干细胞不表达GAP-43蛋白，均为(0.01±0.01)%，见图2。

2.3 大鼠视网膜内脂肪间充质干细胞的变化情况 脂肪间充质干细胞移植后，在大鼠变性视网膜内逐渐消失，移植后3 d见荧光细胞，移植后7 d荧光细胞明显减少，移植后21 d基本无荧光细胞，见图3。

2.4 大鼠视网膜内GAP-43蛋白表达情况 实验组脂肪间充质干细胞移植后，随着时间的延长，GAP-43的表达量逐渐升高，脂肪间充质干细胞移植后3，7，14，21 d的GAP-43蛋白相对表达量分别为0.12±0.03、0.37±0.05、0.89±0.12及1.38±0.23，不同时间点间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 大鼠视网膜Rho蛋白和GS蛋白表达情况 移植后 28 d，3组之间视网膜Rho蛋白和GS蛋白表达量比较差异有显著性意义，其中实验组和对照组大鼠视网膜Rho蛋白和GS蛋白表达量高于假手术组(P < 0.05)；实验组大鼠视网膜Rho蛋白表达量高于对照组(P < 0.05)，GS蛋白表达量低于对照组(P < 0.05)，见表1。

2.6 大鼠视网膜外核层厚度 移植后28 d，实验组、对照组、假手术组大鼠视网膜外核层厚度分别为(76.35± 14.65)，(53.24±12.13)，(25.46±7.48) μm，组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年2至10月在长治医学院药理实验室完成。

1.3 材料

实验动物：3周龄清洁级雄性RCS大鼠，体质量220-250 g，购自广东省实验动物中心。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

主要试剂和仪器：MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；CD29抗体、CD49d抗体、CD90抗体、CD106抗体(美国Biolegend公司)；慢病毒转染试剂盒、质粒小提试剂盒、RT-PCR试剂盒(美国Proteintech公司)；兔抗大鼠GAP-43单克隆抗体、小鼠抗大鼠Rho单克隆抗体、小鼠抗大鼠GS单克隆抗体、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗等(美国Abcam公司)；相机(佳能公司)；离心机(Becdman公司)；流式细胞仪(BD公司)；显微镜(ZEISS公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠脂肪间充质干细胞分离与鉴定 二氧化碳窒息法处死1只RCS大鼠，置乙醇中浸泡消毒，然后将大鼠固定在泡沫塑料板上，从大鼠肾后处剪开皮肤，皮下脂肪用小镊子提起，剪刀剥离脂肪，将取下的双侧肾后脂肪在MEM液中洗涤，用剪刀剪碎，将脂肪组织块和胰酶一起置培养瓶中消化，消化后离心，留取离心上层和下层的细胞和脂肪，再次消化后离心，留取下部的细胞，加入MEM液洗涤，将细胞置入培养瓶中培养，将分离的原代脂肪间充质干细胞接种到培养箱中培养，2 d后PBS洗去未贴壁细胞，加入新的培养基培养，传代培养时将上清液弃去，PBS洗涤细胞，胰酶消化后加入新鲜培养基进行传代培养。

采用流式细胞术鉴定脂肪间充质干细胞表面标记物：将生长良好的第3代脂肪间充质干细胞用胰酶消化，PBS重悬，将脂肪间充质干细胞浓度调整为5×10¹⁰ L^-¹，接种到流式管中，加入CD29、CD49d、CD90、CD106抗体孵育1 h，采用流式细胞仪检测脂肪间充质干细胞的表面标志物。

1.4.2 构建慢病毒载体 由上海生工公司设计GAP-43基因引物并合成GAP-43基因，用NsiⅠ和NotⅠ酶切载体LV5和GAP-43基因片段，DNA凝胶回收载体LV5和GAP43基因片段，用连接酶连接载体LV5和GAP43基因片段，连接产物转化细菌感受态，质粒提取试剂盒提取细菌感受态质粒，Lipofectamine 2000质粒包装GAP-43慢病毒，采用同样方法制备不含GAP-43只含LV5载体基因片段的慢病毒作为阴性对照。

1.4.3 GAP-43慢病毒载体感染脂肪间充质干细胞 取生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，接种到96孔培养皿中，培养24 h细胞贴壁后进行病毒转染，将其分3组进行慢病毒转染，LV5-GAP组给予LV5-GAP病毒转染，阴性对照组给予阴性对照慢病毒转染，空白对照组不予病毒转染，按照感染复数MOI为10计算LV5-GAP病毒和阴性对照病毒的病毒数，转染48 h后荧光显微镜下见发绿色荧光的细胞为脂肪间充质干细胞转染成功。

1.4.4 转染脂肪间充质干细胞GAP-43蛋白表达测定 采用Western Blot法检测GAP-43蛋白表达情况：提取上述转染后细胞的总蛋白质，测定蛋白浓度，将收集蛋白加入蛋白上样缓冲液，沸水浴使蛋白变性，蛋白冷却至室温后进行电泳，用PVDF转膜，转膜后加入Western洗涤液中漂洗，加入脱脂奶粉封闭，封闭后加入一抗孵育，洗涤后加入二抗孵育，洗涤，加入ECL工作液，经显影、水洗、定影和水洗后检测结果，以β-actin为参照。采用Image J软件扫描和分析蛋白条带。

1.4.5 大鼠细胞移植 将60只RCS大鼠按随机数字法随机分为实验组、对照组、假手术组，每组20只，实验组大鼠视网膜下腔内移植1×10⁸ L^-1转染GAP-43的脂肪间充质干细胞悬液1 mL(含细胞1×10⁵个)；对照组大鼠视网膜下腔内移植1×10⁸ L^-1脂肪间充质干细胞悬液1 mL(含细胞1×10⁵个)；假手术组视网膜下腔注射等量PBS。

1.5 主要观察指标

移植后视网膜脂肪间充质干细胞变化情况：移植后3，7，14，21 d，每组各处死2只大鼠，取出眼球，冰冻包埋，将冰冻组织切成厚5 μm后的切片，荧光显微镜下观察荧光标记的脂肪间充质干细胞。

移植后视网膜GAP-43蛋白表达情况：移植后3，7，14，21 d，每组各处死2只大鼠，取出视网膜，细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白质，按照上述Western blot法测定不同时间GAP-43蛋白的相对表达量。GAP-43蛋白的表达量以GAP-43蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值表示，样本重复3次。

移植后视网膜Rho蛋白和GS蛋白表达情况：移植后28 d，每组处死2只大鼠，取出视网膜，采用Western blot法测定视网膜Rho蛋白和GS蛋白表达量。Rho蛋白和GS蛋白的表达量以Rho蛋白或GS蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值表示。

移植后视网膜外核层厚度测定：移植后28 d，每组处死2只大鼠，取出眼球，取出晶体和角膜，制成眼杯，石蜡包埋，切成厚5 μm后的切片，行常规苏木精-伊红染色，采用Image J软件测量视网膜外核层厚度。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行分析，多组均数比较采用方差分析，组内两两均数比较采用LSD检验，取P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

视网膜色素变性的基因治疗是利用RNA干扰技术置换致病基因，使致病基因沉默，或者将载体DNA整合到视网膜细胞内，不同视网膜变性阶段采用不同的基因治疗方法，当视网膜细胞结构完整时，可通过RNA干扰技术抑制突变体转录或者使用基因替代遗传缺陷；当视网膜细胞的功能结构发生变化时，主要通过转导表达神经营养因子及抗凋亡基因发挥视网膜保护作用^[15-18]。用于基因治疗的载体有病毒型载体和非病毒型载体，非病毒性载体包括脂质体、纳米粒子、质粒等；病毒性基因治疗包括腺病毒、慢病毒、反转录病毒、腺相关病毒等。近年来细胞移植治疗在视网膜色素变性的治疗中取得巨大进步，通过移植的细胞代替凋亡细胞，移植的细胞还可以分泌生长因子促进视网膜细胞存活^[19-23]，脂肪间充质干细胞是干细胞的主要来源之一，具有较强的多向分化能力和体外扩增能力^[24-26]，且分离培养比较容易，来源较充足，是继骨髓间充质干细胞之后干细胞研究的新的热点^[27-29]。

脂肪间充质干细胞还可作为良好的载体，脂肪间充质干细胞经其他基因修饰后可高效稳定表达目的基因，发挥治疗作用，将脂肪间充质干细胞经基因修饰后移植到体内，既可发挥外源基因的治疗作用又可发挥脂肪间充质干细胞本身的分化和保护作用，对修复受损的细胞具有比较重要的意义^[30-33]。

实验构建GAP-43慢病毒载体，并将其转染脂肪间充质干细胞，检测脂肪间充质干细胞GAP-43蛋白表达情况，结果发现：感染LV5-GAP病毒的脂肪间充质干细胞可表达GAP-43蛋白，阴性对照组和空白对照组脂肪间充质干细胞不表达GAP-43蛋白。表明GAP-43基因能够成功被导入脂肪间充质干细胞并能够稳定表达GAP-43蛋白。将感染LV5-GAP病毒的脂肪间充质干细胞移植到RCS大鼠视网膜下腔，观察视网膜内脂肪间充质干细胞的变化情况发现，脂肪间充质干细胞移植后，脂肪间充质干细胞在大鼠变性的视网膜内逐渐消失，移植后3 d见荧光细胞，移植后7 d荧光细胞明显减少，移植后21 d基本无荧光细胞。测定移植后视网膜内GAP-43蛋白的表达情况发现，脂肪间充质干细胞移植后，随着时间的延长，GAP-43表达量逐渐升高，移植后7，14，21 d的视网膜内GAP-43蛋白表达量均高于移植后3 d；移植后14，21 d的视网膜内GAP-43蛋白表达量高于移植后7 d；移植后21 d的视网膜内GAP-43蛋白表达量高于移植后14 d。表明移植早期感染LV5-GAP病毒的脂肪间充质干细胞比较多，但GAP-43的表达量较低，随着移植时间的延长，LV5-GAP病毒的脂肪间充质干细胞数量逐渐减少，至移植后21天时LV5-GAP病毒的脂肪间充质干细胞基本完全消失，而GAP-43则随着移植时间的延长表达量不断升高，其机制可能为GAP-43创造了突触再生和神经形成的环境，在神经元形成新突触的过程中又分泌GAP-43，使GAP-43的表达量不断增加，由此可推断脂肪间充质干细胞虽然没有和神经元接触但能够分泌神经营养因子，其分泌的神经营养因子对视网膜的内环境有调节作用，能够改善神经元的营养状态，同时GAP-43的高表达能够促进突触连接，两者相互作用对视网膜发挥保护作用。

GAP-43可参与细胞的吞噬作用，能够调节神经胶质细胞和神经元的形态变化，在视网膜的发育中也具有重要作用，GAP-43在视觉系统的发展阶段主要在视网膜神经节细胞中表达，在光感受器细胞中几乎不表达^[34-35]，在成熟的视网膜中GAP-43不表达，GAP-43在视神经的再生中只在神经纤维层和神经节细胞层有表达，能够表达GAP-43的视网膜细胞具有较高的可塑性，在维持视网膜结构完整上具有重要作用^[36-37]。视网膜色素变性的主要病理特征为光感受器细胞的凋亡，Tho只在视杆细胞中表达，大鼠视网膜光感受器细胞主要为视杆细胞，因此光感受器细胞数量可用Rho表达量进行评估，实验选择Rho评估GAP-43修饰脂肪间充质干细胞移植对光感受器细胞的影响。Müller细胞是视网膜中特殊的胶质细胞，在调节神经元代谢、维持神经元稳态、视网膜的屏障调节中发挥重要作用，Müller细胞是视网膜中唯一能合成GS蛋白的细胞。GS蛋白是Müller细胞的常用标志物，位于Müller细胞浆内，在保护视网膜神经元细胞核维持谷氨酸平衡方面发挥重要作用，实验选择GS蛋白评价GAP-43修饰脂肪间充质干细胞移植对Müller细胞状态的影响。实验结果发现：移植后28 d，实验组和对照组大鼠视网膜Rho蛋白和GS蛋白的表达量高于假手术组；实验组大鼠视网膜Rho蛋白表达量高于对照组；实验组大鼠视网膜GS蛋白表达量低于对照组；实验组和对照组大鼠视网膜外核层厚度高于假手术组；实验组大鼠视网膜外核层厚度高于对照组。可见脂肪间充质干细胞移植后大鼠光感受器细胞的Rho蛋白的表达量增加，光感受器细胞胞体数量增加，促进Müller细胞增殖；GAP-43感染脂肪间充质干细胞移植后光感受器细胞的Rho蛋白的表达量更高，能够更好的包外核层厚度，但对Müller细胞增殖的影响不及单纯脂肪间充质干细胞，考虑GAP-43对胶质细胞的过度增殖有抑制作用，防止“胶质封闭”的形成；由此可见脂肪间充质干细胞对光感受器细胞有保护作用，GAP-43修饰的脂肪间充质干细胞对光感受器细胞的保护作用更佳。

生长相关蛋白43基因修饰脂肪间充质干细胞对视网膜色素变性的修复及保护

Growth-associated protein-43 gene modified adipose-derived mesenchymal stem cells protect against retinitis pigmentosa

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