人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导髓核细胞退变的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.002

摘要/Abstract

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文题释义：
华通胶脐带间充质干细胞：取自新生儿脐带，脐带属于医疗废弃物，与骨髓间充质干细胞相比，华通胶脐带间充质干细胞供应丰富且无创伤性，更干净，原始性好，免疫原性低，增殖能力更快、更强，能够满足短期内对大量干细胞的需求，而且不会给捐赠者带来并发症；华通胶脐带间充质干细胞有天然向软骨细胞分化的特点，其细胞外基质组成与软骨细胞相似。将华通胶脐带间充质干细胞移植入急性脊髓损伤的大鼠模型中，还可明显改善损伤部位的微环境，抑制白细胞介素1β的表达，增加神经生长因子表达，修复受损的神经组织。

摘要
背景：人脐带华通胶间充质干细胞移植到犬退变椎间盘模型中可存活，恢复部分椎间盘高度，但其对炎性损伤后髓核细胞是否有修复治疗作用目前还没有文献报道。
目的：观察人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导大鼠髓核细胞退变的保护作用。
方法：将第3代SD大鼠髓核细胞分3组培养，对照组用含胎牛血清的培养基培养24 h，然后换完全培养基培养24 h；白细胞介素1β组以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h，然后换完全培养基培养24 h；实验组先以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h，再更换完全培养基与人脐带华通胶间充质干细胞非直接共培养24 h。采用Annexin V/PI染色后流式细胞仪测定3组髓核细胞凋亡率，RT-PCR测定各组髓核细胞基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂1的表达，caspase试剂盒检测caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。
结果与结论：①白细胞介素1β组、实验组细胞凋亡率高于对照组(P < 0.05)，实验组低于白细胞介素1β组(P < 0.05)；②白细胞介素1β组、实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量高于对照组(P < 0.05)，基质金属蛋白酶抑制剂1表达量低于对照组(P < 0.05)；实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量低于白细胞介素1β组，基质金属蛋白酶抑制剂1表达量高于白细胞介素1β组(P < 0.05)；③白细胞介素1β组、实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性高于对照组(P < 0.05)，实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性低于白细胞介素1β组(P < 0.05)；④结果表明，人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导的髓核细胞退变凋亡有明显的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1090-3946(马迅)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 人脐带华通胶间充质干细胞, 退变, 凋亡, 细胞凋亡途径, 髓核细胞, 非接触式共培养

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells (hWJCs) via transplantation are able to survive in a dog model of intervertebral disc degeneration and to partially restore the height of the intervertebral disc. However, there is no study on whether hWJCs can repair nucleus pulposus cells after inflammatory injury as yet.
OBJECTIVE: To observe the protective effect of hWJCs on interleukin-1β induced rat nucleus pulposus degeneration.
METHODS: Nucleus pulposus cells at passage 3 from Sprague-Dawley rats were divided into three groups: (1) normal control group cultured in culture medium containing fetal bovine serum for 24 hours, and then cultured in complete medium for 24 hours; (2) intervention group with interleukin-1β intervention for 24 hours, followed by culture in the complete medium for 24 hours; (3) co-culture group with interleukin-1β intervention for 24 hours, followed by culture in the complete medium for non-direct co-culture with hWJCs for 24 hours. Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) double staining and flow cytometry were used in succession to measure the apoptosis rate of nucleus pulposus cells in each group. The ADAMTS-4, MMPs-3 and TIMP-1 expression in nucleus pulposus cells was observed though RT-PCR. The activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were determined by caspase kit.
RESULTS AND CONCLUSION: The apoptosis rates were ranked as follows: the intervention group > co-culture group > normal control group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). Compared with the control group, the expression levels of ADAMTS-4 and MMPs-3 were significantly higher and the expression level of TIMP-1 was significantly lower in the intervention and co-culture groups (P < 0.05). Compared with the intervention group, the expression levels of ADAMTS-4 and MMPs-3 were significantly lower and the expression level of TIMP-1 was significantly higher in the co-culture group (P < 0.05). The expression activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were highest in the intervention group, followed by the co-culture group, and lowest in the normal control group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). To conclude, hWJCs has obviously inhibitory effect on the apoptosis of degenerated nucleus pulposus cells induced by interleukin-1β.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Intervertebral Disk Degeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李浩阳，陈旭，李强，马迅. 人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导髓核细胞退变的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3943-3948.

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3至11月在山西医科大学附属第二医院中心实验室完成。

1.3 材料 取2例足月妊娠健康新生儿脐带，产妇健康无任何传染性疾病，通过山西医科大学附属第二医院伦理委员会并已征求患者及家属同意。

实验动物：3月龄健康雄性SD大鼠2只，体质量约220 g，由山西医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(晋)2016-0380。

主要试剂和仪器：胰蛋白酶(solaibo，中国)；Ⅱ型胶原酶、DMEM/F12培养液(HyClone，美国)；PBS(博士伦，中国)；特级胎牛血清(Sciencell，美国)；Tanswell培养板(Corning，美国)；白细胞介素1β(PeproTech公司，美国)；Annexin V-FITC/PI试剂盒(BD，美国)；反转录试剂盒(TAKARA，中国)；Reatime PCR仪(ABI7300，美国)；流式细胞仪(Beckman，美国)；酶标仪(BioTek，美国)；Bradford试剂盒(Beyotime，中国)；caspase-3、8、9试剂盒(普利莱，中国)。

1.4 实验方法

1.4.1 hWJCs的分离和培养 无菌条件下取健康新生儿脐带约15 cm放入装有PBS和双抗的离心管中，转移至超净台用无菌生理盐水反复冲洗二三遍，将脐带分为长度约3 cm的小段，依次剥离脐带外膜，去除2条脐动脉和1条脐静脉，用手术弯钳分次剥下胶样组织置入培养皿中，用眼科剪刀将组织剪成1 mm×1 mm×1 mm碎块后转移至离心管中，用PBS冲洗2遍，1 200 r/min离心10 min，弃离心液，添加含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12，用吸管吹打混匀后转移到培养瓶中，置入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，1周可观察到组织块周围放射状分布的贴壁细胞，倒掉组织块首次换液，以后每3 d换液1次，待细胞成80%-90%融合率后传代培养。取第3代hWJCs用于细胞实验。采用流式细胞仪检测第3代hWJCs细胞CD29、CD44、CD14、CD34及HLA-DR位点。

1.4.2 髓核细胞的分离和培养 将2只SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.8 mL 麻醉后，采用颈椎脱臼法处死，以体积分数75%医用乙醇浸泡10 min，固定在动物手术台，无菌条件下分离出胸腰段脊柱转入超净台，PBS冲洗2遍后剥离脊柱周围肌肉组织，暴露出椎间盘，用注射器针头挑出各节段白色胶冻样髓核组织，用眼科剪剪碎后置入离心管，加入2%Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴2.0-3.0 h，每15 min振荡1次，以1 200 r/min离心5 min，弃掉上清，用PBS冲洗2遍，1 200 r/min离心5 min，弃掉离心液；添加0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA，在37 ℃水浴箱中消解几分钟，期间震荡摇匀1次，1 000 r/min离心5 min后弃上清，用PBS清洗二三遍，分别离心弃除上清，在底层沉淀细胞加入5 mL DMEM培养基(含体积分数20%胎牛血清)，用吸管吹打混匀为单细胞悬液，接种在二三个培养瓶底部，置入培养箱中，1 d后观察到细胞可以贴壁，五六天第1次换液，之后隔3 d换液，待原代细胞达到80%-90%进行传代培养，取第3代髓核细胞用于实验。

1.4.3 非接触式共培养及其实验分组 将第3代髓核细胞以1×10⁶的密度接种于6孔板，分3组培养：对照组用含体积分数0.5%胎牛血清的培养基培养24 h，然后换含体积分数10%胎牛血清的完全培养基培养24 h；白细胞介素1β组在含体积分数0.5%胎牛血清的培养基中添加10 μg/L白细胞介素1β炎性刺激24 h，然后改换含体积分数10%胎牛血清的完全培养基培养24 h；实验组在含体积分数0.5%胎牛血清的培养基中加入10 μg/L白细胞介素1β炎性刺激24 h，然后在换完全培养基的同时插入接种好1×10⁶ hWJCs的Transwell小室再培养24 h，进行非接触式共培养^[10]。

1.5 主要观察指标

流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率：用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集各组髓核细胞，以2 000 r/min离心5 min，用PBS清洗细胞2遍，加入500 μL AnnexinV 结合缓冲液悬浮细胞，依次加入5 μL Annexin V和5ulPI振荡混匀，避光室温反应10 min，1 h内用流式细胞仪检测各组髓核细胞凋亡率(Ex=488 nm，Em=530 nm)，绿色荧光通过FITC通道用FL1检测，红色荧光经过PI通道用FL3检测。

RNA提取与RT-PCR检测：收集各组髓核细胞，分别加入1 mL预冷Trizol试剂用吸管吹打混匀，每管添加0.2 mL氯仿，混匀，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，使样品分成3相，取0.5 mL上层水相滴入干净EP管并添加1 mL异丙醇振荡混匀，离心后去除上清，用1 mL体积分数75%乙醇清洗RNA沉淀，4 ℃ 10 000 r/min离心后倒掉上清，室温下干燥RNA沉淀数分钟转移到10 μL无RNA酶水中保存备用。取500 ng RNA样品按照TAKARA反转录试剂盒说明书配制RT反应液，混匀并离心后PCR仪进行反转录反应合成第一链cDNA，以其为模板置入引物进行PCR反应。检测各组基质金属蛋白酶4(基因编号：NM_172845)、基质金属蛋白酶3(编号：NM_010809)、基质金属蛋白酶抑制剂1(编号：NM_001044384)表达情况。

caspase-3、8、9活性检测：根据普利莱基因提供的caspase-3活性测定试剂盒操作，将10 mmol/L pNA标准品设置成不同浓度梯度，分别取100 μL加入96孔板中，用酶标仪测定在波长405 nm下的A值，描绘pNA浓度对A₄₀₅值的标准曲线，用作计算样品caspase的活性。用胰酶消化并收集6孔板各组髓核细胞，离心后收集细胞，吸尽上清后加入 50 μL裂解液振荡混匀，冰浴10 min后摇匀，4 ℃，10 000×g离心10 min，取上清液测定。根据酶活力高低取各组待测样品10 μL或20 μL，各组加入反应缓冲液均至95 μL，最后加入5 μL caspase-3的显色底物DEVD-pNA至100 μL，盖好96孔板并有封口膜封紧，在37 ℃恒温箱里反应2 h，待颜色变黄时用酶标仪测定在波长405 nm条件下的A值，样品管A₄₀₅值减去空白对照A₄₀₅值，就是样品的caspase-3水解特异性底物所产生的硝基苯胺吸光度。根据标准曲线计算其含量，并用蛋白浓度校正。同样的操作方法测定caspase-8和caspase-9，不同之处在于测定caspase-8时加入的显色底物是IETD-pNA，caspase-9的显色底物是LEHD-pNA。

1.6 统计学分析 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，所有实验重复3次(n=12)，计量数据均以x(_)±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异性，多重比较采用LSD检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

干细胞治疗椎间盘退变是近年来研究的热点。骨髓间充质干细胞是肌肉骨骼组织工程中常用的干细胞类型之一，骨髓间充质干细胞对炎症因子诱导的髓核细胞退变凋亡有明显抑制作用^[11]。然而人骨髓间充质干细胞在应用中也有一定的局限性，人类骨髓间充质干细胞的数量及分化潜能会随着年龄的增长明显下降，此外在收集过程也有创伤，会给捐助者带来痛苦还有可能产生出血、感染等并发症^[12-13]。hWJCs取自新生儿脐带，脐带属于医疗废弃物，与骨髓间充质干细胞相比，hWJCs供应丰富且无创伤性，更干净，原始性好，免疫原性低，增殖能力更快更强，能够满足短期内对大量干细胞的需求，而且不会给捐赠者带来并发症^[14]；hWJCs有天然向软骨细胞分化的特点，其细胞外基质组成与软骨细胞相似^[15-16]。将hWJCs移植入急性脊髓损伤的大鼠模型中，还可以明显改善损伤部位的微环境，抑制白细胞介素1β的表达，增加神经生长因子表达，修复受损的神经组织^[17]。hWJCs移植入急性肾损伤的小鼠模型中，可以抑制线粒体途径介导的肾小管上皮细胞凋亡，且能促进细胞的增殖^[18]。人脐带间充质干细胞对体外培养的退变凋亡椎间盘细胞是否可起到保护作用是作者研究的课题。

实验旨在研究hWJCs对退变髓核细胞的抗炎抗凋亡能力，采用10 μg/L白细胞介素1β刺激低血清培养下的髓核细胞24 h，局部微炎症环境可以诱导其退变凋亡，初步建立髓核细胞退变凋亡模型；使用体积分数0.5%的低浓度血清是因为人体正常椎间盘本身处于低营养环境中，营养来源主要是终板的渗透作用^[10^，^19]。然后将hWJCs与白细胞介素1β诱导后的髓核细胞非接触共培养24 h后，发现实验组髓核细胞凋亡率及导致退变的相关基因基质金属蛋白酶4和基质金属蛋白酶3表达比白细胞介素1β组明显降低，基质金属蛋白酶抑制剂1的表达明显升高；基质金属蛋白酶4和基质金属蛋白酶3可使蛋白聚糖水解破坏，增加细胞外基质分解，参与椎间盘的退变^[20-21]；基质金属蛋白酶抑制剂1可抑制基质金属蛋白酶的活性，减少基质金属蛋白酶对细胞外基质的水解破坏，从而延缓作椎间盘的退变^[22]。实验使用的Transwell小室确保脐带间充质干细胞本身是无法通过小室孔膜作用退变的髓核细胞的，但是它分泌的细胞因子可自由通过。考虑是脐带间充质干细胞的旁分泌作用抑制了髓核细胞的凋亡及基质金属蛋白酶4和基质金属蛋白酶3基因的表达，同时促进了基质金属蛋白酶抑制剂1基因的表达。研究显示，脊索细胞分泌细胞因子可通过抑制退变髓核细胞caspase-9与caspase-3/7的表达活性，上调促进合成代谢基因(如蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、CD44、基质金属蛋白酶抑制剂1)的表达，下调基质降解基因(如基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶4)的活性，抑制髓核细胞的凋亡^[23]。

细胞凋亡有多条经典途径，其中线粒体途径是线粒体释放的细胞色素C激活caspase-9，进而产生下游casepase级联反应，导致细胞凋亡^[24]。死亡受体途径是细胞表面死亡受体通过结合特异性配体，激活相关caspase诱导细胞凋亡^[25-26]。caspase-9和caspase-3位于下游介导细胞线粒体凋亡途径，而caspase-8是死亡受体途径上游的关键酶^[27]。实验中白细胞介素1β组髓核细胞caspase-3、casepase-8和caspase-9表达活性均比对照组明显升高，说明髓核细胞在炎症因子诱导下可能同时经线粒体和死亡受体2条途径退变凋亡；然而炎性干预后的髓核细胞与hWJCs非直接共培养24 h后，实验组caspase-3、casepase-8和caspase-9表达活性比白细胞介素1β组明显降低，这说明hWJCs分泌的保护性因子可能同时作用了2条凋亡途径，从而抑制了髓核细胞的退变凋亡。研究显示，间充质干细胞具有强大的旁分泌功能，间充质干细胞可分泌多种抗凋亡因子、生长因子、抗炎因子等抑制细胞凋亡^[28]。

实验证明了人脐带间充质干细胞在对白细胞介素1β诱导的髓核细胞退变凋亡有明显的抑制作用，但具体的分子作用机制有待进一步研究。人脐带间充质干细胞是治疗椎间盘退变性疾病有潜力的干细胞类型之一，未来会有更广阔的应用前景。