脉冲磁场对颅脑损伤脑组织中内源性神经干细胞因子的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.016

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脉冲磁场在神经修复中的作用：脉冲磁场具有诱导神经细胞再生，促进脑创伤、脊髓损伤修复，改善记忆功能等重要的作用。脉冲磁场作用于细胞质膜，无论是电荷穿越质膜迁移所携带的信息还是细胞膜两侧离子浓度均会发生变化，导致细胞生理、结构发生改变，促使受损细胞修复、增生。
nestin蛋白：脑组织中nestin属于中间丝蛋白，只在外胚层多潜能的神经前体细胞中表达，并随神经上皮分化成熟程度而逐渐消失，可作为神经干细胞增生标志物。

摘要
背景：有研究指出，脉冲电磁在促进及诱导脑梗死、脊髓损伤周围神经再生，改善神经疾病患者记忆功能等方面有良好效果。
目的：探讨脉冲磁场对颅脑损伤大鼠脑功能及脑组织中内源性神经干细胞因子的影响。

方法：将320只雄性成年SD大鼠随机分为模型组、脉冲磁场0.1 mT组、脉冲磁场0.3 mT组及脉冲磁场 0.5 mT组，均采用侧向液压打击法建立颅脑损伤模型，脉冲磁场0.1 mT组、脉冲磁场0.3 mT组及脉冲磁场0.5 mT组建模后给予相应强度的脉冲磁场照射，照射后1，3，7，14 d，进行平衡木行走实验、水迷宫实验，以测定大鼠运动功能；相应照射时间点前1 d，腹腔注射BrdU，应用免疫组织化学法测定脑组织BrdU及皮质巢蛋白阳性细胞数。

结果与结论：①照射后1，3，7 d，脉冲磁场0.1，0.3，0.5 mT组水迷宫实验时间、平衡木行走实验均短于模型组(P < 0.05)，脉冲磁场0.5 mT组水迷宫实验时间、平衡木行走实验均短于脉冲磁场0.1，0.3 mT组(P < 0.05)，脉冲磁场0.3 mT组水迷宫实验时间、平衡木行走实验均短于脉冲磁场0.1 mT组(P < 0.05)；②照射后3，7，14 d，脉冲磁场0.1，0.3，0.5 mT组BrdU及皮质巢蛋白阳性细胞数多于模型组(P < 0.05)，脉冲磁场0.5 mT组BrdU及皮质巢蛋白阳性细胞数多于脉冲磁场0.1，0.3 mT组(P < 0.05)，脉冲磁场0.3 mT组BrdU及皮质巢蛋白阳性细胞数多于脉冲磁场0.1 mT组(P < 0.05)；③结果表明，脉冲磁场能明显保护颅脑损伤大鼠脑功能，且电磁场强度越强效果越明显，其可能机制与脉冲磁场激活颅脑损伤大鼠脑组织中神经干细胞及促进其增殖有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5410-6316(甘晓)

关键词: 干细胞, 分化, 内源性神经干细胞因子, 脉冲磁场, 颅脑损伤, 大鼠, 脑功能

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that pulsed electromagnetism has a good effect in promoting peripheral nerve regeneration after cerebral infarction and spinal cord injury, and improving memory function in patients with neurological disorders.

OBJECTIVE: To investigate the impact of pulsed magnetic field on brain function and endogenous neural stem cell factor in the brain tissue of rats with brain injury.

METHODS: Totally 320 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group, pulsed magnetic field 0.1 mT group, pulsed magnetic field 0.3 mT group and pulsed magnetic field 0.5 mT group (n=80 per group). After brain injury models were established using lateral hydraulic strike method, rats in the latter three groups were exposed to pulsed magnetic fields 0.1, 0.3, 0.5 mT, respectively. After electromagnetic radiation 1, 3, 7, 14 days, the motor function of rats was evaluated by beam-walking test and water maze test. Rats were intraperitoneally injected 5-deoxy-uridine (BrdU) at 1 day prior to different radiation time points, and BrdU and nestin expressions in the cerebral cortex were measured by immunohistochemical method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The time of water maze test and the beam-walking test at 1, 3 and 7 days after irradiation was ranked as follows: pulse magnetic field 0.5 mT < pulse magnetic field 0.3 mT < pulse magnetic field 0.1 mT < model group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). (2) The expressions of BrdU and nestin at 1, 3 and 7 days after irradiation were highest in the pulse magnetic field 0.5 mT group, successively followed by pulse magnetic field 0.3 mT group, pulse magnetic field 0.1 mT group and model group (P < 0.05). In summary, the pulse magnetic field exhibits remarkable protective effects on the brain function of rats with craniocerebral injury in an intensity-dependent manner. The possible mechanism is related to the activation of neural stem cells and the proliferation of neural stem cells in the brain tissue of rats with craniocerebral injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Neural Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

甘晓，张东波，刘向业，傅刘鹏，白新学，吴南力. 脉冲磁场对颅脑损伤脑组织中内源性神经干细胞因子的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3376-3381.

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 前瞻性随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年6月至2016年6月在郑州大学附属医院南阳市中心医院完成。

1.3 材料

实验动物：选取320只成年雄性SD大鼠，体质量180-200 g，购于河北省实验动物中心，生产许可证号：SCXK(冀)2004-1-005。所有动物购买回来后在屏障环境下常规饲养。将320只大鼠随机分为模型组、脉冲磁场0.1 mT组、脉冲磁场0.3 mT组及脉冲磁场0.5 mT组，每组80只。

主要试剂及仪器：异氟烷、牙黏固粉(西安化学试剂公司)；硅胶(安阳宗言牙科器材有限公司)；生理盐水(华北制药厂)；5-脱氧尿嘧啶核苷、兔抗BrdU单克隆抗体(美国Sigma公司)；兔抗nestin单抗(北京中山生物科技有限公司)；RJ-W-MZ-1型微型电动磨钻(羌湖锐进医疗设备有限公司)；侧向液压打击装置(自制)；手术器械(上海医疗器械设备厂)；WDT-V型脑立体定向仪(西安万东仪器设备有限公司)；平衡木实验设备、水迷宫实验设备(郑州大学神经解剖教研室)；脉冲辐射仪(北京贝林医疗器械厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立颅脑损伤大鼠模型 参照文献建立颅脑损伤大鼠模型，所有入组大鼠给予1.5%-2.5%异氟烷吸入麻醉，并将大鼠置于37-38 ℃恒温箱中，进行术前备皮、消毒，然后将大鼠固定在立体定向仪上，在无菌环境下切开右颞部表皮，切断右侧颞肌，分离骨膜，充分显露颅骨并彻底止血。在距前卤1.5 mm，距中线偏右8 mm处应用牙科磨钻开直径为3 mm的骨孔，采用牙粘固粉及硅胶将液压打击帽固定在骨孔上，并注入生理盐水，然后将大鼠固定在侧向液压打击设备上。应用钳夹法刺激大鼠后爪，每间隔15 s刺激1次，观察大鼠回撤反射情况。施行液压打击后，在短时间内大鼠后肢回撤反射将消失，直到几十秒至几分钟后才恢复回撤反射，这过程为意识丧失，当大鼠意识丧失时间大于120 s则视为建模成功。

造模过程中密切留意大鼠呼吸情况，对于呼吸暂停大于45 s，立刻将大鼠置于100%纯氧中恢复自主呼吸。对于恢复自主呼吸的大鼠，立刻移除液压打击帽并缝合切口，并将大鼠置于温箱中至麻醉苏醒。

1.4.2 脉冲电磁照射 造模成功后即刻，将脉冲磁场强度0.1，0.3，0.5 mT组大鼠置于充满辐射的环境中，分别在0.1，0.3，0.5 mT强度的脉冲磁场中照射1，3，7，14 d，脉冲磁场频率为15 Hz，大鼠在脉冲磁场中活动不受限制。模型组大鼠不行脉冲电磁辐射。

1.5 主要观察指标 于照射1，3，7，14 d后，每组每个时间点取6只大鼠，进行以下测试。

水迷宫实验测试：共对大鼠进行2次培训，第1次将大鼠置于水池边，让大鼠在180 s内套上高台，如在规定时间内大鼠未能上高台，研究人员将引导大鼠，将其置于高台10 s，相隔5 min后再对大鼠进行培训。第2次培训结束5 min后进行决定性实验，在水下放置高台，让实验大鼠在同一水平线出发登上高台，记录大鼠登上高台时间。若大鼠在180 s内未能登上高台，逃避时间记录为180 s。

平衡木行走实验：平衡木行走装置由暗箱、刺激源及连接中间的木条(长120 cm×宽2.5 cm)组成，刺激源包括40 W光源及强噪声，整个实验在暗箱中进行，木条距地面90 cm，在木条上放置高3 cm的木块以提高大鼠平衡木行走难度。实验开始时打开噪声源，刺激大鼠，让大鼠经过木条跑向暗箱，记录大鼠到达暗箱的时间。所有大鼠在实验前1周进行适应性训练，完全建立条件反射后再进行正式实验。大鼠达到暗箱时间越短表明其精细协调运动能力越好，若大鼠在20 s内未能进入暗箱或从木条掉下则统一记为20 s。

免疫组织化学法测定脑组织nestin、BrdU的表达：各组大鼠处死前24 h于腹腔内注射BrdU，共注射3次，每6 h注射1次，注射完毕12 h后应用1.5%-2.5%异氟烷吸入麻醉，然后应用脊椎脱臼法处死大鼠，开颅取出脑组织，应用40 g/L多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，行冠状位切片，切片后常温脱蜡加入3%甲醇溶液，常温下山羊血清封闭20 min，加入兔抗nestin单抗及兔抗BrdU单抗，置湿盒4 ℃过夜，生物素标记二抗，室温下静置10 min，加入辣根过氧化酶，室温下静止10 min，滴入DAB显色剂，室温显色5-10 min，中性树脂封固。以细胞核中出现棕黄色染色为nestin阳性、BrdU阳性。

1.6 统计学分析 数值变量采用x(_)±s表示，应用SPSS 19.0数据包进行进行正态分布检验、t 检验、方差齐性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脉冲磁场在神经内科领域中的应用越来越受到关注，如具有诱导神经细胞再生，促进脑创伤、脊髓损伤修复，改善记忆功能等重要的作用^[9-10]。脉冲磁场作用于细胞质膜，无论是电荷穿越质膜迁移所携带的信息还是细胞膜两侧离子浓度均会发生变化，导致细胞生理、结构发生改变，促使受损细胞修复、增生^[11]。Klein等^[12]采用脉冲磁场作用于脑缺血损伤大鼠，发现脉冲磁场能有效改善大鼠血液流变学，降低血液中自由基、过氧化酶等物质含量，从而阻止脑组织过氧化损伤。Nakatomi等^[13]研究了脉冲磁场对急性脑梗死大鼠神经功能的影响，证明了脉冲磁场刺激在一定程度上能促进受损神经恢复，改善大鼠学习、记忆能力。研究中脉冲磁场组大鼠在水迷宫实验、平衡木行走试验中所需时间均短于模型组，且随着脉冲磁场强度增强，大鼠在水迷宫实验、平衡木行走实验中所需时间显著缩短，提示脉冲磁场能有效改善颅脑损伤大鼠肢体运动功能，降低颅脑损伤后行为障碍的发生。

近年大量研究指出，在哺乳动物大脑皮质、海马区、脑室下区等区域均存在内源性神经干细胞^[14-18]。在正常生理状态下，内源性神经干细胞处于静息状态，当在脑部缺血、大脑损伤等病理状态下可被激活及增殖，从而在神经功能再生及重塑过程中起到重要的作用。目前多项研究指出，内源性神经干细胞在中枢神经元损伤后再生中起到重要作用，可为脑出血、脑损伤等中枢神经疾病修复带来希望，同时为其治疗提供新的思路^[19-22]。尽管脑损伤后可激活内源神经干细胞，从而在脑组织损伤修复中发挥作用，但内源性神经干细胞增殖数量有限，无法满足脑组织代偿需求，同时在脑损伤后由于机体处于炎症损伤状态，会导致新生神经元出现程序性死亡，单纯依靠脑损伤后机体自行产生的内源性神经干细胞对脑组织进行修复所获得的效果不并理想^[23-25]。因此进一步促进脑损伤后内源性神经干细胞增殖，对改善颅脑损伤患者预后具有重要的意义。研究表明，对大脑行脉冲磁场刺激可激活神经干细胞，同时可增加细胞内环磷酸腺苷浓度，改善细胞能量代谢，促进神经干细胞增生^[26]。脑组织中nestin属于中间丝蛋白，只在外胚层多潜能的神经前体细胞中表达，并随神经上皮分化成熟程度而逐渐消失，可作为神经干细胞增生标志物^[27]。BrdU属于胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞增殖周期S期可嵌入细胞核DNA中，可用于标记具有增殖活性的细胞^[28]。

研究应用免疫组织化学法测定各组大鼠脑组织中nestin、BrdU表达情况，结果显示，各脉冲磁场组在照射3，7，14 d 时的nestin阳性细胞数、BrdU阳性细胞数均高于模型组(P < 0.05)，表明脉冲磁场治疗颅脑损伤的作用机制可能与其能激活脑组织神经干细胞并促进其增殖，改善大鼠神经功能恢复有关。研究中，脉冲磁场0.5 mT组脉冲照射3，7，14 d时的nestin阳性细胞数、BrdU阳性细胞数多于脉冲磁场0.1，0.3 mT组，脉冲磁场0.3 mT组多于脉冲磁场0.1 mT组；在14 d时，各脉冲磁场组nestin阳性细胞数、BrdU阳性细胞数比较差异无显著性意义，这可能由于神经干细胞激活及增殖发生在颅脑损伤早期，随着损伤时间延长，神经干细胞可能出现程序性凋亡，导致脑组织中nestin、BrdU表达减少有关，因此提示临床工作者尽早对颅脑损伤者开展脉冲磁场治疗可提高治疗效果^[29-40]。

综上所述，脉冲磁场能明显保护颅脑损伤大鼠脑功能，且电磁场强度越强，效果越明显。可能机制与脉冲磁场可激活颅脑损伤大鼠脑组织中神经干细胞及促进其增殖有关。