腺病毒载体携带标记基因EGFP转染人羊膜上皮细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3382-3387.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.017

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

腺病毒载体携带标记基因EGFP转染人羊膜上皮细胞

金玲¹，刘小勇²，徐玮²，郝晓宁¹，牛静宜¹，王乙婷¹，曹端荣¹

¹深圳市宝安人民医院眼科，广东省深圳市 518101；²暨南大学附属第一医院眼科，广东省广州市 510630

修回日期:2017-06-09 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 金玲，博士，副主任医师，深圳市宝安人民医院眼科，广东省深圳市 518101
作者简介:金玲，女，1976年生，湖北省十堰市人，汉族，2009年暨南大学眼科学毕业，博士，副主任医师，主要从事眼科眼表疾病和白内障的基础和临床研究。并列第一作者：刘小勇，男，1973年生，湖北省黄冈市人，汉族，2015年暨南大学眼科学毕业，博士，副主任医师，主要从事眼科眼表疾病的基础和临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(30872808，81100637)；广东省医学科学技术研究基金项目(201512902216517)；广东省科技计划项目(2015A020212026)；广东省中医药局科研项目(20162044)；深圳市科技计划基金项目(JCYJ20140414105820176, CXZZ20140418182638764)

Human amniotic epithelial cells transfected by enhanced green fluorescent protein gene mediated by adenovirus vector

Jin Ling¹, Liu Xiao-yong², Xu Wei², Hao Xiao-ning¹, Niu Jing-yi¹, Wang Yi-ting¹, Cao Duan-rong¹

¹Department of Ophthalmology, People’s Hospital of Baoan, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China; ²Department of Ophthalmology, Affiliated First Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Revised:2017-06-09 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Jin Ling, Department of Ophthalmology, People’s Hospital of Baoan, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China
About author:Jin Ling, M.D., Associate chief physician, Department of Ophthalmology, People’s Hospital of Baoan, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China. Liu Xiao-yong, M.D., Associate chief physician, Department of Ophthalmology, Affiliated First Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China. Jin Ling and Liu Xiao-yong contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30872808, 81100637; the Medical Science and Technology Research Foundation of Guangdong Province, No. 201512902216517; the Science and Technology Plan Project of Guangdong Province, No. 2015A020212026; the Scientific Research Project of Guangdong Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 20162044; the Science and Technology Plan Project of Shenzhen City, No. JCYJ20140414105820176, CXZZ20140418182638764

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
腺病毒载体：典型的腺病毒载体系统包括穿梭质粒、腺病毒基因组质粒和包装细胞293细胞，其转基因效率高，可转染不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，且容易制得高滴度病毒载体，其进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高，是目前广泛应用且最具前景的病毒载体。因而，实验选择腺病毒载体介导EGFP基因转染人羊膜上皮细胞。
细胞周期：是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期2个阶段，间期又分为3期，即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)，细胞分裂期即M期，间期是细胞合成DNA、RNA、蛋白质和各种酶的关键时期，是为细胞分裂准备物质基础的主要阶段，通过检测细胞周期可判断细胞为周期性细胞、终端分化细胞或暂不增殖细胞群。

摘要
背景：人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些性能，可诱导分化为角膜样上皮细胞，但在体外培养时无法示踪，不能有效地监测其细胞转归。
目的：探讨利用腺病毒载体将标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞的可行性及感染效率。
方法：pDC316-mCMV-EGFP腺病毒包装后，腺病毒载体携带标记基因EGFP转染体外培养的人羊膜上皮细胞，并扩增培养，观察转染后人羊膜上皮细胞与未转染人羊膜上皮细胞的形态差异，并在荧光显微镜下观察转染基因的表达，用流式细胞仪检测转染细胞的细胞周期及EGFP阳性表达率。
结果与结论：①多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人羊膜上皮细胞在形态上无显著差异；②瞬时转染后48 h的人羊膜上皮细胞中增强型绿色荧光蛋白阳性表达率最高达99.01%；③转染后的人羊膜上皮细胞的细胞周期有所减慢，说明利用腺病毒载体能将标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞，可更直观地观察到人羊膜上皮细胞在体外的进一步转归。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2163-9992(金玲)

关键词: 干细胞, 培养, 腺病毒, 绿色荧光蛋白, 人羊膜上皮细胞, 原代培养, 扩增培养, 基因转染, 转染效率, 细胞周期, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic epithelial cells have some properties of stem cells, which can be induced to differentiate into corneal epithelial cells, but cannot be traced in vitro.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility and infection efficiency of adenovirus vector carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) into the human amniotic epithelial cells.
METHODS: The adenovirus vectors carrying EGFP was transferred into human amniotic epithelial cells cultured in vitro. After cultured and amplified, the morphology difference between transfected and non-transfected human amniotic epithelial cells was observed. The transfected human amniotic epithelial cells were observed under fluorescence microscope, and the cell cycle and the expression rate of EGFP in transfected human amniotic epithelial cells were detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: No obvious difference in the cell morphology was found between transfected human amniotic epithelial cells and normal human amniotic epithelial cells cultured in vitro. Flow cytometry analysis revealed that the EGFP positive rate was highest and reached up to 99.01% at 48 hours after transient transfection. The cell cycle of human amniotic epithelial cells transfected by the adenovirus vector was slowed a bit. To conclude, the adenovirus vector is a good medium of transfecting EGFP into human amniotic epithelial cells, and makes it more convenient to observe the further transformation of human amniotic epithelial cells in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adenoviridae Infections, Green Fluorescent Proteins, Amnion, Epithelial Cells, Cell Cycle, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

金玲，刘小勇，徐玮，郝晓宁，牛静宜，王乙婷，曹端荣. 腺病毒载体携带标记基因EGFP转染人羊膜上皮细胞[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3382-3387.

Jin Ling, Liu Xiao-yong, Xu Wei, Hao Xiao-ning, Niu Jing-yi, Wang Yi-ting, Cao Duan-rong. Human amniotic epithelial cells transfected by enhanced green fluorescent protein gene mediated by adenovirus vector[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3382-3387.

图/表（结果） 1

2.1 人羊膜上皮细胞形态 在接种12 h内细胞可下沉贴壁，24 h后细胞逐渐变大，折光性降低，整个细胞轮廓变暗，完全伸展的细胞呈扁平的卵圆形(图1A)；2 d后，进入指数生长期，细胞数量明显增多, 呈不规则的多角形，四五天后90%细胞融合成片，形成单层。传代后人羊膜上皮细胞能较快贴壁，接种4-6 h后即可贴壁并开始生长，呈多形性；接种24 h后细胞生长加速，细胞扁平变大(图1B)；三四天后细胞呈90%融合，呈典型的铺路石外观，呈多形性，与原代无明显区别。培养的人羊膜上皮细胞加入转染液12 h后，有少数细胞从培养板上脱落下来漂浮于培养液中，细胞间变得稀疏(图1C)，终止转染后细胞形态和生长特性逐渐恢复正常，终止转染后48 h，细胞大多数转染细胞均与正常细胞形态上无显著差异。

2.2 荧光显微镜下观察EGFP的阳性表达 转染后12 h即可见发绿色荧光的人羊膜上皮细胞，但数量较少，强度较弱，每个低倍视野下可见0-2个细胞(图2A)；转染后24 h发绿色荧光的人羊膜上皮细胞逐渐增多、荧光强度增强(图2B)；转染后48 h发绿色荧光的人羊膜上皮细胞继续增多，几乎所有存活细胞均发出绿色荧光(图2C)；转染后72 h发绿色荧光的人羊膜上皮细胞有所减少，荧光强度开始减弱(图2D)；转染后96 h发绿色荧光的人羊膜上皮细胞继续减少，荧光强度继续减弱(图2E)。

2.3 流式细胞仪检测活细胞比例及人羊膜上皮细胞pDC316-mCMV-EGFP基因转染效率 流式细胞仪检测结果显示：未转染组人羊膜上皮细胞中，绿色荧光蛋白阳性细胞数为0.14%(图3B)，瞬时转染后12，24，48，72，96 h的人羊膜上皮细胞均可见绿色荧光蛋白阳性表达，其中瞬时转染后48 h的人羊膜上皮细胞绿色荧光蛋白阳性表达率最高，达99.01%(图3C)，但随着体外培养时间的延长和传代次数的增加其荧光表达率逐渐下降。

2.4 流式细胞仪检测细胞周期 转染后48 h的G₀/G₁期人羊膜上皮细胞占总细胞数的85.51%，G₂/M期占7.48%，S期占7.02%，G₂/G₁为2.0%，未转染的人羊膜上皮细胞G₀/G₁期占总细胞数的78.21%，G₂/M期占8.58%，S期占13.21%，与未转染细胞的细胞周期相比，转染后人羊膜上皮细胞G₀/G₁期细胞百分比大于未转染组。转染后人羊膜上皮细胞S期的细胞百分比小于未转染组，说明经腺病毒介导EGFP转染的人羊膜上皮细胞的细胞周期有所减慢(图4)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞转染观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年5至11月在暨南大学眼科实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 人羊膜 取自暨南大学附属第一医院产科住院的健康产妇的胎盘，经HIV、甲肝、乙肝、衣原体、梅毒等血清学检查均为阴性。

1.3.2 HEK293细胞及AD-mCMV-EGFP 由暨南大学生物工程研究所友情提供。

1.4 方法

1.4.1 HEK293细胞的复苏与传代 从液氮罐中取出冻存的HEK293细胞，37 ℃水浴快速融化，然后将其接种于25 cm²培养瓶中，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达80%-90%汇合度时传代，吸出培养基，加入500 μL 0.25%胰蛋白酶室温下短暂消化，于显微镜下观察到细胞皱缩变圆时立即加入DMEM培养基，反复吹打成细胞悬液，血球计数板计数，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度后重新接种于6孔板中，细胞密度为1.0×10⁶/孔，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱内培养。

1.4.2 脂质体法转染HEK293细胞 转染前2 h将HEK293细胞的培养液换成无双抗的含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，取4 μg DNA(1 μg AD-MCMV-EGFP及3 μg包装质粒)用246 μL无血清DMEM培养基稀释，充分混匀，制备成DNA稀释液，然后取8 μL Polyfectine加入到上述DNA稀释液中，充分混匀，室温静置15 min，制备出转染复合物。然后将转染复合物滴加入到含有HEK293细胞和完全培养基的6孔板中，轻柔混匀，置于含体积分数为5% CO₂的37 ℃培养箱中，孵育4 h后换液，待细胞长满，将细胞传代于25 cm²细胞培养皿中，待细胞长满皿底时，再传入75 cm²细胞培养瓶中，每天观察出毒迹象，待大部分细胞病变并从培养瓶壁脱落后，进行病毒收集，为病毒母液P1。

1.4.3 病毒扩增、滴度测定及病毒上清液的收集 当新培养的HEK293细胞汇合度达到80%-90%时加入P1代病毒AD-EGFP，48 h后收集细胞，-80 ℃/37 ℃反复冻融3次，离心收集病毒上清液，标记为P2；同样方法用P2代病毒感染大量的HEK293细胞扩增病毒至P3代；用腺病毒纯化试剂盒纯化P3代病毒。用DMEM完全培养基10倍梯度稀释病毒。具体做法如下：取96孔板，每孔含有90 μL培养基，第一横排孔每孔加入10 μL待测病毒原液，混匀后吸取10 μL混合液至第二横排孔，如此稀释至第六横排孔，进行病毒滴度的测定。在滴度测定前1 d，取48孔板，每孔加入3×10⁴个HEK293细胞及DMEM培养基，吸10 μL上述不同滴度的病毒混合液加入到相对应的48孔板中。经48 h感染，借用荧光显微镜计数荧光细胞。一般情况下(如果观察不清楚可先换PBS再进行观察)，在最高稀释梯度的孔计数出N(N<10)个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10^mTU/μL(m为稀释倍数)，即病毒滴度为 N×10^m⁺³ TU/mL，若N>10，则需继续稀释，最后收集病毒上清液，-80 ℃ 冰箱保存。

1.4.4 人羊膜上皮细胞的原代和传代培养 采用酶消化法体外分离培养人羊膜上皮细胞^[14-16]，观察细胞在体外培养条件下的生长情况，并对生长良好的原代细胞进行消化传代，在光镜下对细胞进行形态学观察和苏木精-伊红染色观察。

1.4.5 重组腺病毒pDC316-mCMV-EGFP转染人羊膜上皮细胞并扩增培养 取出-80 ℃保存的腺病毒颗粒(包括1 000 μL pDC316-mCMV-EGFP颗粒和1 000 μL腺病毒空载颗粒)，在37 ℃下迅速复苏，然后在4个EP管中依次加入500 μL腺病毒空载颗粒、500 μL腺病毒空载颗粒、500 μL腺病毒pDC316-mCMV-EGFP颗粒、500 μL腺病毒pDC316-mCMV-EGFP颗粒，轻轻混匀，静置备用。将第2代或第3代人羊膜上皮细胞接种在6孔板中，接种密度为1.0×10⁶/孔，镜下观察细胞大约有50%融合，吸尽培养基，将上述EP管中新配置的培养基加入到其中4个孔中，在剩下的2孔中分别加入1 000 μL含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基，这样就形成了2孔实验组(转基因组)、2孔空载对照组、2孔正常对照组，共6孔，将6孔板放入培养箱中继续培养24 h终止转染。

1.4.6 倒置显微镜及荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达 转染后24 h，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基终止转染，然后再继续培养12，24，48，72，96 h，倒置显微镜及荧光显微镜下观察每个时间点瞬时转染细胞绿色荧光蛋白的表达。

1.4.7 流式细胞仪检测转染细胞EGFP阳性表达率 分别收集未转染的人羊膜上皮细胞、瞬时转染后12，24，48，72，96 h的人羊膜上皮细胞，制成单细胞悬液，行流式细胞仪检测，利用cell-quest软件分析EGFP阳性细胞表达率。

1.4.8 流式细胞仪检测活细胞比例 收集生长对数期未转染的人羊膜上皮细胞及转染后48 h的人羊膜上皮细胞，用0.25%胰酶消化，重悬细胞制成单细胞悬液。PBS洗涤细胞2次，800 r/min离心5 min，用培养基调整细胞浓度。以PBS作为鞘液，激发波长488 nm作为激发光，GFP发射波长为525 nm，进行活细胞比例检测。

1.4.9 流式细胞仪检测细胞周期 收集转染后48 h的人羊膜上皮细胞1×10⁴个，离心弃上清，用预冷PBS洗细胞2次，加入预冷体积分数为70%乙醇，于4 ℃固定过夜，或-20 ℃长期固定。离心弃上清，用1 mL PBS洗细胞1次，加入500 μL PBS含50 mg/L溴化丙啶，100 mg/L RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min。然后上流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

1.5 主要观察指标 ①转染后人羊膜上皮细胞与未转染人羊膜上皮细胞的形态差异；②荧光显微镜下观察转染基因的表达；③流式细胞仪检测活细胞比例、转染细胞EGFP阳性表达率及转染细胞的细胞周期。

讨论

研究报道人羊膜上皮细胞不仅可以分泌多种细胞生长因子^[17]，如成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子，可促进细胞上皮化，人羊膜上皮细胞还可以分泌多种抗炎因子和免疫抑制因子^[18-19]，抑制炎症和免疫排斥反应，经研究表明人羊膜上皮细胞表达多能干细胞特定的表面标记蛋白OCT-4和Nanog基因^[20-22]，该基因是使细胞保持分化潜力的关键基因，说明其具有多能干细胞的分化能力，并具有胚胎干细胞的多种特性，目前已证实人羊膜上皮细胞可分化为神经细胞^[23-25]、肝细胞^[26]、皮肤细胞^[27]、毛囊细胞^[28]、胰岛细胞^[29]、内皮细胞^[30]、结膜上皮细胞^[31]，其他多种干细胞或成体细胞比如羊膜间充质干细胞^[32-35]、胚胎干细胞^[36]、毛囊干细胞^[37]、口腔黏膜上皮细胞在一定的微环境调控下可分化角膜样上皮细胞^[38-41]，并用于角膜上皮重建或眼表重建；在作者前期研究中也发现，体外培养的人羊膜上皮细胞在一定微环境的调控下也可分化为角膜样上皮细胞^[10-15]，但基因改造后的具有干细胞特性的人羊膜上皮细胞重建眼表的研究鲜有报道。

缺陷型腺病毒载体介导的基因转染可以感染静止期或分裂期的细胞，因其病毒制备和感染相对简捷，且对靶细胞几乎无病理损害，是比较理想的转基因载体^[4-5]。实验选用有CMV启动子驱动表达EGFP的复制缺陷型腺病毒感染人羊膜上皮细胞，结果表明，腺病毒载体介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞在体外培养条件下与正常体外培养的人羊膜上皮细胞在形态上无显著差异，完全伸展的细胞呈扁平的卵圆形，进入指数生长期后，呈不规则的多角形，细胞扁平变大，呈典型的铺路石样外观。荧光显微镜下观察瞬时转染12 h后即可见发绿色荧光的人羊膜上皮细胞，随着培养时间的延长，发出绿色荧光的细胞逐渐增多，流式细胞仪检测结果显示转染后48 h的人羊膜上皮细胞其绿色荧光蛋白阳性表达率高达99.01%，此次实验结果还表明腺病毒载体可介导EGFP在人羊膜上皮细胞中高效表达，可见腺病毒载体介导EGFP基因转染人羊膜上皮细胞具有一定的可行性。流式细胞仪检测发现与未转染的人羊膜上皮细胞相比，转染后48 h的人羊膜上皮细胞S期的细胞百分比有所减少，说明经腺病毒介导EGFP转染的人羊膜上皮细胞的细胞周期有所减慢，但这一实验结果还有待大样本的实验数据来证实。

实验也为观察人羊膜上皮细胞在体外培养条件下的进一步转归提供了更直观的观察手段，但实验也发现转染后的人羊膜上皮细胞中的EGFP基因多为瞬时表达，在转染后96 h发绿色荧光的人羊膜上皮细胞逐渐减少。随着时间的延长，转染后的人羊膜上皮细胞的绿色荧光表达逐渐减弱，这也验证了腺病毒载体不与宿主细胞染色体相整合，转染仅为瞬时表达的特点。如何扩增出稳定表达EGFP基因的人羊膜上皮细胞细胞株还有待进一步探讨。

腺病毒载体携带标记基因EGFP转染人羊膜上皮细胞

Human amniotic epithelial cells transfected by enhanced green fluorescent protein gene mediated by adenovirus vector

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