运动训练对椎间盘退变模型大鼠疼痛及细胞外基质合成的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.011

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (20): 3176-3182.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.011

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运动训练对椎间盘退变模型大鼠疼痛及细胞外基质合成的影响

罗海杰，柯松坚，林彩娜，万青，栗晓，刘翠翠，马超，伍少玲

中山大学孙逸仙纪念医院康复医学科，广东省广州市 510120

修回日期:2017-03-14 出版日期:2017-07-18 发布日期:2017-07-28
通讯作者: 伍少玲，主任医师，硕士生导师，博士，中山大学孙逸仙纪念医院康复医学科，广东省广州市 510120
作者简介:罗海杰，男，1990年生，广东省鹤山市人，汉族，2017年中山大学毕业，硕士，医师，主要从事腰椎间盘退变性疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81671088)

Exercise effects on pain relief and extracellular matrix production in a rat model of intervertebral disc degeneration

Luo Hai-jie, Ke Song-jian, Lin Cai-na, Wan Qing, Li Xiao, Liu Cui-cui, Ma Chao, Wu Shao-ling

Department of Rehabilitation, Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2017-03-14 Online:2017-07-18 Published:2017-07-28
Contact: Wu Shao-ling, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Rehabilitation, Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Luo Hai-jie, Master, Physician, Department of Rehabilitation, Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671088

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
椎间盘退行性病变：正常椎间盘由中心的髓核、外层的纤维环及二者之间的过渡区构成。椎间盘退变最初的形态学表现为髓核脱水、纤维环撕裂及软骨终板裂隙形成。其病理生理过程与椎间盘内细胞老化，包括椎间盘细胞密度的降低及伴随的细胞外基质合成减少，特别是与蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成减少密切相关，退变的椎间盘弹性减小，应力分布失衡，无法向四周均衡传递椎体之间的压力，从而导致脊柱稳定性破坏，导致下背痛的形成。
椎间盘的机械功能：是由细胞外基质实现的，其中提供主要机械作用的是胶原纤维和蛋白多糖这两个主要的生物大分子。蛋白多糖的吸水性使椎间盘内保持高静水压，维持椎间盘的高度；蛋白多糖浓度决定椎间盘的渗透性，影响营养成分、化学介质和细胞代谢物的通过；胶原主要对抗椎间盘承受的张力负荷。

摘要
背景：研究表明运动训练可促进健康大鼠椎间盘内细胞增殖、细胞外基质合成。对于已经退变的椎间盘，运动训练对其细胞增殖、细胞外基质合成是否同样具有促进作用？从而对其下腰痛产生影响？
目的：探讨运动训练对退变模型大鼠椎间盘内细胞外基质合成的影响。

方法：大鼠 L_5-6椎间盘注射完全弗氏佐剂制备椎间盘退变模型，术后休息2周以恢复创伤。随机分为2组，运动组大鼠每天进行跑步训练；而自然恢复组则只限于笼内自由活动。术后7，14，28，42，56，70 d进行行为学测试，并取材阿新蓝染色检测椎间盘内蛋白多糖水平，免疫组化染色检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原含量。

结果与结论：①造模术后第7天与基线值比较，大鼠穿刺椎间盘所对应背部位置的压力阈值明显降低，而整理毛发和“湿狗摇动”等自发行为指标增多，差异有显著性意义(P < 0.05)；提示完全弗氏佐剂椎间盘内注射引起退变、诱发局部痛觉过敏和行为异常；②运动组大鼠在运动训练14 d后，背部压力阈值增加、“湿狗摇动”行为减少，且与自然恢复组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，而整理毛发行为则在运动训练28 d后出现明显减少，与自然恢复组比较差异有显著性意义(P < 0.01)；提示运动训练可以减轻模型大鼠由椎间盘退变引起的疼痛；③术后第21天时，2组椎间盘髓核和纤维环中蛋白多糖、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原含量均较基线值显著下降(P < 0.01)，提示完全弗氏佐剂注射节段椎间盘发生退变；④运动组大鼠在运动训练14 d后，髓核中蛋白多糖、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原及纤维环中蛋白多糖含量明显增多，且与相应的自然恢复组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)；经过8周的运动训练，运动组大鼠髓核和纤维环的蛋白多糖含量与自然恢复组比较约增加四至五倍，髓核中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原约增加三至四倍；⑤综上所述，运动训练可以促进退变椎间盘内蛋白多糖、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原等细胞外基质的合成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID:0000-0002-7443-0172(罗海杰)

关键词: 组织构建, 组织工程, 完全弗氏佐剂, 椎间盘退行性病变, 运动训练, 细胞外基质, 椎间盘修复, 大鼠, 下腰痛, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Exercise has been proved to accelerate the proliferation of intervertebral disc cells and extracellular matrix production in healthy rats. For the degenerative intervertebral disc, whether exercise also has positive effects on its cell proliferation, extracellular matrix production or pain relief remains unclear.

OBJECTIVE: To investigate the effect of exercise on the extracellular matrix production in a rat model of intervertebral disc degeneration.

METHODS: A rat model of intervertebral disc degeneration was prepared by Freund’s complete adjuvant injection into the intervertebral disc at L_5-6levels. Then, the model rats were allowed to have a rest for 2 weeks. All rats were then randomly divided into exercise and control groups. Rats in the exercise group were forced to run every day, while the controls allowed free activities in the cage. The behavioral tests were performed at 7, 14, 28, 42, 56 and 70 days after modeling; meanwhile, the intervertebral disc samples were collected used for alcian blue staining and immunohistochemical staining to detect the levels of proteoglycan, aggrecan and collagen type II in the intervertebral disc cells, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Vocalization threshold on the rat back of punctured disc was significantly decreased, while grooming and wet-dog shaking were significantly increased at 7 days after modeling compared with the baseline (P < 0.05), suggesting that Freund’s complete adjuvant injection successfully induces disc degeneration, hyperalgesia and abnormal behaviors. Further, the vocalization threshold and wet-dog shaking in the exercise group showed significant improvement compared with the control group after 14 days of exercise (P < 0.05), while the grooming was significantly reduced until the 28^th day (P < 0.01), indicating that exercise can alleviate pain caused by disc degeneration in model rats. At 21 days after modeling, the levels of proteoglycan, aggrecan and collagen type II in the nucleus pulposus and annulus fibrosus were significantly decreased compared with the baseline (P < 0.01), indicating the occurrence of disc degeneration. After 14 days of training, the levels of proteoglycan, aggrecan, and collagen type II in the nucleus pulposus and annulus fibrosus in the exercise group were significantly increased compared with the control group (P < 0.01). Moreover, after 8-week exercise, the level of proteoglycan in the nucleus pulposus and annulus fibrosus in the exercise group was increased by 4-5 times compared with the control group, and levels of aggrecan and collagen type II in the nucleus pulposus in the exercise group also was increased by 3-4 times compared with the control group. To conclude, exercise can promote extracellular matrix increased by production by increasing the levels of proteoglycan, aggrecan, and collagen type II in the degenerative intervertebral disc.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Intervertebral Disk Degeneration, Extracellular Matrix, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

罗海杰，柯松坚，林彩娜，万青，栗晓，刘翠翠，马超，伍少玲. 运动训练对椎间盘退变模型大鼠疼痛及细胞外基质合成的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3176-3182.

Luo Hai-jie, Ke Song-jian, Lin Cai-na, Wan Qing, Li Xiao, Liu Cui-cui, Ma Chao, Wu Shao-ling. Exercise effects on pain relief and extracellular matrix production in a rat model of intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3176-3182.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入96只大鼠，随机分为2组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 运动训练对完全弗氏佐剂模型大鼠背部压力痛觉过敏的作用 术后第7天与术前相比，2组大鼠在穿刺椎间盘所对应的背部皮肤进行按压引起发声的压力阈值与术前基线值比较显著下降(P < 0.01)。术后第14天大鼠发声的压力阈值较第7天有所上升，但与术前基线值比较仍显著下降 (P < 0.01)。从术后第28天(运动训练2周)开始，运动组压力痛觉过敏症状缓解情况明显优于相应的自然恢复组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 运动训练对完全弗氏佐剂模型大鼠自发行为异常的影响 术后第7天与术前相比，2组大鼠整理毛发的持续时间延长、“湿狗摇动”的次数增加，与术前基线值相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。术后第14天2组大鼠整理毛发的持续时间较第7天有所缩短、“湿狗摇动”的次数稍减少，但与术前基线值相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)。从术后第42天(运动训练4周)开始，运动组整理毛发的持续时间较相应时间点的自然恢复组短，差异有显著性意义(P < 0.05)，而运动组“湿狗摇动”则从术后第28天(运动训练2周)开始，较相应时间点的自然恢复组明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 运动训练对完全弗氏佐剂模型大鼠椎间盘蛋白多糖合成的影响 椎间盘中蛋白多糖被染成蓝色，几乎大部分均匀地分布在髓核区域，少部分在纤维环上，并且含量由纤维环内环逐渐向外环减少，见图3。

术后第14天时，2组蛋白多糖的含量与术前基线值相比显著下降(P < 0.01)，且于第21天时含量降至最低(P < 0.01)。从术后第28天(运动训练2周)开始，运动组髓核区域和纤维环的蛋白多糖含量已基本恢复到基线水平，并且与相应时间点的自然恢复组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。而经过8周的运动训练后，运动组髓核区域和纤维环的蛋白多糖含量与自然恢复组相比有四至五倍的增加(P < 0.01)，而与术前基线值相比则有三至四倍的增加 (P < 0.01)，见图4。

2.5 运动训练对椎间盘蛋白聚糖和Ⅱ型胶原合成的影响蛋白聚糖和Ⅱ型胶原是髓核基质的重要组成成分。在术后第14天时，与术前基线值相比，运动组和自然恢复组均观察到蛋白聚糖和Ⅱ型胶原明显丢失(P < 0.01)，且于第21天时含量降至最低(P < 0.01)。从术后第28天(运动训练2周)开始，运动组的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原含量与自然恢复组相比显著增加(P < 0.01)，并且在运动训练8周时增加量达到了三至四倍，见图5，6。

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引言

2012年的一份全球疾病负担报告表明，下腰痛是造成中老年人残障的最常见原因，全球患病率为23%^[1-2]。而大多数的下腰痛是由椎间盘退行性病变直接或间接引起的^[3]。椎间盘退变是一个长期的过程，其确切的病理生理过程目前尚不明确，但大部分研究结果均提示与椎间盘内细胞老化，包括椎间盘细胞密度的降低及伴随的细胞外基质合成减少，特别是与蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成减少密切相关^[4-5]。

腰椎间盘退变一旦发生，很难逆转。非手术治疗是临床上治疗椎间盘退变的基本方法，文献报道80%-90%的腰椎退变患者可通过保守治疗使其症状得到临床治愈或缓解；主要采用综合治疗，包括药物治疗(主要是非类固醇抗炎药)、牵引疗法、物理因子疗法、运动疗法、注射治疗等^[6-7]。目前的这些治疗方法主要着眼于缓解疼痛，而不是解除病因，譬如最常见的椎间盘变性。完全或部分椎间盘切除手术也可作为椎间盘源性慢性腰痛患者的选择，但往往有着较高的失败率和以及患者无法接受的不良反应^[8-9]。有研究表明，适度的运动训练可使正常大鼠椎间盘中内源性干细胞增殖速度加快，并促进细胞外基质合成增加^[10-11]。课题组最近的研究也表明，椎间盘退变模型大鼠适度的运动训练一段时间后，大鼠椎间盘内细胞增殖加快、髓核和纤维环细胞数目增加，可修复已退变的椎间盘，从而减轻大鼠双侧后肢的机械性痛觉过敏^[12]，而目前有关运动训练对退变的椎间盘内细胞外基质合成的影响较少文献报道。

在2009年Lee等^[13]报道了一种通过将完全弗氏佐剂注射到大鼠L₅_-₆椎间盘建立而成的椎间盘退变模型，该模型成功模拟了由椎间盘退变引起慢性下腰痛的临床症状。文章采用上述模型，进行疼痛行为学评估及免疫组化检测，探讨为期8周的运动训练方案对椎间盘退变性腰痛的镇痛作用及对椎间盘细胞外基质合成的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2016年1至8月完成，大鼠椎间盘退变模型的制备、跑步训练、压力痛觉过敏试验及自发行为测试在中山大学北校区动物实验中心进行；石蜡切片制作、阿新蓝染色及免疫组化染色在中山大学孙逸仙纪念医院林百欣医学研究中心进行。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 实验中动物的饲养和研究处理程序均已获得中山大学孙逸仙纪念医院动物伦理委员会关于研究动物使用的批准。用于实验的雄性SD大鼠体质量为220-250 g，购于中山大学实验动物中心。5只/笼饲养在屏障动物房间里，室温维持于22-25 ℃，保持在12 h光/暗周期，可以自主获得食物和水。动物行为测试都在上午8：00-11：00之间进行。

1.3.2 主要试剂和仪器 滚轮跑步机，测力计(SMALGO algometer；Bioseb，Vitrolles，13845 France)，数码摄像机，抗Ⅱ型胶原抗体、抗蛋白多糖抗体(Abcam)，HRP/DAB免疫组化试剂盒(Abcam)。

1.4 实验方法

1.4.1 注射完全弗氏佐剂制备大鼠腰椎间盘退变模型 实验大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠进行麻醉(30 mg/kg)，在无菌条件下对大鼠进行手术操作。根据Lee等^[13]所描述的方法制备大鼠椎间盘退变模型。首先于腹部中线开一手术切口打开腹腔，以骨盆上缘作为判断L₅_-₆腰椎间盘水平的解剖标志。从左侧入路，钝性分离L₅_-₆椎间盘左侧的椎旁肌肉，暴露L₅_-₆椎间盘。暴露过程中注意避免损伤腰椎附近的大血管。然后用微量注射器刺穿L₅_-₆椎间盘约3 mm的深度并以恒定速度在10 min内缓慢注入10 μL完全弗氏佐剂(sigma， St. Louis，Missouri，USA)。再用无菌生理盐水灌洗腹腔以避免完全弗氏佐剂泄漏残存。最后用3-0丝线缝合关闭腹部肌肉，并用4-0尼龙缝合线闭合皮肤。术后密切观察大鼠，以确保没有严重的手术损伤。

1.4.2 跑步训练方案 术后2周大鼠休息以恢复创伤。从第3周开始，96只模型大鼠按随机数字表法分为运动组和自然恢复组(n=48)。运动组大鼠在2个专门设计的滚轮跑步机进行跑步(7 d/周)，跑步机的运行速度和持续时间可以通过一个控制面板进行调控^[14-16]。一个跑步机每次可允许3只大鼠同时进行跑步训练，而自然恢复组则只限于笼内自由活动。作为过渡，跑步训练第1周的持续时间为20 min/d(速度9 m/min)，第2周为30 min/d(速度11 m/min)，进而提高到第3周的40 min/d(速度13 m/min)并一直持续至第8周。观察运动组大鼠在不同运动时长[从7 d(1周)至56 d(8周)]检测指标的变化。并以自然恢复组作为相应时间点的参考对照。

1.4.3 行为学测试

压力痛觉过敏：根据Kim等^[17]所描述的方法用一个测力计(SMALGO algometer；Bioseb，Vitrolles，13845 France)测定大鼠发声的压力阈值。测力计带有一个0.5 mm直径的小装置。在测试的前1 d，给大鼠背部剃毛。测试时，先约束大鼠的行动，然后将测力计小装置末端直接压在大鼠穿刺椎间盘(L₅_-₆椎间盘)所对应的背部位置上。按压的力量以100 g/s的速度缓慢增大，直到听到大鼠发出嘶叫声时停止并记录下压力数值。最大压力值设定为1 000 g以避免大鼠受伤。以10 min为间隔进行2次实验取平均值。这一试验分别在术前 1 d和术后7，14，28，42，56，70 d进行。实验过程中保持大鼠处于安静状态。

自发行为测试：定时观察记录大鼠术前1 d和术后7，14，28，42，56，70 d的自发行为。首先将大鼠随机放置在一个透明的塑料笼子里，然后用一个固定在侧面的数码摄像机录像10 min。对录像进行分析，计算10 min内大鼠整理毛发的持续时间和“湿狗摇动”(Wet-dog shaking)的次数(“湿狗摇动”行为类似于湿狗摇动身体甩掉身上的水)^[18-19]。数据的计算记录以盲法进行。

1.4.4 蛋白多糖的阿新蓝染色 分别在以下时间点处死大鼠取材：术前1 d、术后14，21，28，42，56，70 d。首先使用过量戊巴比妥对大鼠实施安乐死，之后立即获取其L₅_-₆椎间盘(连同部分邻近椎体)并把该组织放在40 g/L多聚甲醛溶液中浸泡固定48 h，然后放置于10%EDTA溶液中脱钙3周。脱钙完成后把椎间盘以正中矢状位切开并包埋在石蜡中，再以4.5 μm厚度行连续切片以获得所需组织切片。最后对分别来自运动组和自然恢复组的组织切片进行阿新蓝染色检测蛋白多糖^[20]。分别在阿新蓝染色切片的纤维环区域和髓核区域均随机选取3个点，运用Photoshop软件对各个选取点的蛋白多糖含量进行半定量分析^[21]。

1.4.5 Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的免疫组化染色 上述不同时间点获得的石蜡切片先用二甲苯脱蜡2次，10 min/次，然后分别用体积分数100%、95%、85%、75%的乙醇脱水，每种浓度的乙醇溶液脱水5 min。然后把切片放置0.5%过氧化氢溶液浸泡10 min以消除内源性过氧化物酶的活性。将切片放入盛有0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92-98 ℃之间并持续10-15 min，室温冷却20-30 min。接下来，切片在37 ℃恒温箱用2 mol/L HCl孵育1 h，2% BSA(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min。倾去封闭液，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗稀释液，37 ℃孵育一至两小时或4 ℃过夜。抗Ⅱ型胶原抗体稀释液(1∶300，Abcam，ab185430，Cambridge，UK小鼠来源)和抗蛋白聚糖抗体稀释液(1∶300，Abcam，ab 36861，Cambridge，UK兔来源)，分别用抗小鼠和兔的HRP/DAB免疫组化试剂盒抗体(1∶300，Abcam，ab80436，Cambridge，UK)作为二抗。最后用Image-Pro Plus 5软件测量切片的染色情况。

1.5 主要观察指标 术前1 d和术后7，14，28，42，56，70 d用测力计测定引起大鼠发声的背部压力阈值，用数码摄像机录像记录大鼠的疼痛相关自发行为；术前1 d和术后14，21，28，42，56，70 d使用阿新蓝染色检测椎间盘内蛋白多糖，使用免疫组化染色检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。

1.6 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。采用独立样本t 检验比较相同时间点运动组和自然恢复组间的差异。采用单因素方差分析比较组内不同时点间的差异。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

本实验行为学结果表明，运动训练有助于改善完全弗氏佐剂模型大鼠由椎间盘退变诱发的背部压力痛觉过敏和自发行为异常；生化结果表明，运动训练可促进椎间盘细胞外基质的合成，修复已退变组织结构。综上所述，本研究结果表明，运动训练在缓解椎间盘退变导致的疼痛、增加细胞外基质合成及椎间盘修复方面发挥了重要的作用。

腰椎间盘退变早期最常见的症状是腰部钝痛，当退变逐渐加重至椎间盘膨出或突出压迫神经根时，患者会出现单侧或双侧下肢放射性的疼痛、麻木、感觉异常。完全弗氏佐剂椎间盘内注射、椎间盘针刺等模型均可较好地模拟椎间盘退变过程和症状；双侧后肢机械性痛觉测定、背部压力阈值测定和自发行为观察(包括整理毛发和“湿狗摇动”)等均是动物实验中检测腰椎退变模型大鼠行为异常的常用指标^[17-19]。在临床上，腰部钝痛往往是腰椎间盘退行性病变的早期表现；因此，本实验通过检测大鼠背部压力阈值和自发行为来研究运动训练对椎间盘退变的影响。实验发现，术后第7天与术前基线值比较，在穿刺椎间盘所对应的背部位置进行按压引起大鼠发声的压力阈值明显降低，而整理毛发和“湿狗摇动”等自发行为指标增多，表明完全弗氏佐剂椎间盘内注射引起退变、诱发局部痛觉过敏和行为异常。运动组大鼠在运动训练14 d后，背部压力阈值增加、“湿狗摇动”行为减少，且与自然恢复组比较存在显著性差异，而整理毛发行为则在运动训练28 d后出现明显减少，与自然恢复组比较存在显著性差异。结合作者之前的研究认为，运动训练可以减轻模型大鼠由椎间盘退变引起的多种疼痛行为异常^[12]。

在临床上，目前大多数学者认为，运动训练可缓解慢性下腰痛患者的疼痛、预防复发。Panjabi等^[22]提出的脊柱稳定性“三亚系模型”，是由椎骨、椎间盘、韧带组成的被动系统，椎间盘周围所有的肌肉和肌腱组成的主动系统，及神经系统构成监测各种传感器信号的神经控制系统。腰椎稳定性的维系依赖于被动系统、主动系统和神经控制系统的协同活动。通常情况下，3个亚系分别构成维持脊柱稳

定性的三个独立性因素，某一因素的“欠缺”，可以由其他要素加以代偿。而当各个亚系之间的功能无法代偿时，往往会造成脊柱稳定性破坏，形成下腰痛。在椎间盘退变的情况下，主动亚系中的核心肌群对于维持腰部稳定性、缓解下腰痛有着重要作用。Kamaz等^[23]利用CT检查发现慢性下腰痛患者L₄横断面的椎旁肌、多裂肌、腰方肌、腰大肌，臀大肌均有不同程度的萎缩，其中以多裂肌的萎缩最为明显。本课题组的最新研究中也有类似结果，采用MRI观察慢性腰痛患者的椎旁肌，发现存在多节段多裂肌萎缩，尤以疼痛节段最明显^[24]。目前，有关运动训练对被动系统中椎间盘内部结构影响的基础实验仍较少。

椎间盘为纤维软骨样组织，细胞数量少，含有丰富的细胞外基质；细胞外基质构成细胞分布的支架，主要包括水、蛋白多糖、胶原和非胶原蛋白。椎间盘的机械功能是由细胞外基质实现的，其中提供主要机械作用的是胶原纤维和蛋白多糖这两个主要的生物大分子。蛋白多糖的吸水性使椎间盘内保持高静水压，维持椎间盘的高度；蛋白多糖浓度决定椎间盘的渗透性，影响营养成分、化学介质和细胞代谢物的通过；胶原主要对抗椎间盘承受的张力负荷^[25-26]。椎间盘退变是一个复杂的过程，与椎间盘内细胞密度降低、细胞外基质合成减少密切相关^[27]，退变的椎间盘无法向四周均衡传递椎体之间的压力，导致脊柱稳定性破坏，引起下腰痛。据相关文献报道，Henriksson等^[28-29]应用Brdu标记兔、鼠、猪和人的椎间盘组织研究发现，纤维环和髓核存在缓慢的细胞增殖；同时，在纤维环外侧区和软骨终板的骺软骨区存在干细胞微环境，Brdu阳性细胞聚集；为期3周的运动训练方案对于健康大鼠的腰椎间盘内源性干细胞增殖、细胞外基质合成有促进作用^[10]。进一步的离体椎间盘实验发现，低频率的动态负荷有助于促进早期退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成^[30]。然而，在分子水平上，适度运动训练在退变椎间盘修复中的作用机制仍甚少被研究。

在本实验中，采用阿新蓝染色法半定量检测髓核中蛋白多糖含量；采用免疫组化方法检测椎间盘中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，并用Image-Pro Plus 5对免疫组化图像进行分析，探讨运动训练对退变椎间盘内细胞外基质合成的影响。实验发现，建模后髓核和纤维环中蛋白多糖、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原含量与建模前比较显著下降，表明完全弗氏佐剂注射节段椎间盘发生退变；运动组大鼠在运动训练14 d后，髓核中蛋白多糖、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原含量明显增多，同时，纤维环中蛋白多糖含量也明显增多，且与相应时间点的自然恢复组比较差异均有显著性意义；经过8周的运动训练，运动组大鼠髓核和纤维环的蛋白多糖含量与自然恢复组比较增加四至五倍，髓核中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的增加量达到了三至四倍；上述结果表明，运动训练促进退变椎间盘内蛋白多糖、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原等细胞外基质的合成。目前干细胞移植治疗椎间盘退变是研究的热点，其主要原理是移植的干细胞分化成相应的椎间盘细胞，合成细胞外基质，从而修复受损的椎间盘组织结构和功能^[31]。而本课题组新近的研究表明，运动训练可促进完全弗氏佐剂模型大鼠椎间盘内源性干细胞的增殖，增加纤维环和髓核中的细胞数量，这是运动训练促进退变椎间盘修复的重要机制^[12]。由此，结合本实验结果可以认为，运动训练激发了椎间盘内源性干细胞的增殖和分化，使相应的纤维环和髓核细胞数目增加，同时促进细胞外基质合成增加^[12]；细胞外基质合成增加可恢复已退变椎间盘的抗机械负荷能力，是缓解盘源性腰痛的另一重要机制。

本实验采用大鼠来观察运动训练对退变椎间盘的影响，大鼠的运动方式为爬行，与人类直立行走时的椎间盘负重不同，故有关运动训练对腰椎退行性变患者椎间盘细胞、细胞外基质的影响还有待进一步研究。临床中，腰椎退行性变患者应以卧位核心肌群训练为主，特别推荐游泳运动。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

运动训练对椎间盘退变模型大鼠疼痛及细胞外基质合成的影响

Exercise effects on pain relief and extracellular matrix production in a rat model of intervertebral disc degeneration

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