CD54+和CD54-脂肪干细胞的成脂分化能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.003

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2638-2643.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.003

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

CD54⁺和CD54^-脂肪干细胞的成脂分化能力

李德全¹，梁至洁²，韦金儒³，黄海²，黄敏红²，池刚毅⁴，黎洪棉⁴

¹南昌市第三医院乳腺肿瘤一科，江西省南昌市 330009；广西医科大学第五附属医院，²肝胆腺体外科，³心血管内科，⁴整形美容外科，广西壮族自治区南宁市 530022

修回日期:2017-02-06 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 黎洪棉，博士，主任医师，教授，广西医科大学第五附属医院整形美容外科，广西壮族自治区南宁市 530022
作者简介:李德全，男，1968年生，江西省南昌市人，汉族，2008年中南大学毕业，博士，副主任医师，副教授，主要从事乳腺疾病的基础与临床研究。并列第一作者：梁至洁，女，1988年生，广西壮族自治区宾阳县人，壮族，2014年天津医科大学毕业，硕士，医师，主要从事再生医学、干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81560316，81560358)；广西科学研究与技术开发计划资助项目(桂科攻1598012-1)；广西自然科学基金重点项目(2016GXNSFDA380016)；南宁市科学研究与技术开发计划资助项目(20153089，zc20153002)

Adipogenic capacity of CD54⁺/CD54^- adipose-derived stem cells

Li De-quan¹, Liang Zhi-jie², Wei Jin-ru³, Huang Hai², Huang Min-hong², Chi Gang-yi⁴, Li Hong-mian⁴

¹Department of Breast Surgery, Third Hospital of Nanchang, Nanchang 330009, Jiangxi Province, China; ²Department of Hepatobiliary and Gland Surgery, ³Department of Vasculocardiology, ⁴Department of Plastic and Aesthetic Surgery, the Fifth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2017-02-06 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Li Hong-mian, M.D., Chief physician, Professor, Department of Plastic and Aesthetic Surgery, the Fifth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Li De-quan, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Department of Breast Surgery, Third Hospital of Nanchang, Nanchang 330009, Jiangxi Province, China Liang Zhi-jie, Master, Physician, Department of Hepatobiliary and Gland Surgery, the Fifth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Li De-quan and Liang Zhi-jie contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560316, 81560358; the Scientific Research and Development Plan of Guangxi Zhuang Autonomous Region in China, No. 1598012-1; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2016GXNSFDA380016; the Science Research and Technology Development Plan of Nanning City, No. 20153089, zc20153002

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂肪干细胞的分化：脂肪干细胞可在脂肪组织微环境中分化为体积较大的成熟脂肪细胞，其分化过程可受多因素影响，如微环境、药物、生长因子或关键信号通路的激活等。如何筛选这些因素并应用于成脂分化诱导的优化对生物修复工程研究具有重要意义。
成脂分化：脂肪干细胞具有多向分化潜能，如成骨、成软骨、成脂等，经过特殊的分化诱导培养基培养后可以达到定向诱导分化的目的，是生物修复工程的重要种子细胞之一。脂肪干细胞的成脂分化能力是决定其应用于软组织缺损修复的重要属性之一，通过定向诱导后脂肪干细胞能够向成熟的脂肪细胞分化，其表面抗原及其旁分泌功能发生变化，如何优化干细胞的成脂分化功能是目前生物修复工程学的重要研究方向之一。

摘要
背景：研究表明，脂肪干细胞具有多向分化潜能，但是其向成熟脂肪细胞分化的效率仍较低，只有30%-40%。因此，如何提高脂肪干细胞的成脂分化能力是软组织再生研究过程中需要解决的关键科学问题。
目的：观察兔脂肪干细胞表面标志物CD54的表达与其成脂分化能力的关系，并探讨同一诱导剂对CD54⁺和CD54^-兔脂肪干细胞成脂分化的影响。
方法：取新西兰大白兔(8-12周龄)腹股沟皮下脂肪垫3 mL，采用贴壁法体外分离培养兔脂肪干细胞并行多向分化诱导及细胞表型标志物鉴定。取第3代细胞经免疫磁珠分选得到CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞，经成脂诱导14 d后行油红O染色，检测成熟脂肪细胞的密度及细胞内脂滴含量。RT-PCR检测脂肪干细胞成脂分化相关基因表达水平。
结果与结论：①兔脂肪干细胞具有间充质干细胞特性，可向成熟脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞表型分化，细胞表面标志物CD29、CD44、CD49d、CD54、CD73、CD90和CD105表达均为阳性，而CD31、CD34和CD45表达阴性；②成脂诱导第14天，CD54⁺兔脂肪干细胞分化为成熟脂肪细胞的密度和细胞内脂滴含量均高于CD54^-兔脂肪干细胞，差异均有显著性意义(P < 0.05)；③成脂诱导14 d后，CD54⁺兔脂肪干细胞成脂相关基因ADD1、C/EBPα、PPARγ的mRNA表达水平明显高于CD54^-兔脂肪干细胞，差异均有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，CD54⁺脂肪干细胞具有高成脂分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-7043-6457(黎洪棉)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 细胞表面标志, 成脂分化, 细胞诱导, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that adipose-derived stem cells have pluripotent differentiation potential, but only 30%-40% of cells can differentiate into mature adipocytes with low adipogenic differentiation potential. Therefore, how to improve the adipogenic differentiation ability of adipose-derived stem cells is a key problem to be solved in the process of soft tissue regeneration.

OBJECTIVE: To observe the relationship between the surface marker CD54 of rabbit adipose-derived stem cells and their adipogenic capacity, and to explore the adipogenic differentiation of CD54⁺/CD54^- adipose-derived stem cells under the same induction.

METHODS: We successfully isolated and cultured the adipose-derived stem cells from inguinal subcutaneous fat pads (3 ml) of New Zealand white rabbits, aged 8-12 weeks, which were induced into multi-differentiation and used to detect surface markers. We sorted the passage 3 adipose-derived stem cells by immunomagnetic beads and divided into two categories including CD54⁺ and CD54^- adipose-derived stem cells. After 14 days of adipogenic induction, the cells in the two groups were subjected to oil red O staining and were compared by detecting the density of mature adipocytes and lipid droplet contenT.

RESULTS AND CONCLUSION: The cultured adipose-derived stem cells possessed the characteristics of mesenchymal stem cells that could differentiate into mature adipocytes, osteoblasts and chondrocytes, with CD29, CD44, CD49d, CD54, CD73, CD90 and CD105 positive expression while CD31, CD34 and CD45 negative expression. Fourteen days after adipogenic induction, the density of mature adipocytes and the intracellular lipid droplet content in the CD54⁺ group were significantly higher than those in the CD54^- group (P < 0.05). We also found that the mRNA expressions of PPARγ, ADD1, C/EBPα related to adipogenic differentiation in the CD54⁺ group were significantly higher than those in the CD54^- group (P < 0.05). Taken together, CD54⁺ adipose-derived stem cells have excellent adipogenic differentiation capacity.

Key words: Stem Cells, Adipose Tissue, Adipogenesis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李德全，梁至洁，韦金儒，黄海，黄敏红，池刚毅，黎洪棉. CD54⁺和CD54^-脂肪干细胞的成脂分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2638-2643.

Li De-quan, Liang Zhi-jie, Wei Jin-ru, Huang Hai, Huang Min-hong, Chi Gang-yi, Li Hong-mian. Adipogenic capacity of CD54⁺/CD54^- adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2638-2643.

图/表（结果） 3

2.1 兔脂肪干细胞的生长特性及多向分化结果 细胞24-48 h贴壁，刚开始为淋巴细胞样小圆细胞，24-48 h后贴壁细胞明显增多，并开始分裂增殖，圆形细胞变形伸出伪足，约7 d可长满培养瓶底面积的70%-80%，此时细胞逐渐融合成单层，细胞形态为梭形、多角形，呈集落状生长。细胞常围绕集落中央呈岛状分布，并分泌大量基质。传代后的细胞形态与原代相似，以梭形为主，但生长增殖较快。随着传代次数的增多，细胞变为形态均一、排列更有序的成纤维细胞样，传代后细胞形态主要为梭形，其生长速度较原代细胞明显增快；连续传代培养至10代，细胞未出现明显衰老现象(图1A)；成骨诱导3周，可见钙化结节样改变，茜素红染色结节呈红色(图1B)；成软骨诱导2周后，可见高度聚集生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状，阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色(图1C)；成脂诱导2周，可见细胞内有透亮的脂滴形成，油红O染色可见脂滴被染成红色(图1D)。

2.2 流式细胞仪检测细胞表型结果 第3代兔脂肪干细胞表面标记CD29，CD44，CD49d，CD54，CD73，CD90和CD105表达均为阳性，而CD34和CD45表达为阴性，见表2。

2.3 XTT法检测兔脂肪干细胞增殖情况 细胞生长、增殖状态良好，CD54⁺兔脂肪干细胞与CD54^-兔脂肪干细胞比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.4 油红O染色及定量检测兔脂肪干细胞成脂分化情况 见表4，图2。细胞成脂诱导14 d后，两组脂肪干细胞分化细胞数及细胞内脂滴含量比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。
2.5 qRT-PCR检测两种兔脂肪干细胞成脂分化相关基因表达 兔脂肪干细胞成脂诱导14 d后，CD54⁺兔脂肪干细胞成脂相关基因PPARγ、ADD1、C/EBPα的表达水平明显高于CD54^-兔脂肪干细胞，差异均有显著性意义(ADD1：3.24± 0.48 vs. 1.38±0.29；C/EBPα：2.76±0.037 vs. 1.25± 0.26；PPARγ：3.13±0.45 vs. 1.21±0.23，P均< 0.05)，见图3。

参考文献

[1] Kasir R, Vernekar VN, Laurencin CT. Regenerative Engineering of Cartilage Using Adipose-Derived Stem Cells. Regen Eng Transl Med. 2015;1(1):42-49.

[2] Wankhade UD, Shen M, Kolhe R, et al. Advances in Adipose-Derived Stem Cells Isolation, Characterization, and Application in Regenerative Tissue Engineering. Stem Cells Int. 2016;2016:3206807.

[3] Naderi N, Wilde C, Haque T, et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells in 3-dimensional spheroid cultures (microtissue): implications for the reconstructive surgeon. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2014;67(12):1726-1734.

[4] Li H, Han Z, Liu D, et al. Autologous platelet-rich plasma promotes neurogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitro. Int J Neurosci. 2013;123(3):184-190.

[5] Marx C, Silveira MD, Beyer Nardi N. Adipose-derived stem cells in veterinary medicine: characterization and therapeutic applications. Stem Cells Dev. 2015;24(7):803-813.

[6] Banyard DA, Salibian AA, Widgerow AD, et al. Implications for human adipose-derived stem cells in plastic surgery. J Cell Mol Med. 2015;19(1):21-30.

[7] Mantovani C, Terenghi G, Magnaghi V. Senescence in adipose-derived stem cells and its implications in nerve regeneration. Neural Regen Res. 2014;9(1):10-15.

[8] Xu FT, Li HM, Yin QS, et al. Effect of activated autologous platelet-rich plasma on proliferation and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitro. Am J Transl Res. 2015;7(2):257-270.

[9] Xu FT, Li HM, Zhao CY, et al. Characterization of Chondrogenic Gene Expression and Cartilage Phenotype Differentiation in Human Breast Adipose-Derived Stem Cells Promoted by Ginsenoside Rg1 In Vitro. Cell Physiol Biochem. 2015;37(5):1890-1902.

[10] Konno M, Hamazaki TS, Fukuda S, et al. Efficiently differentiating vascular endothelial cells from adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in serum-free culture. Biochem Biophys Res Commun. 2010;400(4):461-465.

[11] Sahar DE, Walker JA, Wang HT, et al. Effect of endothelial differentiated adipose-derived stem cells on vascularity and osteogenesis in poly(D,L-lactide) scaffolds in vivo.J Craniofac Surg. 2012;23(3):913-918.

[12] Deveza L, Choi J, Imanbayev G, et al. Paracrine release from nonviral engineered adipose-derived stem cells promotes endothelial cell survival and migration in vitro. Stem Cells Dev. 2013;22(3):483-491.

[13] Berardi GR, Rebelatto CK, Tavares HF, et al. Transplantation of SNAP-treated adipose tissue-derived stem cells improves cardiac function and induces neovascularization after myocardium infarct in rats. Exp Mol Pathol. 2011;90(2): 149-156.

[14] Park IS, Chung PS, Ahn JC. Adipose-derived stromal cell cluster with light therapy enhance angiogenesis and skin wound healing in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2015;462(3):171-177.

[15] Brown CF, Yan J, Han TT, et al. Effect of decellularized adipose tissue particle size and cell density on adipose-derived stem cell proliferation and adipogenic differentiation in composite methacrylated chondroitin sulphate hydrogels. Biomed Mater. 2015;10(4):045010.

[16] Murdolo G, Piroddi M, Tortoioli C, et al. Free Radical-derived Oxysterols: Novel Adipokines Modulating Adipogenic Differentiation of Adipose Precursor Cells. J Clin Endocrinol Metab. 2016;101(12):4974-4983.

[17] Chen CC, Hsu LW, Nakano T, et al. DHL-HisZn, a novel antioxidant, enhances adipogenic differentiation and antioxidative response in adipose-derived stem cells. Biomed Pharmacother. 2016;84:1601-1609.

[18] Morandi EM, Verstappen R, Zwierzina ME, et al. ITGAV and ITGA5 diversely regulate proliferation and adipogenic differentiation of human adipose derived stem cells. Sci Rep. 2016 ;6:28889.

[19] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12): 4279-4295.

[20] Gronthos S, Franklin DM, Leddy HA, et al. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol. 2001;189(1):54-63.

[21] Festy F, Hoareau L, Bes-Houtmann S, et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochem Cell Biol. 2005; 124(2):113-121.

[22] Feng X, Liu X, Cai X, et al. The Influence of Tetracycline Inducible Targeting Rat PPARγ Gene Silencing on the Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells. Curr Pharm Des. 2016;22(41):6330-6338.

引言

材料方法

1.1 设计 以细胞为观察对象的体外平行对照实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6至9月在南宁维尔凯生物科技有限公司中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 新西兰大白兔10只，8-12周龄，体质量1.5-2.0 kg，雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.3.2 主要试剂和仪器 DMEM、特级胎牛血清(美国GIBCO公司)；胶原酶、胰蛋白酶、胰岛素、四氮唑复合物(XTT)、转化生长因子β1、转铁蛋白、维生素C磷酸酯和二甲基亚砜及相关抗体(美国Sigma 公司)；免疫磁珠分选试剂盒、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、油红O、茜素红、阿利辛蓝(上海乔羽生物科技有限公司)；96孔细胞培养板(美国Corning公司)；倒置相差显微镜(Olympus，Japan)；荧光显微镜(Nikon，Japan)；CO₂细胞培养箱(Heraeus)；超净工作台(Nuair)；高速离心机(Heraeus)；酶标仪(日本Rader公司)；全自动免疫磁珠细胞分选仪(德国Miltenyi)；流式细胞仪(Bekman-Coulter，USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔脂肪干细胞的分离培养、传代与扩增 将动物麻醉后于无菌条件下切取腹股沟皮下3 mL的脂肪组织，剔除血管，PBS反复冲洗后剪成1 mm³大小的脂肪颗粒，用0.1%的Ⅰ型胶原酶恒温消化40-50 min，等量的完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM)中和后离心(1 300 r/min，5 min)，去杂质及上清，沉淀混悬后用150目尼龙网过滤，用完全培养基将细胞混悬，按(1.0-2.0)×10⁴细胞密度接种于25 cm²培养瓶中，置于体积分数为5%CO₂、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱进行单层细胞培养。24 h后更换培养液1次，以后每三四天换液1次并动态观察细胞的生长特性，一般6-8 d细胞生长融合达80%-90%，加入0.25%胰酶消化，按1∶3进行传代培养，倒置相差显微镜下观察原代及传代兔脂肪干细胞形态及生长状况。其后一般3 d传代1次，到第3代时杂细胞较少，选取生长良好的第3代细胞供以下实验使用。

1.4.2 流式细胞分析仪鉴定兔脂肪干细胞表型 用流式细胞仪对第3代兔脂肪干细胞表面特异性抗原进行检测。选取的抗体有CD29，CD31，CD34，CD44，CD45，CD49d，CD54，CD73，CD90，CD105。将待测细胞用PBS洗涤3次后，加入0.25%胰蛋白酶消化，消化下来的细胞收集于离心管中，1 300 r/min离心5 min。将离心后的细胞用PBS重悬，离心洗涤2次后分为2管，每管细胞悬液100 μL (1×10⁶细胞)，其中一管细胞悬液中加入一抗，室温下避光孵育0.5 h，另一管不加一抗，作为阴性对照。离心洗掉多余抗体，重悬于300 μL PBS，上机检测。

1.4.3 免疫磁珠分选CD54⁺和CD54^-兔脂肪干细胞 将培养扩增的第3代足量细胞行免疫磁珠分选实验。具体步骤如下：①离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTA、pH7.2 PBS，真空抽滤除菌及液体内气体)充分混悬细胞(0.5 mL/1×10⁸细胞)，加入一抗(终质量浓度为10-20 mg/L)，4 ℃孵育30 min；②用20倍体积PBE洗细胞1次，再加PBE(0.3 mL/1×10⁸细胞)充分混悬细胞，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15 ℃孵育10-15 min；③将分离柱安装入磁场中，加入0.5 mL PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；④将孵育完毕的细胞悬液加到分离柱中，自然流尽；⑤将0.5 mL的PBE加入分离柱中，自然流尽，洗柱1次；⑥从磁场中取下分离柱，插在试管口上，加入1.0-2.0 mL的PBE，用针芯推尽液体，冲出阳性结合的细胞，以培养基清洗1次待用。

1.4.4 XTT比色法测定兔脂肪干细胞增殖状况 将CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞分别接种于2块96孔培养板中，每孔2×10⁴个细胞，加上述完全培养基200 μL，每组9个复孔(n=10)。置37 ℃、体积分数为5%的CO₂孵箱培养9 d，吸弃上清液，每孔加入50 μL XTT-PMS 工作液，继续培养4 h，振荡5 min，以主波长490 nm，参比波长630 nm在酶标仪上比色，测定吸光度值。

1.4.5 兔脂肪干细胞的多向分化能力鉴定 取第3代兔脂肪干细胞接种培养，生长至瓶底70%-80%面积时，改用向成骨细胞分化的诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸和10 mmol/L β-磷酸甘油)定向诱导，3周后行茜素红染色定性观察诱导结果。取第3代兔脂肪干细胞接种培养，生长至瓶底100%面积时，改用向软骨细胞分化的诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清，10 μg/L转化生长因子β1，6.25 mg/L胰岛素，6.25 mg/L转铁蛋白以及50 μmol/L维生素C磷酸酯)定向诱导，2周后行阿利辛蓝染色定性观察诱导结果。取第3代兔脂肪干细胞进行接种培养，待细胞生长至瓶底70%-80%面积时，更换向脂肪细胞分化的诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰岛素，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤)定向诱导，2周后行油红O染色定性观察诱导结果。

1.4.6 CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞成脂分化油红O染色及定量检测 分别取第3代CD54⁺兔脂肪干细胞(n=12)和CD54^-兔脂肪干细胞(n=12)进行接种培养，待细胞生长至瓶底70%-80%面积时，两组均更换向脂肪细胞分化的诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰岛素，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤)定向诱导14 d，隔日换液，在第14天时行油红O染色定性观察诱导结果，并测定成熟脂肪细胞密度和细胞内脂滴含量。

倒置相差显微镜下，计算成熟脂肪细胞数占同一视野细胞总数的比例即为成熟脂肪细胞的密度，随机选取6个非重叠视野取平均值。

诱导后的细胞用PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛室温固定1 h，油红O染色1 h，60%异丙醇稍洗去多余染液，蒸馏水洗，光镜观察。加入等量的异丙醇将结合上的油红O溶解，经稀释后，550 nm波长处测定吸光度，计算细胞内油脂的含量。

1.4.7 成脂分化相关基因检测 取诱导2周后的CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞，采用Trizol提取细胞总RNA，用TaKaRa的反转录试剂盒(DRR036A)进行RNA反转录，用mRNAs反转录试剂盒(D350A)进行mRNAs反转录，具体步骤见试剂盒说明书。qRT-PCR法检测C/EBPɑ、ADD1、PPARγ的表达。qRT-PCR反应体系及反应条件参照TaKaRa的RNA荧光定量试剂盒(RR426A)说明书进行。对RNA的检测以GAPDH为内参。定量数据通过2^-^??Ct法进行计算。各基因的引物序列和引物长度详见表1。

1.5 主要观察指标 ①兔脂肪干细胞的生长特性及多向分化能力；②兔脂肪干细胞的表面标志物表达；③CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞的生长增殖能力；④CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞的成脂分化能力；⑤CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞的成脂分化相关基因表达。

1.6 统计学分析 所得数据采用SPSS 17.0软件包进行统计分析，以x(_)±s表示，数据统计分析采用两样本均数的t检验方法。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

国际脂肪应用技术协会将从脂肪组织中分离出的能贴壁生长增殖及具有多向分化能力的细胞群体命名为脂肪干细胞。脂肪干细胞体外培养扩增后表现为成纤维细胞样形状且其生物学特性与骨髓间充质干细胞类似，比如能贴壁生长且在体外能诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等。脂肪干细胞在脂肪组织中含量十分丰富，人类脂肪组织中高达1%的细胞成分为脂肪干细胞，而骨髓中只有0.001%-0.002%比例的细胞为骨髓间充质干细胞。因此，只需要通过一个微创的皮下脂肪抽吸手术即可获得大量的脂肪干细胞。作者成功从新西兰大白兔皮下脂肪组织中分离培养出脂肪干细胞，并证实其具有向成熟脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞表型分化的能力，与之前研究结果一致^[8-9]，这为后续深入研究脂肪干细胞的生物学功能提供了实验依据。

目前脂肪干细胞是生物修复工程研究的重要种子细胞之一，特别是其成脂分化、成血管内皮分化及旁分泌功能被认为是优化自体脂肪组织移植的关键^[10-14]。其中成脂分化功能是补充损伤坏死脂肪细胞、维持移植物体积、保证移植后长期疗效的关键。脂肪干细胞可在脂肪组织微环境中分化为体积较大的成熟脂肪细胞，其分化过程可受多因素影响，如微环境、药物、生长因子或关键信号通路的激活等。Brown等^[15]发现局部脂肪干细胞的密度可明显影响其成脂分化程度，Murdolo等^[16]发现氧自由基可以通过影响脂肪干细胞的代谢促进其成脂分化。Chen等^[17]使用DHL-HisZn刺激脂肪干细胞发现其成脂分化能力显著提高；Morandi等^[18]则发现ITGAV及ITGA5分别是调控脂肪干细胞增殖及成脂分化的关键因子。综上所述，影响脂肪干细胞成脂分化功能的因素众多，如何筛选这些因素并应用于成脂分化诱导的优化对生物修复工程研究具有重要意义。

研究表明，脂肪干细胞具有多向分化潜能，然而目前其向成熟脂肪细胞分化的效率仍较低，只有30%-40%。因此，如何提高脂肪干细胞的成脂分化能力是软组织再生研究过程中需要解决的关键科学问题，通过筛选不同表面标志物的干细胞进行诱导分化是其中的一种研究手段。

测定细胞表面特异性CD标志和特异性蛋白是常用的鉴定骨髓间充质干细胞的方法。Zuk等^[19]发现脂肪组织提取细胞与骨髓间充质干细胞都表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH2、CD105/SH3、STRO-1，且都不表达CD31、CD34、CD45这些造血细胞系的标记物。脂肪组织提取细胞表达CD49d，而骨髓间充质干细胞不表达，同时骨髓间充质干细胞表达CD106而在脂肪组织提取细胞中无表达。Gronthos等^[20]实验显示脂肪干细胞的表面标记物有CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD59、CD105、CD106、CD146和CD166，骨髓间充质干细胞同样也表达这些表面标记物。Festy等^[21]发现脂肪干细胞和成熟脂肪细胞也有共同的表面标记物CD10、CD13、CD34、CD36、CD55、CD59和CD65，且来自皮下和网膜脂肪组织上的表面标记物没有差异。从以上的一些研究结果可以看出，脂肪干细胞表面的标记物繁多，其中很多与骨髓间充质干细胞、造血干细胞和脂肪细胞相同，且对其特异性各家报道不一。实验采用流式细胞技术测定分离出来的脂肪干细胞表面标志物CD29、CD44、CD49d、CD54、CD73、CD90和CD105表达均呈阳性，说明其具有干细胞特性。干细胞成脂分化是一个由分化转录因子调控的复杂过程，其中过氧化物酶体增殖激活受体(PPARγ)是脂肪细胞最特异性的转录因子，与脂肪细胞定向分化因子(ADD1)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)皆为干细胞成脂分化的重要标志基因，在干细胞的成脂分化过程中表达往往升高^[22]。实验发现，CD54⁺兔脂肪干细胞在成脂诱导14 d后上述3种成脂相关基因的mRNA表达水平显著高于CD54^-兔脂肪干细胞，说明表面标志物CD54呈阳性表达的兔脂肪干细胞成脂分化能力更强、效率更高，较CD54^-兔脂肪干细胞更适合作为脂肪再生工程的种子细胞。

实验采用XTT比色法测定兔脂肪干细胞增殖情况，用酶标仪测吸光度可反映活细胞的数量。实验对CD54⁺兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞吸光度进行动态检测，发现两组在各时间点的数值差异无显著意义，说明免疫磁珠对分选后细胞的生长增殖能力无影响，且两种细胞的生长增殖无明显差别。油红O染色是利用染料易溶于脂质的性质证明组织脂质含量多少的鉴定方法。成脂诱导后细胞分化率和细胞内脂肪滴含量则是评价脂肪干细胞向成熟脂肪细胞分化的2个重要指标。实验结果显示，细胞成脂诱导14 d后，CD54⁺兔脂肪干细胞成脂分化率及细胞内脂滴含量明显高于CD54^-兔脂肪干细胞，说明CD54可能是筛选高成脂性脂肪干细胞的一项可靠指标，为今后体内构建大体积的脂肪组织以及肥胖症的治疗提供了理论依据，而CD54⁺兔脂肪干细胞体内组织构建实验将是下一步研究的方向。

CD54⁺和CD54^-脂肪干细胞的成脂分化能力

Adipogenic capacity of CD54⁺/CD54^- adipose-derived stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[5]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[6]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[7]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[8]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[9]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[10]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[11]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[12]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[13]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[14]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[15]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.

CD54+和CD54-脂肪干细胞的成脂分化能力

Adipogenic capacity of CD54+/CD54- adipose-derived stem cells

PDF

可视化

引用本文

使用本文

CD54⁺和CD54^-脂肪干细胞的成脂分化能力

Adipogenic capacity of CD54⁺/CD54^- adipose-derived stem cells