干细胞拉曼光谱收集条件选择及间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2644-2651.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.004

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干细胞拉曼光谱收集条件选择及间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的比较

陈明，程雪莲，段永娟，胡晓

中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020

修回日期:2017-05-05 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 胡晓，博士，研究员，中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020
作者简介:陈明，男，1992年生，内蒙古乌兰察布市人，蒙古族，硕士，主要从事干细胞生物学研究。
基金资助:
国家863高技术研究发展计划(2011AA020118)；国家973重点基础项目(2012CB966504)

Optimization of Raman spectra acquisition conditions and its application in a comparison study on mesenchymal stem cells and embryonic stem cells

Chen Ming, Cheng Xue-lian, Duan Yong-juan, Hu Xiao

State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology & Hospital of Blood Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China

Revised:2017-05-05 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Hu Xiao, M.D., Researcher, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology & Hospital of Blood Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
About author:Chen Ming, Master, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology & Hospital of Blood Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
Supported by:
the National High-Technology Research and Development Program of China (863 Program), No. 2011AA020118; the National Basic Research Program of China (973 Program), No. 2012CB966504

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
拉曼光谱：一种快速、非介入、非标记的光学检测方法。利用激光照射获得生物样品的拉曼峰图，通过对拉曼光谱峰数据分析，可获得细胞以及细胞器内蛋白质、核酸或者脂类等含量和结构信息。比较细胞的拉曼光谱可以区别不同的细胞类型及提供不同细胞的化学组成与功能上的差异信息。
光栅：是一种由大量等宽等间距的平行狭缝构成的光学仪器，光栅的制作方法一般是在玻璃上刻出大量的平行刻痕，刻痕部分不透光。光栅刻度密度即每毫米的刻痕数量，单位为gr/mm。当单色光经过光栅时会发生光的衍射并产生干涉现象，通过分析衍射花纹可以推测出拉曼散射光的光强。

摘要
背景：拉曼光谱在检测细胞状态方面相比于传统技术具有快速、非介入、非标记等特点，因此在生物医学领域中的应用正日益受到关注，但是该技术应用于干细胞检测的条件还有待进一步优化。
目的：探索激光波长与光栅刻度密度对于干细胞拉曼光谱分辨率与收集时间等参数的影响，明确可以用于干细胞分析的拉曼光谱收集条件。
方法：首先比较532，638，785 nm 3个波长激光及600，1 200，1 800 gr/mm 3种光栅刻度密度条件对人间充质干细胞与人胚胎干细胞拉曼光谱的影响；之后比较这2个条件不同组合得到的拉曼光谱的光谱分辨率与收集时间，选择出最佳的组合条件；最后使用选出的最佳条件结合主成分分析方法比较胚胎干细胞与间充质干细胞拉曼光谱的差异以验证优化条件的适用性。
结果与结论：①激光波长与光栅刻度密度均会不同程度影响干细胞拉曼光谱的峰强，进而影响特征性拉曼峰之间的比值；②785 nm波长激光与1 200 gr/mm光栅刻度密度条件组合是最适合收集条件；③对比分析胚胎干细胞与间充质干细胞的拉曼光谱图，提示胚胎干细胞具有更高的核酸含量，而间充质干细胞在一些蛋白和脂类含量上更为丰富。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-0855-8626(陈明)

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 拉曼光谱, 激光, 光栅, 间充质干细胞, 胚胎干细胞, 峰位, 主成分分析

Abstract:

BACKGROUND: Raman spectrum, compared with conventional detection technologies, is a rapid, non-invasive and label-free optical method. Its application has become an issue of concern in biomedical research. However, further studies are warranted to optimize the acquisition condition of Raman spectra from different stem cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of the wavelength of laser and the groove frequency of gratings to obtain the optimized parameter combination for Raman spectrum collection in human stem cells.
METHODS: Using human mesenchymal stem cells as samples, the effects of different laser wavelengths (532, 638, 785 nm) and different grating groove frequency (600, 1 200, 1 800 gr/mm) on Raman spectra were compared respectively. Then the different combinations of the wavelength and groove frequency were used and compared in terms of the spectra resolution and acquisition time, and the best acquisition condition was selected and applied in a comparison study on the Raman spectra from human mesenchymal stem cells and human embryonic stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The wavelengths of lasers and groove frequencies of gratings showed compound impacts on both the spikes at different wavenumbers and the ratio between spikes; the combination of 785 nm and 1 200 gr/mm was confirmed to be the best spectrum features for human mesenchymal stem cells. The comparison of Raman spectra from human mesenchymal stem cells and human embryonic stem cells implies that the embryonic stem cells contain higher nucleic acids than the mesenchymal stem cells, while the mesenchymal stem cells appear to contain more proteins and lipids.

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Embryonic Stem Cells, Spectrum Analysis, Raman, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈明，程雪莲，段永娟，胡晓. 干细胞拉曼光谱收集条件选择及间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的比较[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2644-2651.

Chen Ming, Cheng Xue-lian, Duan Yong-juan, Hu Xiao. Optimization of Raman spectra acquisition conditions and its application in a comparison study on mesenchymal stem cells and embryonic stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2644-2651.

图/表（结果） 3

2.1 激光波长对人间充质干细胞和人胚胎干细胞拉曼光谱中拉曼峰的影响 为了验证激光波长对干细胞拉曼光谱的影响，首先比较在不同波长的激光(532，638，785 nm)下人间充质干细胞(图1A-C)与人胚胎干细胞(图1D-F)的拉曼光谱。

从图1A与图1D中可以看出3种不同条件下的光谱有多处不同，785 nm条件下光谱在600 cm^-¹到1 000 cm^-¹之间具有更清晰的峰型，而532 nm条件下光谱在1 500 cm^-¹到 1 700 cm^-¹之间有较高隆起。人间充质干细胞拉曼光谱中1 004 cm^-¹的平均峰强在3种不同波长激光下依次为基准峰1 450 cm^-¹的0.74倍、1.15倍和1.65倍(图1B)，人胚胎干细胞拉曼光谱中1 004 cm^-¹的平均峰强在3种不同波长激光下依次为基准峰1 450 cm^-¹的0.82倍、1.17倍和1.71倍(图1E)；而人间充质干细胞拉曼光谱中1 660 cm^-¹的平均峰强相比较于基准峰则依次为1.36倍、1.59倍、0.98倍(图1C)，人胚胎干细胞拉曼光谱中1 660 cm^-¹的平均峰强相比较于基准峰则依次为1.19倍、1.32倍和0.87倍(图1F)。1 004 cm^-¹/1 450 cm^-¹在785 nm波长的激光下比值最大，而1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹则在638 nm波长的激光下比值最大。

2.2 光栅刻度密度对人间充质干细胞和人胚胎干细胞拉曼光谱的影响 为了验证光栅刻度密度对于干细胞拉曼光谱的影响，进一步比较不同光栅刻度密度(600，1 200， 1 800 gr/mm)条件下人间充质干细胞(图2A-C)和人胚胎干细胞(图2D-F)拉曼光谱的差异。

从图2A和图2D中可以看出1 800 gr/mm条件下的光谱在600 cm^-¹到1 000 cm^-¹之间相比于1 200 gr/mm和600 gr/mm条件下得到的拉曼光谱具有更加清晰的峰。同时人间充质干细胞拉曼光谱中1 004 cm^-¹的峰强依次是基准峰1 450 cm^-¹的0.48倍、0.95倍和1.64倍(图2B)，而1 660 cm^-¹的峰强则是基准峰1 450 cm^-¹的0.72倍、0.88倍和0.98倍(图2C)；人胚胎干细胞拉曼光谱中1 004 cm^-¹的峰强依次是基准峰1 450 cm^-¹的0.54倍、1.06倍和1.71倍(图2E)，1 660 cm^-¹的峰强则是基准峰1450 cm^-¹的0.64倍、0.76倍和0.87倍(图2F)。1 004 cm^-¹/ 1450 cm^-¹的均值无论是在人间充质干细胞还是人胚胎干细胞样品中其最大值都出现在1 800 gr/mm的光栅刻度密度条件下，而最小值则出现在600 gr/mm的光栅刻度密度条件下。随着光栅刻度线密度的增加，1 004 cm^-¹/1 450 cm^-¹和1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹的比值都是逐渐增加的，但是1 004 cm^-¹/1 450 cm^-¹的比值增加程度相比于1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹的增加程度更明显。

2.3 最佳激光波长和光栅密度光谱收集条件组合的确定 在上述工作的基础上，进一步根据光谱分辨率与光谱总收集时间从3种激光波长与3种光栅刻度密度条件组合的9种不同条件(图3A-I)中筛选最佳的一个组合。根据已发表文献中人间充质干细胞的拉曼光谱的重要拉曼峰(在图中用阴影部分区分)在图中是否能较好识别以及组成光谱的数据点数的多少来选择光谱分辨率较高的光谱(表1)^[16^，^23]。

从图3A-I中可以看出，光谱在阴影部分的峰位上逐渐变得清晰和突出，其中A-E在阴影部分标注出大部分的峰位表现较为平滑甚至难以识别。根据表1可知只有图3F(638 nm 1 800 gr/mm)、图3H(785 nm，1 200 gr/mm)、图3I(785 nm，1 800 gr/mm)是由超过1 000个数据点构成，这3种光谱相较于其他的光谱在阴影部分具有更加清晰的拉曼峰位，这3种光谱的收集时间分别为100×4 s、100×4 s和100×8 s。

2.4 利用优化的组合条件比较间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱 胚胎干细胞与间充质干细胞同为重要的干细胞，分别是全能干细胞与多能干细胞，在组织工程上均可作为种子细胞，通过拉曼光谱可以寻找这2种干细胞的内在特性与区别，为干细胞的进一步研究与应用奠定基础。根据上述研究获得的最佳拉曼光谱收集条件 785 nm和1 200 gr/mm，分别收集间充质干细胞与胚胎干细胞的拉曼光谱图，并对结果求均值后得到如图4的差谱图。从图中可以看出，间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的差异主要体现在785 cm^-¹、811 cm^-¹、1 095 cm^-¹、1 575 cm^-¹等拉曼峰。

表2列举了间充质干细胞与胚胎干细胞有显著差异的拉曼光谱峰位，并将人间充质干细胞更强的峰和人胚胎干细胞更强的峰做了区分。

2.5 间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的主成分分析 由于间充质干细胞与胚胎干细胞之间在多个波数位置有差异，为了找出这2种干细胞的特征性差异，较好的区分这2种干细胞，为未来拉曼光谱应用于组织工程和干细胞检测提供理论基础，实验借助多元统计学分析方法主成分分析来区分间充质干细胞与胚胎干细胞的拉曼光谱。主成分分析通过降维的思想从众多差异峰位抽提出2个主成分PC1(主成分1)和PC2(主成分2)来代替这些差异，每一张光谱都具有一个PC1和PC2的得分，据此可以将不同的光谱区分开。

图5A通过主成分分析抽取出2个主成分PC1(98.6%)和PC2(0.5%)来代替间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱多个峰位的差异，从而简化间充质干细胞与胚胎干细胞的区分问题。可以看出利用抽取的前2个主成分可以很好地将间充质干细胞与胚胎干细胞的拉曼光谱区分开，同时，通过图5B的载荷图可以看出影响PC2的主要差异就在 785 cm^-¹、811 cm^-¹、1 095 cm^-¹、1 575 cm^-¹等峰位。

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引言

干细胞在细胞替代治疗和组织工程中有着非常重要的地位，被看作是治愈帕金森病、糖尿病、心血管疾病等多种不治之症的新希望^[1-3]。但是干细胞在实际应用中很重大的一个问题是如何对干细胞的种类、质量及其分化程度进行鉴定。传统的检测手段往往都具有耗时、需要抗体标记等多种问题，而拉曼光谱作为一种新兴的干细胞光学检测手段，相比于传统检测手段具有快速、非介入、免标记等多项优势^[4]。通过拉曼光谱鉴定和区分不同类型干细胞及其增殖分化过程已有很多研究报道^[5-9]。

对多个针对干细胞的拉曼光谱研究分析发现，所使用的拉曼光谱激光的波长往往各不相同，一般介于532 nm与785 nm之间，最终得到的拉曼光谱峰图中拉曼峰比例也不尽相同。例如，在对胚胎干细胞进行的拉曼光谱的研究中，使用785 nm激光收集得到的拉曼光谱中1 004 cm^-¹的峰强^[10-12]，相较于Pijanka等^[13]研究中使用660 nm激光收集到的拉曼光谱中1 004 cm^-¹的峰强要低，说明激光波长条件能对干细胞的拉曼光谱产生一定的影响；除此以外，在同样波长激光条件下，Tsikritsis等^[14]研究中发现胚胎干细胞拉曼光谱1 660 cm^-¹/ 1 450 cm^-¹峰强相比于Ichimura等^[12]研究中胚胎干细胞拉曼光谱1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹峰强比值更大，说明其他收集条件对拉曼光谱亦有影响。在实际使用中，也发现使用不同刻度密度的光栅可以引起干细胞拉曼光谱中峰强的差异。考虑到在不同的研究中所使用的拉曼光谱收集条件不同，因此有必要系统探明不同的拉曼光谱收集条件对于拉曼光谱的影响。

实验以间充质干细胞与胚胎干细胞为样本，分别选取不同波长的激光与不同光栅刻度密度条件收集拉曼光谱，比较干细胞拉曼光谱的差异，并使用最高的3个峰(1 004 cm^-1、 1 450 cm^-1、1 660 cm^-1)的峰强比(1 004 cm^-1/1 450 cm^-1，1 660 cm^-1/1 450 cm^-1)来体现不同波长与不同光栅刻度密度对于拉曼光谱峰图的影响，最终选取最佳条件探究间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的差异。

材料方法

1.1 设计 细胞学水平，对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2015年6月至2016年11月在中国医学科学院血液病医院血液学研究所完成。

1.3 材料 XploRA INV型拉曼光谱仪(Horiba公司)；DMEM-12培养基、胎牛血清、Tryple express、PBS(Gibco公司)；mTeSR1培养基(Stem Cell公司)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 人胎肝来源的间充质干细胞由课题组分离并鉴定，细胞培养及传代方法均参照文献[15-16]。实验使用第10代间充质干细胞^[17]，使用细胞量为5×10⁵个，经Tryple express消化，PBS清洗，然后在22 ℃下1 200 r/min离心5 min，去除上清后制成滴片，在超净台中干燥后进行拉曼光谱的收集。人胚胎干细胞H1ES细胞系^[18-19]，最早是由威斯康星大学灵长类研究中心从人类的囊胚中分离得到，具有正常的核型，高表达端粒酶，细胞表面表达灵长类胚胎干细胞表面标记，在体外进行扩增4到5个月后仍具有向三系胚层分化的潜能。人胚胎干细胞系使用mTeSR1培养基培养，传代方式为使用细玻璃棒对细胞集落井字形划块后进行传代，当细胞数量达到5×10⁵个时按上述人间充质干细胞的方法制备滴片，干燥后用于收集拉曼光谱。

1.4.2 拉曼光谱收集 实验所使用的拉曼光谱仪是Horiba公司生产的XploRA INV型拉曼光谱仪，该仪器自带532，638，785 nm 3款激光和600，1 200，1 800 gr/mm 3种光栅刻度密度。将制备好的人间充质干细胞与人胚胎干细胞滴片样品置于载物台上在40×显微镜下随机选择位点并收集每一种波长的激光与光栅刻度密度组合的拉曼光谱，单次收集时间设定为100 s。每一种组合得到的拉曼光谱都是由一定数量的数据点构成，数据点的多少将影响光谱的分辨率和总收集时间。由于实验所使用的拉曼光谱仪单次光谱最多收集1 010个数据点，当光谱的数据点超过1 010而低于 2 020个时，光谱的总收集时间将翻倍，具体时间见表1。而为了保证光谱的质量并降低宇宙射线的影响，采用了2次重复收集的模式，因此每次实验的光谱总收集时间都将乘2。

为了验证拉曼光谱受不同刻度密度光栅与不同波长激光的影响。分别比较在相同的激光条件下(785 nm)不同的光栅刻度密度条件的拉曼光谱以及相同的光栅条件下(1 800 gr/mm)不同波长激光的拉曼光谱图，并选取光谱中最高的3个峰1 004 cm^-¹、1 450 cm^-¹和1 660 cm^-¹，用1 004 cm^-¹/1 450 cm^-¹和1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹的比值来反映不同波长激光与光栅刻度密度对于光谱中拉曼峰比例的影响。

为了筛选最佳的激光波长与光栅刻度密度条件，3种波长激光与3种光栅刻度密度一共有9种不同的组合，实验将从中选择用时较短，光谱分辨率较高的拉曼光谱激光光栅收集条件。

1.4.3 拉曼光谱数据处理 得到的拉曼光谱均使用XploRA INV型拉曼光谱仪自带的Labspec6软件处理，以获得高质量的光谱。通过软件自带的光谱平滑功能平滑光谱；使用手动基线校正功能并参照文献[23]完成光谱基线的校正；以1 450 cm^-¹为标准进行最大值标准化，在很多文献中，1 450 cm^-¹被作为标准化的基准峰^[20-23]，由于它的峰强在不同种类的细胞中常常相差不大，具有一定的稳定性，因此它可以较好地反映光谱中拉曼峰比例受激光波长及光栅刻度密度条件的影响。在筛选最佳激光波长及光栅刻度密度条件时，由于一些条件下拉曼光谱的分辨率很低，导致手动基线校正较为困难，因此仅进行光谱平滑和标准化。

1.5 主要观察指标 ①比较在相同激光波长不同光栅刻度密度条件下以及相同光栅刻度密度不同激光波长条件下人间充质干细胞与人胚胎干细胞的拉曼光谱峰图中1 004 cm^-¹/1 450 cm^-¹和1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹的比值，验证不同激光波长与光栅刻度密度对拉曼光谱的影响；②通过比较所有可能的激光波长与光栅刻度密度组合条件的拉曼光谱的光谱分辨率与收集时间，最终选择最佳的拉曼光谱激光波长与光栅刻度密度组合条件；③使用最优的条件组合收集比较人间充质干细胞与人胚胎干细胞的拉曼光谱，结合差谱图与主成分分析的方法分析2种干细胞的差异。

1.6 统计学分析 数据的处理包括均值计算及图像的绘制均使用R语言3.3.1版本和ggplot2包(http://ggplot2.org/)完成，2组数据的显著性检验则使用t.test函数进行t 检验，3组数据的显著性检验使用R中的aov函数进行F 检验，P < 0.05为差异有显著意义。主成分分析使用HyperSpec包(http://hyperspec.r-forge.r-project.org/)中的prcomp函数得到。

讨论

实验通过比较不同波长激光与不同光栅的间充质干细胞光谱验证了激光波长与光栅刻度密度对细胞拉曼光谱会产生影响，且不同峰位相对峰强的改变程度不同；进一步比较不同条件下光谱分辨率与光谱总收集时间，找出最佳的激光波长与光栅刻度密度收集时间；最终使用最佳条件比较了间充质干细胞与胚胎干细胞的拉曼光谱并分析出了它们的主要差异。

不同波长激光与光栅刻度密度条件下的间充质干细胞拉曼光谱中，1 004 cm^-¹/1 450 cm^-¹和1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹的比值都会发生显著变化，说明不同的激光光栅条件对于拉曼光谱的比例会产生影响。这是由于不同波数的峰强受到的激光波长与光栅刻度密度条件的影响不同导致的。相同光栅刻度密度不同波长激光条件下，峰位1 004 cm^-¹的最大值出现在785 nm而1 660 cm^-¹最大值则出现在638 nm，相同激光条件不同光栅刻度密度条件下虽然这2个峰的最大值都出现在1 800 gr/mm，但是他们随着光栅密度刻度线增加的程度显著不同。同时，以上趋势也在人胚胎干细胞的拉曼光谱中得到了验证。在胚胎干细胞的拉曼光谱中得到的1 004 cm^-¹/1 450 cm^-¹和1 660 cm^-¹/1 450 cm^-¹的比值与在间充质干细胞中的趋势相似，但是其具体的比值却不相同，这说明激光波长与光栅刻度条件对于不同细胞的影响是类似的，具体的比值不同可能是由于样品本身的物质组成不同导致的。

在人间充质干细胞与人胚胎干细胞的拉曼光谱峰图中，处于不同波数段的拉曼峰受激光波长改变而峰强改变程度不同，这可能暗示蛋白分子与激光作用产生的拉曼散射光强与蛋白分子的结构相关，不同结构的蛋白分子其拉曼光谱收集的最佳激光波长不同；另一方面，光谱的分辨率随着光栅刻度密度的增加而增加，所有的拉曼峰都变得更加锐利，但是处于不同波数段的拉曼峰随着光栅刻度密度的增加而改变的程度却不相同，这可能暗示不同分子结构的蛋白分子，其最佳的收集拉曼散射光的光栅刻度密度不同。

在筛选最佳光栅刻度密度与激光波长条件中，去除了532 nm和638 nm波长的激光组合600 gr/mm和1 200 gr/mm光栅刻度密度收集到的光谱(图3A-E)。由于图3中的所有光谱均来自于同一间充质干细胞样品同一检测点，因此可推断差异的产生由光谱收集条件造成，所以去除A-E对应的收集条件；同时根据表1中的数据点数可以看出只有F、H和I的光谱分辨率超过1 000个，它们在阴影部分的峰型也更清晰，因此从这3个中选出最佳条件。文献已经报道近红外波长的激光对于样品的光损伤很小^[24]，因而选取波长更长的785 nm激光以减少对细胞的光损伤；在H(785 nm，1 200 gr/mm)和I(785 nm，1 800 gr/mm)两个条件组合中，光谱的总收集时间I是H的2倍，因此认为H可以在较短时间和对细胞损伤极小的情况下产生高分辨率的光谱。综上，选择H即785 nm，1 200 gr/mm条件作为最佳的拉曼光谱收集条件。这里需要指出的是虽然在这个实验条件下532 nm与638 nm波长的激光与600 gr/mm和1 200 gr/mm光栅刻度密度的组合无法得到高质量的图谱，但这并不意味着在其他的实验仪器及条件下无法得到高质量的光谱。

在间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的比较中，作者发现间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的主要差异体现在785 cm^-¹、811 cm^-¹、1095 cm^-¹、1575 cm^-¹等与核酸相关的一些峰位，这与文献中报道的一致^[13]。另外，在实验采用的收集条件下列举间充质干细胞与胚胎干细胞有显著差异的拉曼光谱峰位(表2)，发现间充质干细相比于胚胎干细胞有更高的峰位与蛋白和脂类相关，而胚胎干细胞较间充质干细胞更高的峰多数都与核酸相关。这可能与胚胎干细胞、间充质干细胞本身的性质和功能相关。胚胎干细胞是一种全能干细胞，具有更高的核质比和更强的增殖与分化能力^[18^，^25-27]，而间充质干细胞作为一种多能干细胞，除了具有一定的增殖分化能力外还能产生多种细胞因子维持造血稳态^[28-30]，因此其在蛋白与脂类的含量上更具有优势。但是作者也注意到644 cm^-¹、1 004 cm^-¹、1 157 cm^-¹、1 176 cm^-¹这些代表蛋白的峰胚胎干细胞相比于间充质干细胞更高，这提示间充质干细胞与胚胎干细胞在蛋白的种类上有差异。

通过对间充质干细胞与胚胎干细胞样品在不同波长激光与光栅刻度密度条件下拉曼光谱峰图的比较，发现不同波长的激光与光栅刻度密度对于干细胞的拉曼光谱有影响，而且对于不同波数的峰位的峰强影响不同，因此会改变光谱中2个峰之间的比值。一些文献中常常会使用2个峰的比值来区分2种不同类型或处于不同状态的细胞^[23^，^31]，例如正常与癌变细胞，不同饲养条件的同种细胞，但很多文献中仅提供所使用的激光条件而不提供光栅的选择，作者的实验提示光栅也会对细胞拉曼光谱峰与峰的比例产生影响。激光波长与光栅刻度密度对于干细胞拉曼光谱收集的影响为拉曼光谱应用于干细胞研究领域提供了一个参考，说明了不同的拉曼光谱收集条件可能会影响不同实验室成果的可比性与可移植性，为以后不同实验室利用拉曼光谱得出更加全面可靠的结果做出参考，也为通过拉曼光谱获得更加精确和详细的干细胞信息做出了铺垫。另外作者还综合考虑光谱分辨率与光谱收集时间，挑选最合适的激光光栅条件，分析了间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱峰图的差异，对光谱显著性差异的峰位进行了总结与解释，实验所使用的筛选方法对于今后的研究提供了思路，具有一定的借鉴意义。

干细胞拉曼光谱收集条件选择及间充质干细胞与胚胎干细胞拉曼光谱的比较

Optimization of Raman spectra acquisition conditions and its application in a comparison study on mesenchymal stem cells and embryonic stem cells

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