反复冻融同种异体跟腱重建前交叉韧带移植物的组织学特点

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.015

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
反复冻融：将-80 ℃存储的移植物放置室温20 ℃直至完全融化，称为冻融1次，再将融化后的移植物放入-80 ℃的冰箱冷冻，再融化，称为冻融2次，如此往复称为冻融3次及10次。
同种异体移植：同一物种内遗传基因不同个体间的细胞、组织或器官移植，是临床器官移植的主要类型。由于供者和受者间遗传背景存在差异，一般均导致排斥反应的发生。

摘要
背景：在临床应用中，经常出现解冻后的同种异体移植物由于某种原因而不用的情况，这样的异体移植物是否可以回收冷冻即经历了反复冻融的过程后继续使用呢？反复冻融后的移植物在体内的病理学改变尚无报道。
目的：观察反复冻融的同种异体跟腱重建兔前交叉韧带后移植物的组织学改变。
方法：无菌条件下选取成年雄性新西兰白兔异体跟腱，经密封包装和60Co照射灭菌后，在-80 ℃和20 ℃反复冻融。选用24只成年雄性新西兰白兔行前交叉韧带重建，其中12只左、右膝分别用冻融1次(对照组)、2次的移植物，另外12只左、右膝分别用冻融3次、10次的移植物。分别于造模后6，12，24周取材。每一时段各组随机取3条重建的前交叉韧带，通过Modified Histology Grading Score评分，评估重建前交叉韧带的细胞形态、数量、基质染色强度、纤维软骨、新骨形成、腱骨愈合、软骨损伤程度等。
结果与结论：①造模后6周冻融10次组的细胞形态、基质染色强度和总分明显高于其他组(P < 0.05)，其他各组的评分差异无显著性意义(P > 0.05)；②虽然造模后6周反复冻融10次同种异体跟腱重建的兔膝前交叉韧带的组织学评分高于冻融次数少组，但造模后12，24周不同反复冻融次数对重建前交叉韧带组织学评分的影响无明显差异；③实验仅从组织学的角度证明反复冻融多次的肌腱在术后早期组织学评分优于冻融次数较少的肌腱。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4230-5588(田明)

关键词: 组织构建, 组织工程, 反复冻融, 膝关节, 同种异体移植物, 前交叉韧带, 重建, 组织学

Abstract:

BACKGROUND: Thawed allografts are usually discarded for various reasons. Whether these discarded allografts can be refrozen for later use and their histological changes in vivo have not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the histological characteristics of anterior cruciate ligament (ACL) reconstructed with the repetitive freeze-thawing allogenic Achilles tendon in New Zealand white rabbits.
METHODS: Allogenic Achilles tendons were harvested from adult male New Zealand white rabbits, and were stored at -8 ℃ and thawed at 20 ℃ for 1, 2, 3 and 10 times, respectively, after sealed package and 60Co irradiation. Twenty-four adult male New Zealand white rabbits were enrolled: the left and right knees of 12 rabbits were respectively reconstructed with 1 (control group) and 2 times of freeze-thawing allogenic Achilles tendon, and another 12 rabbits underwent reconstruction with 3 and 10 times of freeze-thawing allogenic Achilles tendon, respectively. Three specimens from each group were evaluated with modified histology grading scores at 6, 12 and 24 weeks to assess the cell morphology, cell quantity, matrix staining intensity, fibrocartilage formation, new bone formation, tendon healing and cartilage injury.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell morphology, matrix staining intensity and total scores of the 10 times group were significantly higher than those of the other groups at 6 weeks (P < 0.05), but other parameters showed no significant differences among groups (P > 0.05). ACL reconstructed with 10 times of repetitive freeze-thawing allogenic Achilles tendons had higher histological scores at 6 weeks after modeling, but no significant differences were shown at 12 and 24 weeks after modeling. To conclude, our study only testifies better histological scores on the multiple times of freeze- thawing Achilles tendon than the less times of freeze-thawing Achilles tendon at the early period after operation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Freezing, Histology, Anterior Cruciate Ligament, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

田明，余家阔，吴延平. 反复冻融同种异体跟腱重建前交叉韧带移植物的组织学特点[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2546-2551.

Tian Ming, Yu Jia-kuo, Wu Yan-ping. Histological characteristics of the reconstructed anterior cruciate ligament with repetitive freeze-thawing allogenic Achilles tendon[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2546-2551.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 24只兔随机分成2组，实验过程无脱失，进入结果分析24只。

2.2 大体评估

造模后6周：伤口愈合良好，兔膝关节活动度正常。重建的前交叉韧带与胫骨和股骨骨道口处可见部分愈合，并形成一定的张力，膝关节未见明显关节积液，可见滑膜中

度增生，部分滑膜覆盖重建的前交叉韧带组织，滑膜表面可见少量充血，软骨外观形态尚可。重建的前交叉韧带部分被吸收，较正常前交叉韧带细。冻融10次组在粗细程度上稍粗于其他组(图2a)。

造模后12周：重建的前交叉韧带与胫骨个股骨愈合良好，重建的前交叉韧带较粗壮，张力良好，颜色接近正常的前交叉韧带，周围滑膜增生减轻，呈轻度增生，未见明显关节积液，膝关节软骨轻度退变，不同冻融次数的各组间无明显差别(图2b)。

造模后24周：重建的前交叉韧带与骨道外口愈合良好，张力较好，形态接近正常前交叉韧带，并有正常前交叉韧带的光泽，膝关节未见明显关节积液和滑膜增生，关节软骨退变较12周时严重，未见不同冻融次数的各组间有明显差别(图2c)。

2.3 组织学评估

造模后6周：移植物周围有少量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主。移植物内出现大量细胞增殖数量甚至超过正常前交叉韧带，分布不均，在移植物边缘可以发现细胞集群并有血管增生，移植物中央细胞减少甚至发现无细胞区，冻融10次组的细胞分布较其他组均匀，细胞形态稍好于其他组，细胞增殖数量多于其他组但是无显著性差异，基质染色强度冻融10次组强于其他组，未见明显的软骨化区域，50%的腱骨界面区域有肉芽组织和纤维结缔组织与骨道壁紧密相连，局部仅有少量Sharpey样纤维连接形成，但未见明显的新骨形成。残留的Ⅰ型胶原仍然较多，有一定量的新生Ⅲ胶原分泌，未见明显的Ⅱ型胶原分泌(图3，4)。

造模后12周：移植物内的细胞增殖数量仍然超过正常前交叉韧带，但是较造模后6周时有所下降，分布较造模后6周时均匀，大部分呈弥漫性增生，在移植物的边缘和中心仍然可见少量血管增生，大部分移植物的中央未发现明显的无细胞区，细胞分布较均匀，形态为卵圆形的成纤维细胞较多，与正常前交叉韧带相似的细长的梭形细胞较少，基质染色强度稍强于造模后6周，仅有很少的骨道边缘出现软骨化区域，区域内有少量Ⅱ型胶原表达，新骨形成仍然不明显，75%-50%的区域移植物与骨道之间有肉芽组织和纤维结缔组织紧密相连，有较多Sharpey样纤维连接，更成熟，更加致密有序，但是，造模后12周各组间对比未见明显差异。重建的前交叉韧带中有一定量的Ⅰ型胶原表达，有较多的Ⅲ型胶原分泌，未见明显的Ⅱ型胶原分泌(图5，6)。

造模后24周：移植物中的细胞数量较造模后6，12周时明显减少，接近正常前交叉韧带的细胞数量。分布较12周时均匀，接近正常前交叉韧带，移植物中的血管数量较12周时减少，接近正常前交叉韧带，细胞逐渐由高代谢的卵圆形成纤维细胞转变为接近正常前交叉韧带的低代谢的细长梭形的细胞。基质染色强度与12周时差别不明显，腱骨界面出现大量纤维软骨形成，明显较12周时多，并有大量软骨细胞生成，区域内有大量Ⅱ型胶原表达，腱骨间由6周和12周时的间接止点愈合向直接止点愈合转变，部分骨道中有新骨形成，局部仍有 Sharpey样纤维连接较12周时更加致密有序，骨道中的大部分区域腱与骨的连接紧密，但是，术后24周的各组间未见明显差异。重建前交叉韧带中有大量Ⅰ型和Ⅲ型胶原分泌，未见明显的Ⅱ型胶原分泌(图7，8)。

2.4 组织学评分 造模后6周冻融10次组的细胞形态，基质染色强度和总分明显高于其他组(P < 0.05)，其他各组评分差异无显著性意义(表2)。

参考文献

[1] Kuhn MA, Ross G.Allografts in the Treatment of Anterior Cruciate Ligament Injuries. Sports Med Arthrosc.2007;15 (3):133-138.

[2] Arnoczky SP, Warren RF, Ashlock M. Replacement of the anterior cruciate ligament using a patellar tendon allograft. An experimental study. J Bone Joint Surg Am.1986;68(3):376-385.

[3] 江东,余家阔,敖英芳,等. 4例同种异体半月板移植术后中期随访报告[J].中国微创外科杂志2009, 9(6):545-548.

[4] Miller SL, Gladstone JN. Graft selection in anterior cruciate ligament reconstruction. OrthopClin North Am.2002;33: 675-683

[5] Mahirogullari M, Ferguson CM, et al. Freeze-dried allografts for anterior cruciate ligament reconstruction.Clin Sports Med. 2007;26(4):625-637.

[6] Gibbons MJ, Butler DL, Grood ES, et al.Effects of gamma irradiation on the initial mechanical and material properties of goat bone- patellar tendon-bone allografts. J Orthop Res. 1991;9(2):209-218

[7] 吴延平,王英振,余家阔,等.反复冻融处理同种异体移植兔跟腱组织学及生物力学变化[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(5):816-819.

[8] 关于善待实验动物的指导性意见.中华人民共和国科学技术部文件,国科发财字[2006]398号.

[9] Benjamin M, Evans EJ, Copp L.The histology of tendon attachments to bone in man. J Anat.1986;149(12):89-100.

[10] Noyes FR, Butler DL, Grood ES,et al. Biomechanicalanalysis of human ligament grafts used in knee-ligament repairsand reconstructions. J Bone Joint Surg Am.1984; 66A:344-352

[11] 龚熹,敖英芳,于长隆.自体髌腱与自体四股腘绳肌腱重建前交叉韧带对髌股关节软骨影响的关节镜对比观察研究[J]. 中国运动医学杂志,2007,26(3):271-274

[12] Jiakuo Yu, Paessler HH. Relationship between tunnel widening and different rehabilitation procedures after ACL reconstruction with quadrupled hamstring tendons. Chinese Medical Journal.2005;118(4): 320-326.

[13] 马广文,余家阔,李军,等.对2例膝关节前交叉韧带部分断裂与重建的初步临床观察.中国运动医学杂志,2006, 25(6):713, 715.

[14] Avery FL.(2004) The sports medicine centre ACL graft options [online]. Available: http://www.orthoassociates.com/ ACL_grafts.htm [accessed 20.7.2004]

[15] Sherman OH, Banffy MB.Anterior cruciate ligamentreconstruction: which graft is best? Arthroscopy. 2004;20(9):974-80.

[16] Fahey M,IndelicatoPA.Bone tunnel enlargement afteranterior cruciate ligament replacement. Am J Sports Med.1994;22(3): 410-414.

[17] Frank CB, Jackson DW.The science of reconstruction ofthe anterior cruciate ligament—current concepts review.J Bone Joint Surg Am.1997;79A:1556-1576.

[18] Dustmann M, Schmidt T, Gangey I, et al.The extracellular remodeling offree-soft-tissue autograftsand allografts for reconstruction of the anterior cruciate ligament:a comparison study in a sheep model.KneeSurg Sports Traumatol Arthrosc. 2008;16:360-369.

[19] Sharpey W, Ellis GV. Elements of anatomy. London: Walton and Moberly.1856;Voll: Ed6.

[20] Rodeo SA, Arnoczky SP, Torzilli PA, et al.Tendon-healing in a bone tunnel. A biomechanical and histological study in the dog.J Bone Joint Surg Am.1993;75(12):1795-1803.

[21] Panni AS, Milano G, Lucania L, et al. Graft healing after anterior cruciate ligament reconstruction in rabbits. Clin Orthop Relat Res.1997;10(343):203-212.

引言

材料方法

1.1 设计 动物实验观察。。

1.2 时间及地点 实验于2007年9月至2010年6月在北京大学医学部完成。

1.3 材料 选取体质量2.0-2.5 kg成年雄性新西兰大耳白兔36只，由北京大学医学部动物实验中心提供，许可证号：SCXK(京)2005-0002。实验过程中严格按照2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》对动物进行处理^[8]。

1.4 实验方法

1.4.1 移植物的制备和实验分组 随机选用24只体质量2.0-2.5 kg成年雄性新西兰白兔，无菌条件下截取兔双下肢跟腱，近端至肌肉、肌腱移行处，远端至跟骨结节腱骨移行处。严格按照人体组织库[国食药监械(准)字2007第3460205号]的处理程序取材并处理，装入3层无菌塑料袋封装，将移植物以25 kGy的剂量用⁶⁰Co正面照射，然后分别进行深低温(-80 ℃)、室温(20 ℃)反复冻融1，2，3，10次后待用。

选用24只体质量2.0-2.5 kg成年雄性新西兰白兔行前交叉韧带重建手术，随机选取12只兔，左、右膝分别用冻融1次、2次的移植物，另12只兔左、右膝分别用冻融3次、10次的移植物。遂将48个兔膝关节分为冻融1次对照组(n=12)、冻融2次组(n=12)、冻融3次组(n=12)及冻融10次组(n=12)。

1.4.2 前交叉韧带损伤模型的建立 造模前给予青霉素40万单位肌肉注射。将兔用20%乌拉坦按5 mL/kg麻醉满意后，固定在手术台上。按常规将兔后腿备皮、消毒、铺巾。首先将异体移植物室温下解冻后，两端用2号编织线(带线缝合针圆1/26×142/090cm 上海医用缝合针厂有限公司)编织(图1a)，放在盐水中待用。沿髌骨内侧依次切开皮肤、皮下组织，切断内侧支持带，将髌骨推向外侧并脱位，暴露股骨髁和胫骨平台，在正常前交叉韧带胫骨及股骨止点处切断前交叉韧带，然后用直径2 mm的骨钻沿着前交叉韧带纤维走行方向分别在被切除前交叉韧带的胫骨及股骨止点中心点打骨道(图1b)，将编织好的移植物拉入骨道内(图1c)，两端分别打结固定在胫骨及股骨上(图1d)，确认前抽屉试验为阴性，之后依次缝合关节囊、皮下组织及皮肤。造模后不固定膝关节，动物自由活动。造模后连续3 d给予青霉素40×10⁴U肌肉注射。

1.4.3 动物标本取材 造模后6，12，24周麻醉下分批处死动物取材。取动物的双膝关节，打开关节腔，去除关节周围软组织，从关节上下各2 cm处切断股骨和胫骨，其中，每组每个时间点中取3只将重建的前交叉韧带切断放入中性甲醛中固定，将股骨及胫骨标本放入脱钙液中脱钙。

1.4.4 标本处理及组织切片 首先用生理盐水将标本冲洗干净，固定于40 g/L多聚甲醛-0.1 mol/L磷酸缓冲液中3 d，然后自来水冲洗12 h。含股骨和胫骨标本延骨道方向修切成约1.0 cm×0.8 cm×0.5 cm大小，标记标本。将标本放入甲酸-甲醛脱钙液中脱钙1周。流水冲洗过夜，彻底去除脱钙液。将标本梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸于56-58 ℃蜡中。常规方法包埋后，修整蜡块为梯形，标记。以5 µm连续切片，捞于涂有蛋白甘油或多聚赖氨酸的载玻片上。在37 ℃，烤片24 h。

1.4.5 组织学染色

苏木精-伊红染色：组织切片，用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化至自来水，蒸馏水涮洗。苏木精染色液染色3 min，分化、反蓝，自来水涮洗，入伊红染色液一两分钟。自来水涮洗，梯度乙醇脱水至二甲苯，中性树胶封固。

免疫组织化学染色：切片常规脱蜡，逐级乙醇脱水，PBS水化。每张切片滴加1滴胃蛋白酶，37 ℃下孵育30 min。PBS冲洗3次×5 min。每张切片滴加1滴过体积分数3%过氧化氢，室温下避光孵育15 min。PBS冲洗3次×5 min。每张切片上滴加1滴一抗，4 ℃下孵育过夜。PBS冲洗3次×5 min。切片滴加1滴二抗，37 ℃下孵育60 min。PBS冲洗3次× 5 min。切片滴加10 μL新鲜配制的DAB溶液，避光显色3-10 min。自来水冲洗，苏木精复染后封固。光镜下观察、照相(lecia DM6000B，Room 858，Office Tower，Beijing New Century Hotel No. 6，Southern Gym. RoadBeijing, CN-100044 China )。

1.4.6 韧带和骨道的组织学评分^[9](表1) ①前交叉韧带的组织学评分(A)，分成细胞形态、细胞数量和基质染色强度3个方面；②骨道评分(B)，分成纤维软骨形成、新骨形成和移植物与骨道结合3个方面。

1.5 主要观察指标 细胞形态，细胞数量，基质染色强度，纤维软骨形成数量，新骨形成数量，骨道结合等指标。

1.6 统计学分析 所有结果以x(_)±s表示，符合正态分布的两组独立样本的计量资料均数比较采用t 检验。不符合正态分布的两组独立样本的计量资料均数比较采用非参数秩和检验(Mann-Whitney检验)。所有数据均采用SPSS 13.0软件作统计学分析，P < 0.05时差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 同种异体移植物在前交叉韧带重建中的应用 随着前交叉韧带重建成为前交叉韧带断裂的标准处理方式^[2]，人们对移植物的选择做了大量研究。为了解决自体移植物的缺点(供区病损、膝前疼痛、股四头肌无力、膝关节纤维性粘连、髌腱炎、髌腱断裂、髌骨骨折、隐神经瘤及神经痛、伸髋肌群无力^[10])，20世纪80年代，首次出现应用异体移植物重建前交叉韧带和对重建失败的前交叉韧带进行翻修的手术方法，如今，该方法随着研究的深入逐渐得到了学者的认可，应用更为广泛^[11-13]。虽然自体BPTB被认为是前交叉韧带重建的“金标准”^[3]，但是异体移植物也有很多优势。其中最显著的优势即不存在供区病损。其他优势如：手术时间短、只需要很小的切口，同时也有很好的术后效果、不受肌腱尺寸和局部骨缺损的限制、更适合做翻修手术，也不存在多发韧带损伤需要进行多韧带重建时带来的自体肌腱不够用的问题，术后关节纤维性粘连的发病率也比较低^[14]。但是异体前交叉韧带移植物的应用也存在很多风险，其中最突出的是一些疾病的传播(病毒及细菌)、也可能存在宿主的免疫排斥反应、延迟愈合、骨道扩大等。其他不足还包括：韧带准备过程及消毒灭菌过程导致的机械性能下降、术后再断率增加、长期的术后效果还需观察、手术费用高等^[15]。

3.2 反复冻融对同种异体移植物生物力学和组织学的影响 吴延平和余家阔等^[7]研究发现，反复冻融的兔跟腱随着冻融次数的增加，胶原纤维会发生排列紊乱、皱缩和断裂，而且，纤维间隙逐渐会增加，并可见有细胞崩解、冰晶形成、腱细胞排列无规律，其生物力学性能也随之下降。

异体肌腱移植后移植物需要经过缺血坏死期、细胞长入期、血管再生期、胶原重塑等4个时期。移植物中心首先出现缺血，大量供体细胞坏死，这一过程中，移植物还会释放大量的细胞因子。细胞因子可以促进血管由移植物的边缘向中心逐渐再生，随之，宿主细胞也由移植物的边缘向中心迁移并长入残余的胶原支架，残余的胶原支架逐渐崩解，与此同时，长入的细胞分泌大量胶原并逐渐取代残余胶原支架，胶原排列逐渐规则，胶原含量逐渐接近并达到正常前交叉韧带水平^[16]。

异体移植物在细胞长入与胶原重塑期比自体移植物慢，需要自体移植物重塑时间的1.5-2.0倍^[17]。Dustmann等^[18]研究发现，异体移植物的细胞从外周向中心长入，术后早期分布不均，术后6周开始出现大量的成纤维细胞从外周向中心涌入，但是其高峰期比自体移植物延后。随着时间延长，细胞数量逐渐减少，至术后1年细胞数量仍高于正常前交叉韧带，细胞分布逐渐规律，细胞形态从肌腱移植物的柱状细胞逐渐变成类似正常前交叉韧带的卵圆形细胞。

前交叉韧带重建的成功与否与重建后能否在骨道中形成坚固的止点息息相关，前交叉韧带重建后的骨道内的组织学转归有直接止点和间接止点2种，直接止点与正常前交叉韧带的止点结构相似，分为4层：肌腱组织、纤维软骨层、钙化软骨层、骨组织，潮线位于纤维软骨层和钙化软骨层之间^[19]。间接止点即肌腱组织通过Sharpey纤维并以一定的角度与骨道相连^[20]。目前，前交叉韧带重建后的止点存在争论，Panni等^[21]认为肌腱与骨道的愈合为间接止点。Rodeo等^[20]观察发现，腱骨愈合首先在腱骨界面形成富含细胞和血管的纤维结缔组织，并逐渐改建，新生的肉芽组织逐渐转变为纤维组织，并延应力的方向排列。12周时，腱骨界面形成Sharpey纤维，至术后26周仍未观察到直接止点的4层结构。但有学者认为腱骨愈合最终可以形成直接止点结构^[19]。

实验的组织学观察发现在术后早期，首先在腱骨界面出现大量细胞和血管的纤维结缔组织，并逐渐改建，新生的肉芽组织逐渐转变为纤维组织，并延应力的方向排列，局部腱骨界面形成Sharpey纤维，冻融10次组缺血坏死期的时间缩短，细胞长入期的时间延长，所以术后早期冻融10次组的组织学评分高于其他组。术后12周和24周，骨道边缘出现大量类软骨细胞，腱骨愈合逐渐接近直接止点，随着冻融10次组优势的减弱，术后12周和24周各组的组织学表现未见明显差异。

3.3 临床上同种异体移植物的反复冻融问题 在临床工作中，经常会遇到提前准备好的异体肌腱由于各种原因而未使用的情况，这样的肌腱回收后即经历了反复冻融的过程，回收后的肌腱是否可以再次使用呢？或者是否可以通过人为增加反复冻融次数使术后早期移植物达到更好的组织学和生物力学性能？用反复冻融的移植物重建的前交叉韧带早期所有的更好的组织学和生物力学性能是否可以满足更快速的术后康复训练要求，缩短术后康复时间，为运动员术后服务？

实验仅从组织学的角度证明反复冻融多次的肌腱在术后早期组织学评分优于冻融次数较少的肌腱。上述问题还需要进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程