C促红细胞生成素在脑梗死后微循环再通中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
促红细胞生成素：是一种可以增加人体血液中红细胞数量、提高血液含氧量的激素，在正常人体内有一定的含量，用于维持和促进正常的红细胞代谢。可以被用来增加贫血患者体内的红细胞数量改善贫血状况。在运动项目中，人为地增加血液中促红细胞生成素的浓度，对提高运动员的运动成绩和提高运动员的耐力，也能够起到一定的作用，因此促红细胞生成素是反兴奋剂检测中最主要的项目之一。
微循环：是指微动脉和微静脉之间的血液循环，是血液与组织细胞进行物质交换的场所。微循环的基本功能是进行血液和组织液之间的物质交换。正常情况下，微循环的血流量与组织器官的代谢水平相适应，保证各组织器官的血液灌流量并调节回心血量。如果微循环发生障碍，将会直接影响各器官的生理功能。

摘要
背景：C促红细胞生成素可明显提升脑梗死患者预后，且促进心肌梗死后脑微循环再生。
目的：探究C促红细胞生成素提升脑梗死患者预后的具体机制。
方法：150只Wistar大鼠，随机取120只建立大鼠脑梗死动物模型后分为：诱导脑梗死组，诱导脑梗死组+C促红细胞生成素处理(浓度500，1 000，2 000 U/kg)组，另30只大鼠为空白对照。体外分离并培养脑梗死动物模型微循环血管内皮细胞，CCK8实验检测细胞增殖情况；Western blot检测与增殖相关基因(Ki67， p16)和血管内皮生长因子蛋白表达，RNA干扰技术选择性沉默血管内皮生长因子蛋白的表达，重复上述指标检测。
结果与结论：①CCK8实验显示，随着C促红细胞生成素浓度的上升，微循环血管内皮细胞的增殖能力也同步上调；Western blot显示，增殖相关基因(Ki67，p16)和血管内皮生长因子蛋白表达水平也显著上调；②shRNA-VEFG 干扰后，CCK8及Western blot实验显示，微循环血管内皮细胞的增殖能力及增殖相关基因(Ki67，p16)的表达未随C促红细胞生成素浓度的上调成正比；③结果提示，C促红细胞生成素通过上调血管内皮生长因子促进脑梗死动物模型微循环血管内皮细胞的增殖。

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ORCID: 0000-0002-9202-6093(张起顺)

关键词: 组织构建, 组织工程, C促红细胞生成素, 脑梗死, 微循环血管内皮细胞, 增殖, 血管内皮生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Carbamylated erythropoietin (CEPO) cannot only remarkably promote the prognosis of cerebral infraction, but also improve the microcirculation.
OBJECTIVE: To explore the underlying mechanism of CEPO promoting the microcirculation following cerebral infraction.
METHODS: 150 Wistar rats were selected, and 120 rats were used for establishing the models of cerebral infarction, followed by allotted into four groups. The model rats were treated with 500, 1 000 and 2 000 u/kg CEPO as experimental groups, and those received no treatment as model group. The other 30 rats were as controls. Vascular endothelial cells were isolated and cultured in vitro, and the cell proliferation was detected by cell counting kit-8 assay. The expression levels of proliferation-related genes (Ki67 and p16) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected using western blot assay. After selective silencing of VEGF through RNA interference, all above indicators were detected again.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell counting kit-8 assay results showed that the proliferation ability of vascular endothelial cells was increased with CEPO concentration increasing. Western blot assay results showed a significant upregulation of Ki67, p16 and VEGF. After shRNA-VEFG interference, these indicators had no positive correlation with the increased concentration of CEPO. Our findings indicate that CEPO can improve the proliferation of vascular endothelial cells in an animal model of cerebral infarction via upregulating the VEGF expression.

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Key words: Cerebral Infraction, Microcirculation, Vascular Endothelial Growth Factors, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张起顺，陈勇，王朝辉，吴春芳，赵俊. C促红细胞生成素在脑梗死后微循环再通中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2534-2539.

Zhang Qi-shun, Chen Yong, Wang Zhao-hui, Wu Chun-fang, Zhao Jun. Carbamylated erythropoietin promotes vascular microcirculation following cerebral infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2534-2539.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠150只，分为3组，实验过程中涉及所有大鼠均无任何脱失，全部进入结果分析。

2.2 C促红细胞生成素可明显促进脑梗死大鼠脑微循环灌注 结果显示，相比于空白对照组，脑梗死大鼠的所有检测指标均显著上调；而相比于脑梗死组，在经C促红细胞生成素处理后的脑梗死大鼠中，所有检测指标均明显下调(P < 0.05)，提示C促红细胞生成素可明显改善脑梗死大鼠脑脉微循环的功能。然而，与血管损伤相关因子的表达变化显著高于与血栓形成相关因子的变化幅度：前列环素 (3.7±1.9)倍、内皮素1(15.0±2.1)倍、血管紧张素Ⅱ(12.3±1.2)倍、vWF(5.7±1.9)倍。同时在C促红细胞生成素不同浓度处理大鼠，与对照及脑梗死动物模型相比，差异均有显著性意义，其中以浓度为1 000 U/kg差异最为明显(图1)。提示，C促红细胞生成素明显改善脑梗死大鼠脑脉微循环的功能，可能与脑梗死循环内皮修复相关。

2.3 C促红细胞生成素可明显促进脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖 采用CCK8体外细胞活力检测实验，结果显示，相比于空白对照组，脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞的数量显著降低[(0.3±1.2)倍，P < 0.01]；而C促红细胞生成素却可明显提升脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞数量[(1.9±0.8)倍，P < 0.01](图2)，其中以浓度为1 000 U/kg差异最为明显。为进一步确定C促红细胞生成素是否可通过促进脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖且，且抑制凋亡，采用realtimePCR实验检测了与增殖及凋亡相关基因的表达，结果显示，相比于未经C促红细胞生成素处理的脑梗死大鼠，与增殖相关基因表达均明显上调[Ki67 (9.0±1.1)倍，P < 0.01]及p16[(6.0±1.2)倍，P < 0.01]；而同时与凋亡相关基因的表达均显著下调Bad[(0.1±0.6) 倍，P < 0.01]及Bax[(0.08±0.07)倍，P < 0.01]。提示，C促红细胞生成素可通过促进脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖，以改善脑梗死大鼠脑微循环的功能。

2.4 C促红细胞生成素通过上调血管内皮生长因子表达以促进脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖 通过实时定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印记(western blot)实验分别从mRNA和蛋白水平两方面，检测了脑微循环内皮细胞内血管内皮生长因子和血管紧张素1的表达(图3A-C)。结果显示，相比于脑梗死组，在经C促红细胞生成素处理后的脑梗死大鼠中，血管内皮生长因子的表达水平显著上调[(9.0±1.5)倍， P < 0.01]，而血管紧张素1表达未见显著变化，其中以浓度为1 000 U/kg差异最为明显，提示血管紧张素1可能在C促红细胞生成素促进脑微循环内皮细胞增殖过程中并未起主导作用。进一步，采用RNA干扰技术，选取C促红细胞生成素差异最为明显浓度1 000 U/kg为处理剂量，特异性降低脑微循环内皮细胞内血管内皮生长因子蛋白的转录。结果显示，经RNA干扰后，C促红细胞生成素促进脑微循环内皮细胞体外增殖能力显著降低[(0.6±0.2)倍，P < 0.01](图3D-E)，提示，C促红细胞生成素可通过上调血管内皮生长因子表达以促进脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖，以改善脑梗死大鼠脑微循环的功能。

参考文献

[1] Gurav AN. Management of diabolical diabetes mellitus and periodontitis nexus: Are we doing enough? World J Diabetes. 2016;7(4):50-66.

[2] Balc?o?lu AS, Müderriso?lu H. Diabetes and cardiac autonomic neuropathy: Clinical manifestations, cardiovascular consequences, diagnosis and treatment. World J Diabetes.2015;6(1):80-91.

[3] 侯兰,吕娟, 陈莉娜.促红细胞生成素的多器官保护作用研究进展[J].中国药房,2014(17):1626-1628

[4] Schöffel N,Börger JA,Quarcoo D,et al.[Erythropoietin - state of science]. Sportverletz Sportschaden.2008;22(4):201-206.

[5] Xu K,George I,Klotz S,et al.Erythropoietin derivate improves left ventricular systolic performance and attenuates left ventricular remodeling in rats with myocardial infarct-induced heart failure. J Cardiovasc Pharmacol.2010;56(5):506-512.

[6] Sanchis-Gomar F, Garcia-Gimenez JL, Pareja-Galeano H,et al.Erythropoietin and the heart: physiological effects and the therapeutic perspective.Int J Cardiol.2014;171(2):116-125.

[7] Ogunshola OO, Bogdanova AY. Epo and non-hematopoietic cells: what do we know? Methods Mol Biol. 2013;982:13-41.

[8] He H,Qiao X,Wu S.Carbamylated erythropoietin attenuates cardiomyopathy via PI3K/Akt activation in rats with diabetic cardiomyopathy. Exp Ther Med. 2013;6(2):567-573.

[9] Xu X,Cao Z,Cao B,et al.Carbamylated erythropoietin protects the myocardium from acute ischemia/reperfusion injury through a PI3K/Akt-dependent mechanism. Surgery. 2009;146(3):506-514.

[10] Dashkevich A,Hagl C,Beyersdorf F,et al. VEGF Pathways in the Lymphatics of Healthy and Diseased Heart. Microcirculation.2016;23(1):5-14.

[11] Cubranic A,Redzovic A,Dobrila-Dintinjana R,et al. Mystery Story about Erythropoietin (Epo) and Erythropoietin Receptor (EpoR) are Disguised? Hepatogastroenterology. 2015;62 (139):585-589.

[12] Bjornstad P, Truong U, Dorosz JL, et al.Cardiopulmonary Dysfunction and Adiponectin in Adolescents With Type 2 Diabetes.J Am Heart Assoc. 2016;5(3):e002804.

[13] Meredith IT,Tanguay JF,Kereiakes DJ,et al.Diabetes Mellitus and Prevention of Late Myocardial Infarction After Coronary Stenting in the Randomized Dual Antiplatelet Therapy Study. Circulation.2016;133(18):1772-1782.

[14] Heinonen I,Sorop O,de Beer VJ,et al.What can we learn about treating heart failure from the heart's response to acute exercise? Focus on the coronary microcirculation. J Appl Physiol (1985). 2015;119(8):934-943.

[15] Fiordaliso F,Chimenti S,Staszewsky L,et al.A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(6):2046-2051.

引言

急性缺血性脑损伤是一类高发病率、死亡率的神经内科急症^[1]，血栓形成所致脑血管阻塞，进一步导致脑细胞损伤是其主要的发病机制。基于脑细胞损伤的不可逆性，快速短期疏通血栓阻塞血管，恢复脑组织血供具有重要临床意义及社会医学价值。急性脑梗死主要是基于高凝或血液动力学异常，患者凝血异常和微血管病变的基础上，进而出现血栓形成，脑组织广泛性坏死、脑微循环障碍及心功能失代偿，以致最后出现脑梗死等并发症^[2]。在过去的几十年里，脑梗死的治疗常局限于溶栓、介入等对症治疗，但溶栓随之的出血风险及介入对时间的严格要求，极大程度上限制了脑梗死患者的临床治疗。因此，制定有效的预防和干预策略已迫在眉睫。

促红细胞生成素是由肾小管周围间质细胞以及肝细胞所分泌的一肾源性激素，促进机体骨髓造血是其主要的生理作用。然而，研究发现其还具有包括组织保护、促进组织损伤与修复及促进血管内皮再生等众多生理作用。在缺氧的条件下，促红细胞生成素可大量分泌至外周血，以发挥其生理效应^[3-4]。然而，长期或大剂量应用促红细胞生成素可引起骨髓造血系统过度刺激，以致红细胞过度增多，引起循环血液高凝、血栓形成以及高血压等并发症，并且合用于脑梗死患者可加重患者病情的恶性程度^[5-6]。氨甲酰促红细胞生成素(C促红细胞生成素)是促红细胞生成素的一衍生物^[7]，其与促红细胞生成素拥有相同的生理效应、药代动力学等特点，但却可避免骨髓过度刺激所致环血液高凝、血栓形成以及高血压等并发症。研究显示，C促红细胞生成素可有效改善脑梗死大鼠预后，起到脑细胞保护、改善脑细胞功能、抗脑组织纤维化、抑制炎症反应以及抗凋亡的作用。由于机体心功能的维持有赖于脑细胞活力与脑微循环的共同配合，而脑细胞生理活动的展开又依赖于微循环的畅通。面对C促红细胞生成素可有效改善脑梗死大鼠脑功能的实验现象^[4]，还未有报道显示C促红细胞生成素可显著改善脑微循环灌注。因此研究以C促红细胞生成素可有效改善脑梗死大鼠脑功能的实验现象为依据，以脑梗后脑微循环为切入点，通过生理、细胞分子生物学实验，探究C促红细胞生成素提升脑梗死患者预后的具体机制，以为后续脑梗死患者的干预与处置提供新型的理论指导。

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材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验，细胞分子生物学实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年6至12月在河南大学淮河医院完成。

1.3 材料

实验动物：选取150只健康雄性Wistar大鼠，体质量为220-240 g。所有大鼠均购买于华中科技大学同济医学院动物实验中心。

药品及试剂：C促红细胞生成素、STZ、FBS(Gibco公司)，双抗-青链霉素，trizo核酸裂解液，反转录试剂盒，qPCR试剂盒、蛋白发光液、CCK8细胞增殖检测试剂盒(碧云天公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠脑梗死模型的建立及C促红细胞生成素治疗所有大鼠均于X射线透视下，行血管介入栓塞，并于大脑中动脉处递放海藻酸盐，X射线造影下确认血管已完全栓塞。一共选取150只健康雄性Wistar大鼠，其中30只为空白对照组，30只诱导脑梗死组，90只诱导脑梗死+C促红细胞生成素处理组。

大鼠脑梗死模型的C促红细胞生成素治疗：随机分配120只诱导脑梗死大鼠，30只诱导脑梗死组，90只诱导脑梗死+C促红细胞生成素处理组。C促红细胞生成素按照500，1 000，2 000 U/kg的浓度，每组30只，腹腔注射，每周2次，空白对照组及脑梗死组予以等量生理盐水。药物持续处理4周。

1.4.2 脑微循环原代细胞分离与培养 造模后用药4周，获取大鼠栓塞附近脑血管(对照组为大脑中动脉附近血管)，显微镜下分离微循环组织，随后将已经分离的组织，整体培养于完全培养基DMEM，37 ℃，体积分数5%CO₂环境中，观察组织周围细胞爬出情况。由于内皮细胞的增长速度显著高于周围组织细胞，约3 d后，光镜下可观察到，由组织向周围爬出成纤维样、具有抵触抑制特性的细胞，即脑微循环内皮细胞。随后，胰蛋白酶消化爬出的内皮细胞，接种于新培养皿中，记为第1代。

1.4.3 CCK8增殖检测实验 原代分离并培养脑微循环内皮细胞，待其生长稳定后，消化细胞，提前1 d以30%浓度接种于96孔板(Hyclone公司)。随后5 d，每天以1∶10的比例加入CCK8试剂，37 ℃孵育2 h，吸取上清液，紫外分光光度仪测量450 nm下A值，检测C促红细胞生成素对脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖能力的影响。

1.4.4 提取RNA 0.25%胰蛋白酶收集对数期细胞，加入适量trizo，冰上孵育15 min、12 000×g离心10 min，体积分数75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于DEPC水，存于-70 ℃。

1.4.5 实时定量PCR(qPCR) 提取总RNA反转录成cDNA，进行荧光定量PCR反应。反应条件：95 ℃预变性 10 min，(95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)×40循环，72 ℃末次延伸5 min。采用2^-^??Ct法进行相对定量分析，检测1，2，3 d(空白对照组，诱导脑梗死组及诱导脑梗死+C促红细胞生成素处理组)3组细胞凋亡相关基因Bad，Bax及血管内皮生长因子和血管紧张素1的表达。

引物序列：

血管内皮生长因子：正向序列：5’-GAT TAC GTA CGG GTA CCC ATA TCG TTT-3’；反向序列：5’-AAA CGA TAT GGG TAC CCT ACG TAA TC-3’。

血管紧张素1：正向序列：5’-TTA ACC GAC GTG CAT GCA TAA CTT GGA CTT A-3’；反向序列：5’-TAA GTC AAG TTA TGC ATG CAC GTC GGT TAA-3’。

细胞转染：将细胞以70%-80%的密度提前1 d铺板。转染液配置：5 μL的lipo2000与无血清培养基混匀，静置5 min，随后再与2.5 μg含shRNA-血管内皮生长因子的表达质粒混匀与无血清培养基。再将转染液加入细胞培养体系，48 h换液。待细胞生存平稳后，选用G418筛选可稳定地表达血管内皮生长因子的细胞。10 d后，单个细胞克隆细胞数目大于50个时，终止培养以为后续实验及鉴定。其中shRNA-血管内皮生长因子的模板序列如下：

正义链：5'-GAC TGG ACC TGA GTT ACG TCA TTC AAT AAA VCT GAA GTT CCT TAC TAT ATG TCC TTT TTT G-3'；

反义链：5'-CTG ACT ATA AAG AAG CCA AGG AAG TTG TTC TCT CTT CAA GGA ATG ACG TAC ACG TGG CTC C-3'，过程中所使用的克隆载体是pGPU5/GFP/Neo (美国Santa Cruz公司)。

1.4.6 Western blot检测 一抗：GAPDH配置比例为1∶10 000，血管内皮生长因子为1∶200；二抗，GAPDH配置比例为1∶10 000、血管内皮生长因子为1∶5 000。检测3组细胞血管内皮生长因子及血管紧张素1的表达，及shRNA-血管内皮生长因子干扰后，4组细胞血管内皮生长因子表达。

1.5 主要观察指标 采用酶联免疫吸附法测定外周血清微循环血清标志物：前列环素(PGL2)、血管收缩因子内皮素1、血管紧张素Ⅱ、血管性血友病因子(vWF)的表达；增殖相关基因Ki67，p16；凋亡相关基因Bad，Bax；血管内皮生长因子及血管紧张素1的表达。

1.6 统计学分析 研究数值均用Graph Pad 6.0软件，不同组别间采用t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

急性脑损伤是威胁人类健康的重大凶手，特别是其血凝增高所致外周多系统并发症，极大的降低患病人群的生活质量及寿命。在急性脑损伤众多的并发症中，脑梗死的发生占全部并发症1/3^[7-9]。因此，寻找合理有效的干预措施，可逆性逆转脑梗死具有重要的社会医学价值。脑梗死主要由血栓形成所致脑细胞损伤及脑微循环低灌注两方因素共同造成。血凝失调，导致机体代谢紊乱，内分泌功能紊乱，机体血压升高，血流动力学紊乱，机体小血管功能失调，甚至损伤及破裂，最后引起微循环障碍。由于脑细胞生命活动的行使极大程度上依赖微循环血氧、营养素的供应及代谢产物的运出^[9-10]，因此，恢复脑微循环是改善脑细胞活力的重要因素。

由于机体脑功能的维持有赖于脑细胞活力与脑微循环的共同配合，而脑细胞活动的展开又依赖于微循环的畅通。已有研究显示C促红细胞生成素可显著提升心肌细胞活力，本文进一步探究是否C促红细胞生成素还可通过改善脑微循环以改善脑梗死大鼠预后。

近年研究提示，脑微循环功能与血栓及内皮损伤成负相关，即脑微循环功能血栓相关因子及血管内皮相关因子的表达显著相关。并且目前微循环功能评价(血管造影剂IMR评分的测定)相对繁琐。因此，研究采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了外周血清微循环血清标志物：前列环素(PGL2)、血管收缩因子内皮素1、血管紧张素II、血管性血友病因子(vWF)的表达情况。

血管内皮生长因子和血管生成素1是影响血管内皮细胞生物学特性的两重要细胞因子^[9]。在机体内，其具有广泛的生理作用，主要是促进血管再生及内皮的损伤与修复。有研究显示促红细胞生成素可通过影响内皮细胞血管内皮生长因子的表达，而促进内皮细胞的增殖^[10]。因此，作为促红细胞生成素的一衍生物，猜测是否C促红细胞生成素也可通过影响脑微循环内皮细胞内血管内皮生长因子和血管紧张素1的表达，进而促进内皮细胞的增殖，并改善脑梗死大鼠脑微循环的功能。

C促红细胞生成素是促红细胞生成素的一衍生物。具有促红细胞生成素相似的药代动力学、生理作用。然而，相对于促红细胞生成素，C促红细胞生成素可避免骨髓过度刺激所致循环血液高凝、血栓形成以及高血压等并发症。在脑梗死中，研究显示，C促红细胞生成素可有效改善脑梗死大鼠预后，起到脑细胞保护、改善脑细胞功能、抗脑组织纤维化、抑制炎症反应以及抗凋亡的作用^[11]。由于机体脑功能的维持有赖于脑细胞活力与脑微循环的共同配合。而脑细胞生理活动的展开又依赖于微循环的畅通^[12-13]。面对C促红细胞生成素可有效改善脑梗死大鼠脑能的实验现象^[4^，^14-15]，还未有报道显示C促红细胞生成素可显著改善脑微循环灌注。因此，研究聚焦脑梗死，以大鼠脑梗死为模型，通过生理、细胞分子生物学实验，发现C促红细胞生成素可通过上调血管内皮生长因子表达以促进脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖，以改善脑梗死大鼠脑微循环的功能。由于C促红细胞生成素对机体的效应的全身性，而特异性针对血管内皮生长因子靶向微循环内皮细胞，将有助于在干预脑梗死的同时，避免C促红细胞生成素的其他未知副作用^[15]。此外，研究发现血管内皮生长因子可显著影响脑微循环内皮细胞的增殖，结合脑梗死众多并发症基于微小血管病变的理论依据，作者大胆猜测，是否C促红细胞生成素还可通过血管内皮生长因子作用于其他微循环，譬如视网膜等。

总之，研究首次发现C促红细胞生成素可通过上调血管内皮生长因子表达以促进脑梗死大鼠脑微循环内皮细胞体外增殖，以改善脑梗死大鼠脑微循环的功能。初步解析了C促红细胞生成素影响脑梗死脑微循环的具体机制，为后续脑梗死的干预与预防提供了新型的理论指导及依据。

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