流动剪切力促小口径组织工程血管内皮化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (16): 2515-2520.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.010

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流动剪切力促小口径组织工程血管内皮化

张伟¹，宋爱晶²

¹冠昊生物科技股份有限公司，再生型医用植入器械国家工程实验室，广东省广州市 510530；²广东省体育科学研究所，广东省广州市 510663

修回日期:2017-05-05 出版日期:2017-06-08 发布日期:2017-07-06
通讯作者: 宋爱晶，博士，副研究员，广东省体育科学研究所，广东省广州市 510663
作者简介:张伟，男，1979年生，汉族，山东省济宁市人，2006年重庆大学毕业，硕士，中级工程师，主要从事组织工程与再生医学技术研究及产品开发。
基金资助:
广东省重大科技专项(2010A080407005)；国家重点研究计划生物医用材料研发与组织器官修复替代重点专项(2016YFC1103202)

Flow shear stress promotes the endothelialization of small diameter tissue-engineered vessels

Zhang Wei¹, Song Ai-jing²

¹Guanhao Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative and Implantable Medical Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China; ²Guangdong Provincial Institute of Sport Science, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China

Revised:2017-05-05 Online:2017-06-08 Published:2017-07-06
Contact: Song Ai-jing, Ph.D., Associate researcher, Guangdong Provincial Institute of Sport Science, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China
About author:Zhang Wei, Master, Intermediate engineer, Guanhao Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative and Implantable Medical Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China
Supported by:
the Major Science and Technology Project of Guangdong Province, No. 2010A080407005; the Major Project of National Key Research Plan for the Biomedical Materials Research and Tissues/Organs Repair, Replacement, No. 2016YFC1103202

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
流动剪切力：主要是指血流作用于血管壁单位面积的力，也称为剪切力。文章中模拟血流剪切力的特点，构建了回流型的液体剪切力体外加载模型。为了更好地研究剪切力的作用方式，文章选取了单一形式和梯度增加的2种加载方式，施加人体生理范围内的剪切力，从而可以验证出效果更好的流动剪切力加载方式。
血管内皮化：是指将血管细胞种植在血管内壁后，为提高血管内皮细胞层完整性的处理过程。小口径的组织工程血管植入宿主体内后容易出现内皮细胞层脱落等现象，为了提高内皮细胞层的完整性，必须在构建组织血管时对内皮细胞层进行适当地处理，比如动态种植种子细胞、在血管内壁上加入黏附介质、在构建系统中进行力学驯化等。

摘要
背景：细胞内皮化的流动剪切力大小和作用方式是小口径组织工程血管的构建中的关键问题。小口径组织工程血管构建后的抗血流冲击能力是决定移植成功的关键因素之一，较多人把研究重点集中在如何制作移植血管支架材料，如何提高宿主细胞种植后其血管内壁的抗凝效果，而对细胞内皮层的力学驯化则关注较少，该方法有可能是提高组织工程血管移植成功率的有效手段之一。
目的：比较单一水平和成梯度增加的流动剪切力对组织工程血管内皮化的影响，获得适用于组织工程血管内皮化的剪切力大小和加载方式。
方法：采用血管铺片硝酸银染色法和内皮细胞肌动蛋白荧光标记法，观察组织工程血管内壁上内皮细胞的数量、形状和黏附性能等变化情况。
结果与结论：经2.5和3.0 N/m²剪切力作用2 h后，血管内壁上的内皮细胞几乎全部脱落；而经0.5-3.0 N/m²，每2 h增加0.2 N/m²的成梯度增加的剪切力作用后，血管内皮细胞层保持较完整，细胞形态成明显的轴向排列，且能诱导内皮细胞中应力纤维的出现。说明成梯度增加的流动剪切力这种“驯化”方式，能较好地促进小口径组织工程血管的内皮化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-9519-0673(宋爱晶)

关键词: 组织构建, 组织工程, 流动剪切力, 小口径组织工程血管, 内皮化, 单一水平, 成梯度增加, 内皮细胞, 黏附性能, 应力纤维

Abstract:

BACKGROUND: Magnitude and action ways of flow shear stress are important for the endothelialization of small diameter tissue-engineered vessels (TEV), and the TEV resistance ability to blood flow even decides the destiny of implantation. There are many studies on how to construct the TEV and improve anticoagulant ability of TEV after host cell implantation, but the effects of different flow shear stresses on the TEV endothelialization is rarely reported, which may be helpful for increasing the success rate of TEV implantation.
OBJECTIVE: To compare the effects of flow shear stresses in single level or stepwise increased on the endothelialization of small diameter TEV and to optimize the TEV in the aspects of shear stress magnitude and loading method.
METHODS: The number, morphology and adhesion ability of endothelial cells on the inner wall of TEV were observed through silver nitrate and F-actin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Single-level shear stress at 2.5, 3.0 N/m² for 2 hours removed almost all the endothelial cells seeded on the inner wall of TEV. In contrast, stepwise increased shear stress from 0.5 N/m² to 3.0 N/m2 at an increase of 0.2 N/m²/2 hours maintained the integrity and oriented along the flow direction, and could induce stress fibers productionin endothelial cells. These results suggest that the stepwise increased flow shear stress can improve the endothelialization of TEV.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Endothelial Cells, Biomechanics, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张伟，宋爱晶. 流动剪切力促小口径组织工程血管内皮化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2515-2520.

Zhang Wei, Song Ai-jing. Flow shear stress promotes the endothelialization of small diameter tissue-engineered vessels [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2515-2520.

图/表（结果） 1

2.1 大鼠颈总动脉的形态 硝酸银染色法和F-actin荧光标记染色结果显示，大鼠颈动脉血管内壁上无血管内皮细胞，但血管结构保留完整(图2)。

2.2 脱细胞大鼠颈总动脉的内皮化 硝酸银染色和血管内皮细胞 F-actin荧光标记结果表明，血管内皮细胞已完全覆盖血管内壁表面，生长状态良好，并融合成细胞单层；细胞呈椭圆形，细胞间连接紧密；细胞膜周边出现F-actin(图3)。

2.3 流动剪切力对组织工程血管内皮化的作用

2.3.1 单一水平的流动剪切力 硝酸银染色结果表明，0.5 N/m²作用24 h，细胞无明显变化；1.0 N/m²作用24 h，部分细胞变得紧缩，有少许细胞脱落；1.5，2.0 N/m²作用2 h，部分细胞呈梭形，局部有细胞脱落；2.5 N/m²作用2 h，细胞形态呈明显的梭形，细胞的长轴与液体流动方向一致，细胞脱落较多，细胞膜受到不同程度的损伤；3.0 N/m²作用2 h，细胞几乎全部脱落，仅存的个别细胞形态为椭圆形，可清晰看到血管壁内弹性层(图4)。

荧光染色结果显示，0.5 N/m²作用24 h，微丝主要分布在细胞膜的周边；1.0 N/m²作用24 h，细胞膜周边微丝减少，核周边微丝数量增多；1.5，2.0 N/m²作用2 h，核周微丝逐渐增多；2.5 N/m²作用2 h，微丝主要分布在核周边，能清晰看到应力纤维；3.0 N/m²作用2 h，细胞几乎全部脱落，观察不到微丝的存在(图4)。

2.3.2 成梯度增加的流动剪切力 硝酸银染色结果表明，经0.5-1.5 N/m²成梯度增加的剪切力作用后，多数细胞保持原状，极少细胞脱落；0.5-2.0 N/m²成梯度增加的剪切力作用后，部分细胞变为梭形，细胞长轴与液流方向一致；细胞间连接紧密，无细胞脱落；0.5-2.5 N/m²成梯度增加的剪切力作用后，多数细胞变为梭形，有明显的轴向排列；细胞间连接紧密，极少数细胞脱落；0.5-3.0 N/m²成梯度作用后，细胞呈梭形，沿液流方向被拉长，有明显的轴向排列，内皮细胞层较为完整(图5)。

荧光染色结果显示，经0.5-1.5 N/m²成梯度增加的剪切力作用后，微丝主要分布在膜周边；0.5-2.0 N/m²成梯度增加的剪切力作用后，部分细胞变为梭形，细胞长轴与液流方向一致，细胞间连接紧密；核周边微丝明显增多；0.5-2.5 N/m²成梯度增加的剪切力作用后，细胞多为梭形，有明显的轴向排列；微丝主要集中在核周边，有应力纤维的出现；0.5-3.0 N/m²成梯度作用后，细胞有明显的轴向排列，微丝主要分布在核周边，有应力纤维的出现(图5)。

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引言

心血管疾病是当前发病率最高的疾病之一，也是占主导地位的死亡疾病^[1]，其中动脉瘤、动脉狭窄、动脉栓塞、或血管破裂患者均需要进行人工血管移植术^[2]。目前临床上常用到的血管移植物主要包括自体血管^[3]、人工血管^[4]、组织工程化血管等^[5-7]，自体血管会对患者造成二次创伤，人工血管效果不佳且只限于大口径血管(≥ 6 mm)，组织工程化血管由于其良好的通畅效果已成为当前研究的热点^[8-10]。

大口径人工血管在临床应用已经非常成熟，产品性能比较稳定，但人工血管无法在小口径血管(< 6 mm)方面取得突破，最根本原因是小血管血流速率变缓、血液流动剪切力更为复杂，人工血管植入后血管吻合口容易发生血栓并伴内膜增生，血管的远期通畅率不理想^[11-13]。组织工程化血管是指利用组织工程技术，选择优异的血管支架材料，利用宿主自体的血管内皮细胞，辅助体外处理技术，加工而成的新型血管移植物^[14]。研究结果表明，该类血管植入受体后可明显提高血管的通畅时间，但同时也存在着血管吻合口血液凝集和内膜增生等问题^[15-16]。国内外同行的研究发现，对于小口径血管移植物而言，成功的血管内皮化只是构建血管移植物的先决条件之一，而植入体内后如何在一定时间内保持内皮细胞层的完整性则是防止血栓形成的关键^[17-19]，也是小口径组织工程化血管成功用于临床的关键问题所在。如何保持组织工程血管内皮细胞层的完整性，主要集中在种子细胞的接种效率^[20]、血管内壁表面改性^[21-25]、血管内皮细胞层的力学驯化等^[26-28]。

有关血管内皮细胞层的力学驯化研究不多，多是进行短时间或个别切应力的研究，进行长时间或较大范围剪切力作用的研究较少^[29-32]。作者专注于血管内皮层的力学驯化，设计了封闭的力学加载系统，较好地模拟了体内血液循环系统，研究了单一形式和成梯度增加的2种流动剪切力的作用方式，并在加载时间上进行了合理的设计，期望进一步丰富组织工程化血管研究方法，找到一种能有效提升血管内皮细胞层抗血流冲击力的方法，早日实现小口径组织工程血管的临床应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月到2016年2月在冠昊生物公司细胞实验室完成。

1.3 材料

实验细胞：人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)购于上海细胞所。

实验动物： SPF级Wistar大鼠30只，雌雄不限，鼠龄15-20周，体质量(150±15) g，购自广东省动物医学实验中心，许可证号：SCXK(粤)：2008-0002。

主要试剂及仪器：DMEM胎牛血清购自美国Gibco公司，0.25% AgNO₃购自上海化学试剂公司，4%多聚甲醛溶液购自天津市光复精细化工研究所，0.5% TritonX-100溶液购自美国Amresco公司，罗丹明-鬼笔环肽购自美国Invitrogen公司，硅胶管Ø4 mm、2 mm购自济南医用硅橡胶制品厂，蠕动泵BT00-100M购自保定兰格恒流泵有限公司，倒置荧光显微镜IX71购自日本Olympus公司，三气细胞培养箱6220购自德国Heraeus公司，显微镊、显微剪购自上海医疗器械有限公司手术器械厂。

1.4 方法

1.4.1 血管支架材料的制备与鉴定 无菌条件下，使用3%戊巴比妥按1.5-2.0 mL/kg麻醉Wistar大鼠，小心取出大鼠双侧颈总动脉血管，将血管迅速浸入无菌生理盐水中漂洗，以含10%二甲亚砜的DMEM培养液4 ℃培养15 min，-20 ℃冻存24 h，液氮保存。

复苏血管时，将冻存管从液氮中取出置于37 ℃的水浴中融化30-60 s；无菌条件下取出大鼠颈总动脉血管，用PBS溶液冲洗血管内腔数次，以除去残留在血管壁上的内皮细胞^[33]。之后，采用血管铺片硝酸银染色法和血管内皮细胞 F-actin荧光标记法，对脱细胞处理后的大鼠颈总动脉血管进行染色，确保无活细胞的存在。如此制得的脱细胞大鼠颈总动脉作为小口径组织工程血管的支架材料。

1.4.2 种子细胞的制备 将ECV-304以PBS清洗，0.25%胰酶消化，1 500 r/min离心5 min，以含体积分数胎牛血清的DMEM培养液重悬，调整细胞浓度为5×10⁸L^-1，备用。

1.4.3 组织工程血管的内皮化 将制得的脱细胞大鼠颈总动脉放入自制的血管流动培养腔中(图1A)，将ECV-304悬液吹打均匀，慢慢吸入注射器内，将注射器内的细胞悬液从血管的一端轻轻注入，待另一端流出细胞悬液为止。将装有血管的流动腔置入三气培养箱中，每隔15 min转动血管90°，持续2 h。血管静置培养3 d，期间更换一次培养皿中的细胞培养液。采用硝酸银染色和血管内皮细胞 F-actin荧光标记法对细胞内皮化的血管进行染色观察结果^[34]。

硝酸银染色：将去血管内皮细胞的血管置于培养皿中，少许PBS缓慢灌冲血管内腔数次；硝酸银溶液缓慢灌冲血管内腔约10 s，然后放入蒸馏水中浸泡片刻；用显微剪剖开血管，放入盛有甲醛的密闭瓶中固定30 min；将血管取出，放入盛有0.25 mol/L的NaOH溶液的密闭瓶中作用5 s，之后立即取出；蒸馏水漂洗，梯度乙醇脱水，去血管的外膜和部分中膜；二甲苯透明；中性树胶封固；倒置相差显微镜观察。

F-actin荧光标记：将去血管内皮细胞的血管置于培养皿中，少许PBS缓慢灌冲血管内腔数次；用显微剪轻轻剖开血管，然后放入盛有40 g/L多聚甲醛溶液的密闭瓶中固定10 min；PBS漂洗；放入盛有0.5% Triton X-100溶液的密闭瓶中孵育20 min(进行膜打孔)；PBS漂洗；血管内膜向上铺平固定，滴加一定量的罗丹明-鬼笔环肽溶液于血管，孵育1 h；PBS漂洗；将铺片内腔面向上置于载玻片上，整理铺平后，滴加1∶1 PBS/甘油溶液封固；倒置荧光显微镜观察。

1.4.4 流动剪切力加载

单一水平的流动剪切力：将种植血管内皮细胞后的组织工程化血管置入自制的血管应力培养装置中(图1B)，施加单一水平的流动剪切力对血管内壁上的血管内皮细胞进行力学“驯化”。流动剪切力大小和作用时间分别为：0.5，1 N/m²的剪切力加载24 h，1.5，2.0，2.5，3.0 N/m²的剪切力均加载2 h。

成梯度增加的流动剪切力：从0.5 N/m²开始加载，每作用2 h增加0.2 N/m²的剪切力，分别到1.5，2.0，2.5，3.0 N/m²时，再作用2 h，结束加载。

1.5 主要观察指标 ①剪切力作用后，血管内壁上血管内皮细胞数量、形态变化以及血管内皮细胞间有无连接；②剪切力作用后，血管内壁上血管内皮细胞微丝分布，以及有无应力纤维出现。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

目前，临床上对小口径血管移植物颇为急需，已经用于临床使用的有自体血管(动脉或静脉)、同种异体血管、人工血管、组织工程血管等，但至今仍没有较为理想的移植物可以用于临床使用^[35]。组织工程血管被认为是最有可能应用于临床的小口径血管移植物，其主要由血管支架、受体细胞、生长因子等组成^[36]，小口径血管移植物是组织工程方法和再生医学技术相结合设计而成的，植入人体后能较好替代较长距离的病变血管并能保持长时间的通畅^[37]。虽然组织工程血管在动物实验或临床使用中也存在小口径血管移植物常见的血栓形成和内膜增生等问题^{[5, 15-16, 38]}，但其临床使用前景仍被看好。当前的研究多集中组织工程血管支架材料的筛选、种子细胞的扩增、力学“驯化”等方面^[39-40]。

除了提高血管内表面对种子细胞的黏附性能之外^[41]，对种植于血管内的种子细胞进行力学“驯化”是另一种可行且有效的方法。细胞骨架中对流动剪切力起响应的主要结构是微丝。叶志义等^[34]通过实验证明，成梯度增加的流体剪切力比单一形式的剪切力能更好地改变内皮细胞的形态结构，其黏附能力明显增加，内皮细胞的保留率也明显提高。该实验结果提示，相对于单一水平的流动剪切力，使用成梯度增加(0.5- 3.0 N/m²，0.2 N/m²/2 h)的流动剪切力“驯化”方式，可使内皮细胞提前适应体内血流的冲击并作出相应的结构变化，从而提高其在血管基质材料上的黏附性能，即抵抗正常血流冲击的能力将会得到较大提高，植入体内后有望降低血栓和内膜增生的发生率，提高小口径血管移植物的远期通畅率。综上所述，成梯度增加的流动剪切力加载方式为提高组织工程血管的内皮化提供了新的方法参考。

2007年11月中国第一个组织工程产品——组织工程皮肤获准上市^[42]，为组织工程的发展和产业化前景指明了方向。近些年，随着国内外材料科学、组织工程学、工程设计等学科的发展，组织工程化血管的设计、临床应用均取得了可喜的进展，比如静电纺丝、3D打印方法等可以制造出性能更为优越的血管支架^[43-45]，异种脱细胞基质材料、同种异体血管等材料也应用了临床^[5^，^46-48]，体外培养方法的优化和创新^[49]，并取得了不错的临床效果。这些成绩的取得预示着组织工程产品的研究和产业化将迎来新的发展契机。本研究结合组织工程和再生医学的技术和方法，为今后小口径组织工程血管的产业化提供了方法和技术路线参考，以经过脱细胞、除抗原等方法处理后的动物血管为血管支架材料，将受体的血管内皮细胞或内皮前体细胞为种子细胞，经过体外扩增、接种、力学“驯化”等方法完成血管的内皮化，然后应用于临床的血管移植手术中^[50]。通过组织工程、再生医学及临床领域的专家、学者和技术人员的不断努力，小口径组织工程化血管产品的上市推广将很快实现。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

流动剪切力促小口径组织工程血管内皮化

Flow shear stress promotes the endothelialization of small diameter tissue-engineered vessels

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