不同强度冲击波对牙槽骨细胞成骨能力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (16): 2509-2514.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.009

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不同强度冲击波对牙槽骨细胞成骨能力的影响

郭元¹，张弛²，刘松²，王钊²，潘兴飞³，王簕²

广州医科大学附属第三医院，¹口腔科，²骨科，³感染科，广东省广州市 510150

修回日期:2017-03-10 出版日期:2017-06-08 发布日期:2017-07-06
通讯作者: 王簕，博士，副主任医师，广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150
作者简介:郭元，女，1980年生，上海市人，汉族，2011年广州医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨修复方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31570980)；广东省公益研究与能力建设项目(2014A020212347)；广州市属高校科研项目(1201430092)

Influence of different intensities of extracorporeal shock waves on the osteogenesis ability of alveolar osteoblasts

Guo Yuan¹, Zhang Chi², Liu Song², Wang Zhao², Pan Xing-fei³, Wang Le²

¹Department of Stomatology, ²Department of Orthopedics, ³Department of Infectious Diseases, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Revised:2017-03-10 Online:2017-06-08 Published:2017-07-06
Contact: Wang Le, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Guo Yuan, Master, Attending physician, Department of Stomatology, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31570980; the Public Research and Construction Project of Guangdong Province, No. 2014A020212347; the Scientific Research Project of Universities in Guangzhou, No. 1201430092

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞增殖的检测：细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，细胞是以分裂的方式进行增殖。CCK-8试剂中含有WST-8，它在1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此，可间接反映活细胞数量。
成骨分化：成骨样细胞可在特定条件下，比如成骨培养基，力学刺激，冲击波作用等条件下向成熟的成骨细胞转化，该过程可表现为细胞分泌合成成骨细胞成熟过程中所合成的部分标志物，如碱性磷酸酶，骨形态发生蛋白等。

摘要
背景：许多口腔炎性疾病可引起牙槽骨丢失，牙齿松动，影响咬合关系。体外冲击波技术有望改善牙槽骨修复，提高牙槽骨细胞成骨活性，但是目前体外冲击波技术对牙槽骨细胞的作用效果及机制仍不明确，有必要进一步阐明。
目的：比较不同强度冲击波对大鼠牙槽骨细胞增殖能力和成骨分化的影响。
方法：通过原代培养获取大鼠牙槽骨细胞，进行体外分离培养，通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。分别用强度为0.18、0.36、0.50 mJ/mm2的冲击波作用于大鼠牙槽骨细胞，作用频次均为100次。
结果与结论：当选用强度为0.18和0.36 mJ/mm²冲击波作用后，牙槽骨细胞碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白2的分泌量明显增加，并且冲击波强度越高，分泌量越大(P < 0.05)。当冲击波作用强度为0.50 mJ/mm²时，大鼠牙槽骨细胞增殖能力明显减退，碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白2的分泌量显著下降(P < 0.05)。提示当冲击波作用强度低于0.36 mJ/mm²时，随着作用强度的增加，可提高牙槽骨细胞的成骨能力，这为临床应用冲击波促进牙槽骨修复提供了理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-6465-8579(王簕)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 冲击波, 牙槽骨细胞, 成骨, 碱性磷酸酶, 骨形态发生蛋白2, 骨修复, 细胞增殖, 细胞分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Oral inflammatory diseases usually cause alveolar bone loss and odontoseisis, and further impact dental occlusion. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) is a promising method for the repair of alveolar bone and improving osteogenic activity of alveolar osteoblasts, but its therapeutic efficacy and related mechanisms remain unclear.

OBJECTIVE: To compare the effect of different intensities of ESWT on the proliferation and osteogenesis abilities of rat alveolar osteoblasts.

METHODS: The rat alveolar osteoblasts were obtained and cultured in vitro, and further identified by alkaline phosphatase staining. 0.18, 0.36, and 0.50 mJ/mm² ESWT was used to stimulate the rat alveolar osteoblasts, 100 pulses, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: The levels of alkaline phosphatase and bone morphogenetic protein 2 were significantly increased in the 0.36 and 0.18 mJ/mm² ESWT groups, especially in the 0.36 mJ/mm² ESWT group (P < 0.05). 0.50 mJ/mm² ESWT significantly decreased the proliferation ability of rat alveolar osteoblasts and downregulated the levels of alkaline phosphatase and bone morphogenetic protein 2 (P < 0.05). To conclude, ESWT (< 0.36 mJ/mm²) can improve the osteogenesis ability of rat alveolar osteoblasts with the intensity increasing, which provides a theoretical basis for the clinical use of ESWT in the alveolar bone repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: High-Energy Shock Waves, Cell proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郭元，张弛，刘松，王钊，潘兴飞，王簕. 不同强度冲击波对牙槽骨细胞成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2509-2514.

Guo Yuan, Zhang Chi, Liu Song, Wang Zhao, Pan Xing-fei, Wang Le. Influence of different intensities of extracorporeal shock waves on the osteogenesis ability of alveolar osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2509-2514.

图/表（结果） 1

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引言

由于创伤、肿瘤切除、感染等各种原因造成的骨缺损一直是威胁人类生命健康的医学难题。如何从根本上提高其治疗效果一直是临床治疗的难点。近年来，随着组织工程学在这一领域的长足进步，骨缺损的治愈不再遥远。组织工程技术的出现不但为研究骨组织修复和再生提供了新的课题与思路，而且为临床治疗提供了全新的技术和方法。

体外冲击波疗法是20世纪80年代末出现的一项新技术，该技术在碎石治疗方面取得了巨大成功，从根本上改变了泌尿系结石病的治疗，但是冲击波在医学领域中的应用不仅仅局限于泌尿外科^[1-2]。

近年来，研究发现体外冲击波疗法能够促进骨折的修复，考虑其可能通过物理刺激引起骨折区血供的改善，提高局部促血管内皮生长因子的表达，促进新生血管张入，促进成骨细胞增殖、分化，但是确切作用机制目前仍未阐明，而且成骨活性的提高是目前骨修复研究的重点，因此体外冲击波对成骨的相关作用机制是目前研究的热点所在^[3-4]。在传统骨折修复手术的基础上，体外冲击波疗法对患者的创伤小、风险较低、费用低，且治疗的周期较短^[5]，因此，该技术可作为目前治疗方案的有效补充，也可以预见到体外冲击波疗法在口腔骨修复中的有重要的应用前景。

随着对骨缺损发生的病理生理学机制以及组织工程研究的不断深入，众多学者认识到无论是对于临床常规治疗还是骨组织工程研究而言，除了提供丰富、充足的移植骨来源，更重要的是保证移植骨的生物学功能、保持移植物及修复区域内环境的生物学稳定性，这样才能促进骨修复。作者前期研究发现，不同强度冲击波对骨修复有不同的作用效果，而且各研究报道的强度不完全一致^[6-7]。同时，牙槽骨细胞是维持牙齿强度和牙周组织完整性的重要靶细胞^[8]，因此，作者拟通过比较不同强度体外冲击波疗法对大鼠牙槽骨细胞的作用，观察其成骨能力的改变，找寻体外冲击波疗法促进牙槽骨细胞成骨的最佳强度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞水平随机对照研究。

1.2 时间及地点 实验于2015年9月至2016年9月在广州医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：健康成年SD大鼠10只，鼠龄为4-6周，体质量200-250 g，由广东省医学实验动物中心提供。实验动物设施使用许可证号：SCXK(粤) 2013-0002。实验过程中对实验动物的各项处置符合动物伦理学要求。

仪器和设备：液电冲击波发生器(ESWO-AJ)购自深圳市慧康医疗器械有限公司；CCK-8检测液、碱性磷酸酶试剂盒、骨形态发生蛋白2 ELISA试剂盒购自碧云天公司；DMEM培养液购自美国Gibco公司；倒置显微镜购自Olympus公司；酶标仪购自Thermo公司。

1.4 方法

1.4.1 大鼠牙槽骨细胞的提取和培养 采用组织块贴壁法获取大鼠的牙槽骨细胞^[9]。即大鼠用35 mL/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后颈椎脱臼法处死，仰卧位固定于手术台上，按照无菌原则消毒大鼠口腔及口腔外部，沿颈部正中线切开，上方直至口腔，完整暴露整个下颌骨区，无菌取出带有肌肉的下颌骨，完整刮去附着其上的软组织及粘膜，拔除牙齿，将下颌骨用咬骨钳剪成约2 mm×2 mm碎骨片。用含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液在 37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养。3 d后换液去除悬浮未贴壁细胞和组织块，此后每3 d换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。细胞密度达到80%-85%时，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。取第3代细胞用于后续研究。

1.4.2 牙槽骨细胞的碱性磷酸酶染色定性分析 通过细胞计数板计数后，将第3代牙槽骨细胞以密度为5×10⁴/孔接种于24孔板中，每孔加入1 mL DMEM培养液，待细胞密度达到80%时，每孔用40 g/L多聚甲醛固定30 min，根据试剂盒说明书配制染色工作液，每孔加入2 mL染色工作液，室温避光孵育30 min后，终止显色反应，显微镜下观察拍照。

1.4.3 体外冲击波疗法刺激牙槽骨细胞 待第3代牙槽骨细胞培养瓶中生长至密度为80%时，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液并调整细胞浓度为1.5×10⁸L^-1，各取4 mL细胞悬液接种于5 mL EP管中，封闭管口，置于液电冲击波发生器焦点处，以无体外冲击波疗法作用的细胞作为对照组，分别用强度为0.18、0.36、0.50 mJ/mm² 体外冲击波疗法作用于细胞(0.18、0.36、0.50 mJ/mm²体外冲击波疗法组)，频次均为100次。

1.4.4 CCK-8法检测体外冲击波疗法刺激后牙槽骨细胞的增殖 取上述经不同强度冲击波作用后的牙槽骨细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，于培养后12，24，48 h，每孔分别加入CCK-8检测液，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下继续培养3 h后，置于酶标仪中，波长设定为450 nm处检测各孔的吸光度值。以无体外冲击波疗法作用的细胞作为对照，计算相对增殖率。

1.4.5 体外冲击波疗法刺激后牙槽骨细胞碱性磷酸酶分泌量的检测 取上述经不同强度冲击波作用后的牙槽骨细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，于培养后6，12，24 h，收集上清液，根据试剂盒说明书操作，各孔加入碱性磷酸酶显色剂，轻轻混匀，于酶标仪下波长520 nm处测定各孔的吸光度值，根据公式换算得出上清液中碱性磷酸酶浓度，单位为U/100 mL。

1.4.6 体外冲击波疗法刺激后牙槽骨细胞骨形态发生蛋白2分泌量的检测 取上述经不同强度冲击波作用后的牙槽骨细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，于培养后6，12，24 h，收集上清液，根据骨形态发生蛋白2 ELISA试剂盒说明书操作，各孔加入显色剂，轻轻混匀，终止显色后，于酶标仪下波长450 nm处测定各孔的吸光度值，根据公式换算得出上清中骨形态发生蛋白2质量浓度，单位为μg/L。

1.5 主要观察指标 ①牙槽骨细胞的增殖活性；②细胞上清中碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白2的分泌量。

1.6 统计学分析 所有数据采用SPSS 17.0软件处理。数据采用x(_)±s表示，各体外冲击波作用后组间和时间点间的比较采用方差分析，进一步采用LSD法进行两两比较，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

牙槽骨是上、下颌骨包绕和支撑牙根的部分，是人体骨组织中代谢最活跃的组织之一。它随着牙的生长发育、脱落替换、咀嚼压力的变化而变动。牙槽骨的健康影响了口颌系统的功能和稳定^[10]。牙槽骨细胞的活性、成骨分化能力对于维持正常咬合关系的至关重要，在许多慢性口腔炎症性疾病中，后期可出现牙槽骨的吸收，造成呀的支持组织丧失，松动，移位，最终脱落。如何预防或有效改善牙槽骨细胞活性，对于口腔相关疾病的治疗具有重要的指导意义，这也是目前口腔疾病治疗的研究热点之一^[11-12]。

体外冲击波疗法是近年来一项可用于骨修复治疗的新技术，该技术在预防牙槽骨丢失，促进牙槽骨再生方面有重要的应用价值和前景^[13]。体外冲击波疗法是一种脉冲声波，具有短时性、高压强性及宽频性的特点，能在几纳秒中迅速达到压力最大值，产生正向压力波和空化反应，这个反应对焦点的物体有很强的作用力，这是冲击波特有的特征，在压力计较变化的情况下，冲击波会带有很强的压应力和张应力，通过声能的方式可以穿过任何弹性的介质^[14]。冲击波按照震波源的不同可以分为电磁式冲击波、压电式冲击波及液体内放电冲击波3种，但是压电式和电磁式冲击波正压力波上升的速度比较慢，可传送的能量也比较低，而液体内放电冲击波产生的能量很大，正向压力波上升的速度非常快，所以在临床上使用比较广泛^[15-16]。在过去，人们为了检验体外冲击波治疗结石的安全性，率先研究的是冲击波对动物骨的影响，结果意外的发现了冲击波可以促进成骨。随着科学技术和医疗水平的不断进步，人们对冲击波的物理学特点及对组织的影响不断的深入，开始利用冲击波可穿透细胞膜的特性，进行肿瘤化疗、基因治疗以及骨科、口腔科疾病治疗。与传统的手术相比，体外冲击波疗法对患者的身体创伤更小，且疗效确实，疗程较短，降低患者的经济负担的优势^[17]。

虽然体外冲击波疗法可以促进骨折愈合，但是其在牙槽骨细胞的作用及其影响目前仍不明确^[18-23]。实验发现，经体外冲击波疗法刺激后，牙槽骨细胞的增殖能力可明显提高，但是当体外冲击波疗法作用强度超过0.50 mJ/mm²时，则这种激活机制不但不能维持，而且呈现抑制效应。Tamma等^[24]也发现同样现象，考虑这是由于当体外冲击波疗法作用强度过大时，可能大致大量靶细胞凋亡，因此，剩余的细胞不能维持足够的活力。当体外冲击波疗法作用强度控制在0.36 mJ/mm²时，大鼠牙槽骨细胞增殖能力激活，这可能是由于低强度的体外冲击波疗法可导致活力不佳的细胞凋亡，剩余足够量活力明显的细胞呈现出较强的增殖能力。

同时，实验还发现当应用作用强度为0.36 mJ/mm²体外冲击波疗法时，可显著促进牙槽骨细胞分泌碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白2，这2种细胞因子均可用于反映细胞的成骨活性。碱性磷酸酶可用于反映成骨样细胞的成熟情况^[25]，而骨形态发生蛋白2具有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨能力的一种分泌蛋白^[26]。因此，提示该强度的体外冲击波疗法可通过刺激牙槽骨细胞分泌促成骨相关蛋白而促进成骨能力的提升，从而揭示了体外冲击波疗法促骨修复的机制。相关研究也认为，液电式冲击波发生装置可以使处在焦点细胞组产生空化效应，且同时还具有机械波压力效应与压电效应，正是这种低频体外冲击波疗法通过物理刺激效应，促进了细胞的成骨活性^[27-52]。

综上所述，体外冲击波疗法可促进牙槽骨细胞的成骨活性，但是在应用时需选择合适的作用强度，作者认为当体外冲击波疗法作用强度控制在0.36 mJ/mm²以下时，随着作用强度的上升，牙槽骨细胞增殖能力和成骨活性明显激活，当强度超过0.50 mJ/mm²时，则出现抑制现象，即体外冲击波疗法在治疗中呈现双向性，在选择合适治疗方案时，需结合临床实际应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

不同强度冲击波对牙槽骨细胞成骨能力的影响

Influence of different intensities of extracorporeal shock waves on the osteogenesis ability of alveolar osteoblasts

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