内质网应激对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (16): 2502-2508.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.008

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内质网应激对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞的影响

吴浩，孟志超，曹永平，潘利平，周星彤，杨昕，刘恒，王瑞，崔云鹏，李翔，李卓扬

北京大学第一医院，北京市 100034

修回日期:2017-04-19 出版日期:2017-06-08 发布日期:2017-07-06
通讯作者: 曹永平，博士，主任医师，教授，北京大学第一医院，北京市 100034
作者简介:吴浩，男，汉族，2016年北京大学医学部毕业，博士，医师，主要从事骨关节领域研究。并列第一作者：孟志超，汉族，2011年北京大学医学部毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节领域研究。
基金资助:
北京市自然科学基金青年基金项目(7144252)

Effect of endoplasmic reticulum stress on chondrocytes in a rat model of knee osteoarthritis

Wu Hao, Meng Zhi-chao, Cao Yong-ping, Pan Li-ping, Zhou Xing-tong, Yang Xin, Liu Heng, Wang Rui, Cui Yun-peng, Li Xiang, Li Zhuo-yang

Peking University First Hospital, Beijing 100034, China

Revised:2017-04-19 Online:2017-06-08 Published:2017-07-06
Contact: Cao Yong-ping, M.D., Chief physician, Professor, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China
About author:Wu Hao, M.D., Physician, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China Meng Zhi-chao, M.D., Attending physician, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China Wu Hao and Meng Zhi-chao contributed equally to this work.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Beijing for the Youth, No. 7144252

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
内质网应激反应：内质网应激是指由于各种原因使得细胞内质网发生功能紊乱, 导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的病理状态。为缓解这种状态，使内质网功能恢复正常，细胞内发生的一系列反应被称为内质网应激反应，也称作未折叠蛋白反应
骨关节炎：骨关节病是一类由多种因素引起的、以关节软骨降解、软骨下骨改变为主要病理特征的关节退行性疾病。普遍认为，软骨细胞功能受损和凋亡在退行性骨关节炎发生发展中起着重要作用。

摘要
背景：研究认为，内质网应激与糖尿病、扩张性心肌病、神经退行性疾病等许多慢性疾病的发生相关，而它与骨关节炎的发生也密切相关。
目的：分析内质网应激对大鼠关节软骨细胞生存状态的影响，以及内质网应激在体内对大鼠骨关节炎发生发展的影响。
方法：在体外分离培养大鼠关节软骨细胞，应用10 mg/L衣霉素建立内质网应激模型。Western Blot检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白的表达，并分别应用CCK-8和AnnexinV-FITC(流式法)检测软骨细胞增殖活性及细胞凋亡情况。体内实验选取SD大鼠15只，行前交叉韧带切断、内侧半月板切除术制作膝关节骨关节炎模型，于关节腔分别注射内质网应激激动剂衣霉素、抑制剂牛磺熊去氧胆酸和空白对照PBS，4周后应用苏木精-伊红染色评估各组关节退变情况。
结果与结论：①应用衣霉素刺激大鼠关节软骨细胞后，葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白的表达均显著升高；同时，软骨细胞的细胞增殖活性在衣霉素刺激后逐渐下降，而细胞凋亡率则明显升高；②在大鼠骨关节炎模型中，大体标本及苏木精-伊红染色结果均显示，关节腔注射衣霉素组骨关节炎进展加速，而关节腔注射牛磺熊去氧胆酸组骨关节炎进展减慢；③结论：内质网应激的过度激活导致体外培养的大鼠关节软骨细胞增殖活性降低及细胞凋亡增加，这可能是导致骨关节炎发生发展的重要机制之一；应用内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸可以有效地减少内质网应激导致的骨关节炎的进展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-4165-6367(孟志超)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 内质网应激, 骨关节炎, 凋亡, 衣霉素, 牛磺熊去氧胆酸, 体外实验, 体内实验, 北京市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Endoplasmic reticulum (ER) stress has been proved to be related to the occurrence of diabetes, dilated cardiomyopathy and neurodegenerative diseases. Indeed, it is closely associated with osteoarthritis.
OBJECTIVE: To explore the effect of ER stress on the chondrocyte viability as well as the occurrence and development of osteoarthritis in rats.
METHODS: Rat chondrocytes were isolated and cultured, and the ER stress in the rat chondrocytes was by 10 mg/L tunicamycin. The expression levels of ER stress markers C/EBP-homologous protein and 78 kDa glucose-regulated protein were detected by western blot assay, and the proliferation and apoptosis of chondrocytes were detected by cell counting kit-8 assay and AnnexinV-FITC flow cytometry, respectively. In the in vivo experiment, 15 Sprague-Dawley rats were selected and subjected to anterior cruciate ligament transection and medial meniscectomy to establish an animal model of osteoarthritis. Tunicamycin, tauroursodeoxycholic acid and PBS (blank control group) were respectively injected into the articular cavity, and then the progression of osteoarthritis was assessed by hematoxylin-eosin staining at 4 weeks after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: After addition of tunicamycin, the expression levels of C/EBP-homologous protein and 78 kDa glucose-regulated protein were significantly upregulated, the viability of chondrocytes was decreased gradually, while the apoptotic rate was increased significantly. Results from gross observation and hematoxylin-eosin staining suggested that tunicamycin promoted the progression of osteoarthritis and tauroursodeoxycholic acid delayed the deterioration of cartilage in the rats. These findings indicate that ER stress results in the decreased chondrocyte viability and increased apoptosis, which may be an important pathogenesis of osteoarthritis. Additionally, tauroursodeoxycholic acid can effectively alleviate osteoarthritis induced by ER stress.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Endoplasmic Reticulum, Chondrocytes, Osteoarthritis, Tunicamycin, Deoxycholic Acid, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴浩，孟志超，曹永平，潘利平，周星彤，杨昕，刘恒，王瑞，崔云鹏，李翔，李卓扬. 内质网应激对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2502-2508.

Wu Hao, Meng Zhi-chao, Cao Yong-ping, Pan Li-ping, Zhou Xing-tong, Yang Xin, Liu Heng, Wang Rui, Cui Yun-peng, Li Xiang, Li Zhuo-yang. Effect of endoplasmic reticulum stress on chondrocytes in a rat model of knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2502-2508.

图/表（结果） 2

2.1 大鼠关节软骨细胞形态及鉴定 大鼠原代软骨细胞在贴壁前为圆球形，呈悬浮状态，培养9-12 h部分贴壁，绝大部分在24 h时贴壁。贴壁后的细胞变为梭状，后逐渐伸展为多角形。大鼠软骨细胞胞浆丰富，细胞核清晰呈类圆形，多数为1个核仁(见图1A)。随着细胞密度的不断增加，单层生长的软骨细胞出现局灶性立体生长集落。培养六七天后，单层软骨细胞铺满整个培养瓶底部。经过传代后，细胞生长速度变快，第3代大鼠关节软骨细胞4 d左右可以汇合至90%以上(见图1B)。

2.2 衣霉素作用下大鼠关节软骨细胞生长曲线 在正常条件下，第3代大鼠关节软骨细胞在接种后，经过2天的潜伏期后开始进入对数生长期，对数生长期可维持2天，第6天开始进入平台期。在第4天加入10 mg/L衣霉素处理后，处理组细胞增殖活性在加药后24，48，72 h较正常细胞均明显下降(P < 0.05)，且下降程度随时间的延长而显著增加(见图2)。

2.3 衣霉素作用下大鼠关节软骨细胞的凋亡 大鼠软骨细胞在受到衣霉素作用后，细胞凋亡量随着作用时间的延长逐渐增多。在10 mg/L衣霉素作用下，自加药6 h起，细胞凋亡率较0 h(对照组)即显著增加(P < 0.05)，并随着衣霉素作用时间的延长而继续增高(见图3)。

2.4 衣霉素作用下大鼠软骨细胞GRP78、CHOP的表达变化

GRP78的表达：在正常细胞内，GRP78的表达量较低。在衣霉素作用下，至药物作用12 h，大鼠软骨细胞GRP78的表达较正常细胞均明显增加(P < 0.01)，并随着药物作用时间的延长继续增加(见图4A，图4B)。

CHOP的表达：药物作用6 h起，CHOP的表达量即较前显著增加(6 h 0.298±0.068 vs. 0 h 0.029±0.016，P < 0.05)；至药物作用12 h，CHOP表达量达到峰值(0.764±0.061)，至24-72 h，CHOP表达逐渐下降(见图4A，图4C)。

2.5 内质网应激反应对大鼠骨关节炎进展的影响 15只大鼠随机均分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。在骨关节炎模型建立4周后，各组大鼠膝关节股骨滑车均可见不同程度磨损。其中关节腔注射衣霉素的膝关节股骨滑车磨损最为明显，注射牛磺熊去氧胆酸者软骨损伤较轻，与注射PBS者较接近(见图5A-C)；3组大鼠膝关节股骨后髁软骨均磨损轻微(见图5D-F)。苏木精-伊红染色可见，注射衣霉素的膝关节软骨层破坏最明显，而注射牛磺熊去氧胆酸者关节软骨层结构较完整，注射PBS者介于2者之间(见图6A-C)；与大体标本结果类似，苏木精-伊红染色下观察3组大鼠膝关节股骨后髁软骨均磨损轻微，3组间差异不明显(见图6D-F)。

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引言

骨关节病是一类由多种因素引起的、以关节软骨降解、软骨下骨改变为主要病理特征的关节退行性疾病。关节软骨细胞是软骨唯一的细胞成分，也是合成、分泌、降解Ⅱ型胶原、蛋白多糖等细胞外基质的唯一细胞。普遍认为，软骨细胞功能受损和凋亡在退行性骨关节炎发生发展中起着重要作用^[1]。由于软骨细胞属于终末分化细胞，其自身修复及再生能力有限，随着所受外界刺激的不断积累，最终导致软骨细胞的凋亡及细胞外基质的降解，从而导致骨关节炎的发生。因此，在受到外界异常刺激时，其主要通过细胞内的保护机制维持细胞的功能和生存。

内质网是细胞内最大的细胞器，其内膜面积占细胞所有膜结构的50%，体积占细胞总体积的10%，主要负责蛋白质的合成转运、信号肽识别、糖基化修饰、细胞内信号传导及细胞内钙的再分布等重要生理功能，同时，内质网还能对未正确折叠的蛋白加以识别，并将其“销毁”^[2]。内质网应激是指由于各种原因使得细胞内质网发生功能紊乱, 导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca²⁺平衡紊乱的病理状态。为缓解这种状态，使内质网功能恢复正常，细胞内发生的一系列反应被称为内质网应激反应，也称作未折叠蛋白反应^[3]。现有研究表明，内质网应激反应涉及的细胞信号传导通路主要涉及PERK(protein kinase R-like ER kinase)通路、ATF6(acting transcription factor 6)通路、IRE1(inositol-requiring enzyme 1)通路^[4]。普遍认为，轻度的、短暂的刺激导致的内质网应激反应使细胞维持正常的功能和生存，而过度的内质网应激反应最终导致细胞的凋亡^[5]。目前的研究表面，内质网应激与许多慢性疾病的发生相关，其中，内质网应激可能与骨关节炎的发生发展存在密切的关联^[6]。

本研究以衣霉素作为内质网应激激动剂、以大鼠为研究对象，首先应用CCK-8细胞增殖活性检测、AnnexinV-FITC流式法、Western-Blot等技术，通过体外研究的方式测定了大鼠关节软骨细胞在高强度内质网应激条件下细胞生存状态的变化及内质网应激反应强度的变化；而后，通过体内研究观察大鼠创伤性关节炎模型中内质网应激激动剂及抑制剂对关节炎进展的影响，进一步明确了内质网应激对骨关节炎发生发展的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞实验和体内实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年4月至2016年4月在北京大学第一医院动物实验室和中心实验室进行。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康4-6周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180-210 g；8-9月龄SPF级健康雄性SD大鼠15只，体质量560-630 g。以上均由北京大学第一医院实验动物中心提供，许可证号：J201519。

1.3.2 材料及仪器 衣霉素(Sigama Aldrich，美国)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(凯基生物，中国)；Annexin-V/FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物，中国)；葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78，GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、β-actin抗体(Santa Cruz，美国)；牛磺熊去氧胆酸(Sigama Aldrich，美国)；倒置显微镜(CKX)(OLYMPUS，日本)；KODAK Image Station 4 000 MM/Pro KODAK 高灵敏多模式分子成像系统(Carestream Health，美国)；Synergy H1全功能酶标仪(BioTek，美国)；INFLUX流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞实验

大鼠关节软骨细胞的分离和培养：取4-6周龄SD大鼠，在无菌条件下刮取髋膝关节软骨，刮取过程中尽量避免携带肌肉或骨组织；而后放入无菌培养皿中，PBS漂洗3遍，低温下移至超净台，用眼科剪将组织剪成1 mm×1 mm ×1 mm大小的颗粒，加入0.25%胰蛋白酶溶液在 37 ℃细胞培养箱中消化30 min；使用含体积分数10%FBS的DMEM培养液终止消化，离心，去上清，收集沉淀；在软骨组织中加入0.25%Ⅱ型胶原酶重悬消化沉淀，放置于37 ℃ 4 h；使用尼龙网(无菌，200目)过滤，收集悬液，离心，去上清，收集沉淀；用含体积分数10% FBS的DMEM培养液重悬沉淀，在体积分数5%CO₂饱和湿度、37 ℃条件下培养，隔天换液。

衣霉素作用下大鼠关节软骨细胞生长曲线：将大鼠第3代关节软骨细胞接种至多块96孔培养板中，每组设置8个复孔，置于37 ℃培养箱中培养，接种当日记为第0天；将接种的细胞分为对照组(接种第4天加入正常培养液)和衣霉素组(接种第4天加入含10 mg/L衣霉素的培养液)，每孔中加入100 μL培养液和10 μL CCK-8溶液，酶标仪在波长450 nm处检测每孔吸光度A值；测出A值后，以时间为X轴、A值为Y轴绘制对照组及衣霉素组大鼠关节软骨细胞1-7 d的生长曲线。

衣霉素作用下大鼠关节软骨细胞凋亡检测：取第3代大鼠关节软骨细胞接种至培养瓶中，当细胞汇合接近60%-70%时，更换培养基，加药(10 mg/L衣霉素)，用含0.25%胰蛋白酶(不含 EDTA)消化液消化细胞使细胞脱落，离心，弃上清，收集沉淀，PBS洗涤3次，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC 混匀后，加入5 μL Propidiumlodide混匀；室温避光，反应5-15 min；流式细胞仪分析(激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm)，测定对照组(0 h)、加药后6，12，24，48，72 h细胞凋亡情况。

内质网应激相关蛋白(GRP78、CHOP)的测定：将第3代大鼠关节软骨细胞接种于培养瓶中，将其分为正常细胞(对照组)及衣霉素(10 mg/L)处理6，12，24，48，72 h组。收集各组细胞，加入RIPA裂解液，提取细胞全蛋白。经BCA 定量、上样、SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、一抗、二抗孵育和ECL 显影等步骤，检测各组细胞内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP的表达。

1.4.2 体内实验

内质网应激反应对大鼠创伤性关节炎进展的影响：取15只八九月龄健康雄性SD大鼠，应用交叉韧带及半月板切除手术建立创伤性关节炎模型。随机平均分为3组：A组双侧膝关节注射药物分别为200 μmol/L衣霉素和PBS；B组双侧注射药物分别为200 μmol/L牛磺熊去氧胆酸和PBS；C组双侧注射药物分别为200 μmol/L 衣霉素和200 μmol/L 牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)。术后1周开始关节腔注射。术后4周5%戊巴比妥过量麻醉处死大鼠，观察各组大鼠膝关节退变情况。而后取膝关节标本，经体积分数4%甲醛固定、10%EDTA脱钙、石蜡包埋，制成5 μm厚切片。经苏木精-伊红染色后观察各组标本软骨组织结构^[7]。

1.5 主要观察指标 ①大鼠关节软骨细胞在体外衣霉素作用下细胞增殖活性及细胞凋亡的变化情况；②在衣霉素作用下软骨细胞内内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP的表达变化情况；③在创伤性关节炎模型中，比较给予内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸和内质网应激激动剂衣霉素后大鼠关节软骨的退变情况。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0(IBM SPSS,US)统计软件进行数据处理，多样本均数比较应用单因素方差分析，组间均数两两比较方差齐者采用最小显著差值法(Least-Significance Difference，LSD)，方差不齐时采用Tambane’s T2法。两样本均数比较应用独立样本t 检验(Independent-Samples T Test)。P < 0.05视为差异有显著性意义。计量资料均采用x(_)±s表示。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

内质网是具有重要生理功能的细胞器，它不仅调节着蛋白质合成、折叠和运输，维持着细胞内钙离子水平，而且能够接收、传导和应答各种细胞信号。当外界刺激造成细胞内钙离子稳态改变和未折叠或者错误折叠蛋白在内质网中蓄积时就会引发内质网应激反应^[8]。由于软骨细胞是骨关节炎发生中主要的受累细胞，内质网应激所导致的软骨细胞功能障碍和凋亡可能与骨关节炎的发生发展存在重要的关系。

现有研究表明，内质网应激反应涉及的细胞信号传导通路主要包括3条：PERK通路、ATF6通路、IRE1通路。正常状态下，GRP78与这3条通路的起始蛋白相结合，抑制这3条信号通路的活化。但是，在内质网应激状态下，大量增多的未折叠蛋白竞争性地与GRP78相结合，从而使这些信号通路活化^[9]。在内质网应激反应激活后，在最初的较短的时间内，细胞的转录作用明显减弱，从而减少了进入内质网的未折叠蛋白，缓解内质网的负荷；而后，内质网应激反应上调GRP78及与蛋白折叠相关基因的表达，从而加速内质网腔内堆积的未折叠蛋白的折叠过程^[3]。如果内质网应激持续存在，大量堆积的未折叠蛋白将激活内质网应激相关的蛋白降解(ER-associated degradation，ERAD)过程；如果经过上述作用，内质网应激仍持续存在而无法被缓解，细胞将进入凋亡过程。

在本研究中，作者应用高剂量衣霉素诱导大鼠关节软骨细胞制作内质网应激模型，并通过检测细胞内GRP78和CHOP表达的变化来明确软骨细胞内质网应激反应的强度。众所周知，衣霉素能够抑制细胞内蛋白的折叠和修饰，从而导致细胞内未折叠蛋白的堆积，诱导内质网应激的发生^[10]；GRP78和CHOP则是内质网应激反应的2种标志性分子。如前所述，GRP78在未折叠蛋白堆积时参与内质网应激反应的启动和活化，CHOP则是内质网应激反应持续存在时下游调控细胞凋亡的重要蛋白之一^[11]。实验结果显示，在高剂量衣霉素作用下，随着作用时间的延长，软骨细胞内GRP78表达在衣霉素作用后12 h开始显著增加并持续升高，而CHOP的表达也显著增高，至加药后24 h达到峰值，随后略有下降。同时，随着软骨细胞内质网应激反映的增强，作者测定了软骨细胞增殖活性和凋亡率的变化。结果显示，加药组的软骨细胞的增殖活性较正常对照组显著下降，且这种下降随着时间的延长而愈发明显；与此一致，在高剂量衣霉素作用下，软骨细胞的凋亡率则逐渐升高。这些结果表明，在高剂量衣霉素作用下，软骨细胞内质网应激反应明显增强；随着内质网应激反应的持续激活，内质网应激反应诱导的细胞凋亡作用也逐渐增强。与本研究的结果类似，Takada等^[12]的研究证实，骨关节炎患者的关节软骨内与内质网应激反应相关的蛋白，诸如GRP78、PERK、XBP1等，较正常人存在明显的高表达，同时，他们的研究还指出，软骨细胞内质网应激的增强造成Ⅱ型胶原合成减低、基质金属蛋白酶13合成增加，从而导致细胞外基质的降解，而CHOP、caspase-3等凋亡相关蛋白的激活则导致了软骨细胞凋亡的增加。随后，Guo等^[13]的研究证实，白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等炎症因子的作用也能够导致软骨细胞内GRP78、ATF6、IREα、XBP1等内质网应激相关蛋白的表达升高，其中，ATF6和IREα诱导的XBP1表达升高对软骨细胞的凋亡起保护作用。值得注意的是，在本研究中，在高剂量衣霉素作用下，软骨细胞内CHOP表达升高早于GRP78的升高，且CHOP的表达在达到峰值后有所下降，未与GRP78表达平行，且与细胞凋亡情况并不一致。作者认为，CHOP表达的提前出现可能是由于高剂量衣霉素造成软骨细胞内未折叠及错误折叠蛋白在短时间内大量堆积，在GRP78的表达尚未明显升高、不足以中和堆积的蛋白时，堆积的未折叠及错误折叠蛋白直接激活内质网应激反应通路，导致CHOP表达升高^[14]。过度的内质网应激的持续存在，导致越来越多的细胞凋亡由CHOP以外的促凋亡通路介导，而CHOP的活性则受到抑制，这可能是导致CHOP表达在达到峰值后有所下降的原因^[15]。

为了验证体外细胞实验所得结果并进一步明确内质网应激对骨关节炎发生发展的影响，作者分别应用衣霉素和牛磺熊去氧胆酸对已行交叉韧带切断的大鼠膝关节进行关节腔内注射，观察关节软骨的变化。目前的研究显示，牛磺熊去氧胆酸是一种内质网蛋白分子伴侣(Chemical ER Chaperon)，能够减轻内质网应激并减少内质网应激所诱导的细胞凋亡^[16]，对胰岛细胞、心肌细胞、神经元细胞等都具有一定的细胞保护、改善功能和抑制凋亡的作用^[17-18]。在本研究中，手术后4周结果显示，所有膝关节均有不同程度的退变，但注射衣霉素的膝关节退变最为明显，而注射牛磺熊去氧胆酸的膝关节退变最轻，PBS组的膝关节作为对照介于两者之间；苏木精-伊红染色则显示，衣霉素组的膝关节软骨层破坏明显，软骨细胞凋亡显著，而牛磺熊去氧胆酸组的膝关节关节软骨表面平整，各层形态结构完整。对此结果进行分析，作者认为关节腔注射衣霉素作为一种加重因素，与建模后关节内异常应力、炎症因子等其他因素协同作用，共同引发了软骨细胞的内质网应激。软骨细胞发生内质网应激后，蛋白合成功能异常，造成软骨细胞合成细胞外基质减少，加重了软骨细胞凋亡与细胞外基质降解之间的级联反应，增加了软骨细胞的凋亡易感性，使得凋亡率升高，或者直接发生了内质网应激相关凋亡；而牛磺熊去氧胆酸作为一种化学性的内质网蛋白分子伴侣，能够减轻内质网应激及减少内质网应激所诱导的细胞凋亡，保护了内质网的功能，相应地一定程度上保障了软骨细胞合成细胞外基质的功能，从而延缓了软骨细胞凋亡和细胞外基质缺失之间的循环级联进展。

由此可见，在骨关节炎发生发展的过程中，过度的内质网应激反应将导致软骨退变的加速，内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸能够延缓关节软骨的退变。Malo等^[19]在关于胰腺腺泡细胞的研究中发现，牛磺熊去氧胆酸能够抑制内质网应激因素刺激下GRP78上调、PERK磷酸化和CHOP基因表达，并增强了胰腺腺泡细胞的分泌功能，从而减少胰腺细胞的凋亡；本课题组之前的研究也显示，在体外实验中，牛磺熊去氧胆酸能够抑制人软骨细胞在内质网应激条件下CHOP的表达，减少衣霉素作用导致的细胞凋亡^[20]。这些研究为体内实验中得到的结果提供了机制上的解释。当然，牛磺熊去氧胆酸抗凋亡的机制很多，如对抗氧化应激、抑制炎症等，这些也可能是本实验中牛磺熊去氧胆酸减少了软骨细胞的凋亡的作用机制之一。在牛磺熊去氧胆酸的众多机制中，抑制内质网应激是否占主要地位仍然需要进一步的研究。

本研究尚存在一些不足之处：①本研究体外实验部分仅选择了GRP78和CHOP两个蛋白作为内质网应激反应的标志物，未能明确内质网应激反应3条通路的具体变化情况，需进一步研究；②体内研究部分在药物浓度和观察时间上设置的分组较少，可在今后的研究中设立不同药物浓度和观察时间，以观察衣霉素、牛磺熊去氧胆酸对软骨细胞凋亡影响的动态变化。

综上所述，本研究系统地通过体外及体内研究证实，内质网应激的过度激活导致软骨细胞凋亡的增加，这可能是导致骨关节炎发生发展的重要机制之一；应用内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸可以有效地减少内质网应激导致的骨关节炎的进展。这一发现对于完整揭示骨关节炎的发病机制、早期治疗具有重要的参考价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

内质网应激对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞的影响

Effect of endoplasmic reticulum stress on chondrocytes in a rat model of knee osteoarthritis

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