高脂饲料配合链脲佐菌素诱导2型糖尿病模型大鼠的椎间盘形态

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型：这种模型主要反映了1型糖尿病的病理生理状态。Srinivasan等在这一模型的基础上利用高脂饲料喂养大鼠诱导发生胰岛素抵抗，制作了2型糖尿病大鼠模型，其在病程、代谢特征上与人类2型糖尿病较为接近。目前这一模型已被广泛用于2型糖尿病的治疗等研究中。
椎间盘退变与糖尿病的关系：目前研究显示，椎间盘退变可能与高血糖、微血管病变和糖基化终产物等2型糖尿病相关改变有关，但2型糖尿病导致椎间盘退变的机制仍不明确。

摘要
背景：高脂饲料配合低剂量链脲佐菌素诱导大鼠2型糖尿病模型是目前常用的2型糖尿病动物模型，目前尚无此模型对椎间盘结构影响的相关报道。椎体终板硬化是造成椎间盘退变的重要因素之一。
目的：评估高脂饲料配合低剂量链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠模型是否适用于2型糖尿病相关椎间盘退变研究。
方法：32只3月龄雌性SPF级SD大鼠随机分为4组，即假手术组、双侧卵巢切除组、糖尿病组、双侧卵巢切除+糖尿病组，每组8只。分别进行双侧卵巢切除术和/或高脂饲料配合低剂量链脲佐菌素处理。监测各组大鼠体质量、血糖及糖耐量，链脲佐菌素处理后8周检测骨密度后处死动物，取L5-6节段脱钙后正中矢状位切片行VG染色并进行椎间盘退变评分，分析椎间盘高度和终板厚度。
结果与结论：①糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组大鼠空腹血糖、随机血糖分别显著高于假手术组和双侧卵巢切除组(P < 0.05)，糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组大鼠胰岛素敏感性分别显著低于假手术组和双侧卵巢切除组(P < 0.05)；②双侧卵巢切除组L4-L6椎体骨密度显著低于假手术组(P < 0.05)，糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组L5-L6椎体骨密度均显著低于假手术组(P < 0.05)；③双侧卵巢切除组和双侧卵巢切除+糖尿病组L5-L6椎间盘退变评分分别显著高于假手术组和糖尿病组(P < 0.05)；双侧卵巢切除+糖尿病组表现与双侧卵巢切除组相仿，可见髓核细胞软骨化生及黏液变性，其评分结果显著高于假手术组和糖尿病组(P均< 0.05)，但与双侧卵巢切除组相比差异未见显著性意义；④与假手术组相比，双侧卵巢切除组和双侧卵巢切除+糖尿病组椎间盘高度明显降低(P < 0.05)；4组间终板厚度差异无显著性意义；⑤综上所述，虽然高脂饲料配合低剂量链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠模型具备糖尿病特征表现，但未观察到其间盘组织较正常大鼠有显著改变，可能不适于2型糖尿病相关椎间盘退变研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-1522-7318(刘光源)

关键词: 组织构建, 组织工程, 2型糖尿病, 链脲佐菌素, 骨质疏松, 骨密度, 椎间盘退变, 河北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Rat models of diabetes mellitus type 2 (T2DM) are usually induced by the combination of high-fat diet and low-dose streptozotocin, but their effects on the intervertebral disc have not yet been reported. Endplate sclerosis is an important factor contributing to intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To evaluate whether the rat T2DM model induced by high-fat diet combined with low-dose streptozotocin is suitable for the study of T2DM related intervertebral disc degeneration.
METHODS: Thirty-two 3-month-old female Sprague-Dawley rats were divided into four groups (n=8 per group), including sham, bilateral variectomy, DM, and bilateral variectomy plus DM groups, followed by subjected to bilateral ovariectomy and/or high-fat diet combined with low-dose streptozotocin, respectively. The blood glucose level, body mass and glucose tolerance were determined. The bone mineral density of the lumbar spine was measured after 8-week streptozotocin treatment. The L5-6 segments were removed and cut through midst sagittal plane after decalcification, and then underwent Von Gieson staining and histological degeneration scoring, and the disc height and endplate thickness were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: Fasting blood glucose and random blood glucose levels in the DM and bilateral variectomy plus DM groups were significantly higher than those in the other two groups, and the insulin sensitivity in the DM and bilateral variectomy plus DM groups were significantly lower than that in the other groups (P < 0.05). L4-6 vertebral bone mineral density in the bilateral variectomy group was significantly lower than that in the sham group (P < 0.05); L5-6 vertebral bone mineral density in the DM and bilateral variectomy plus DM groups was significantly lower than that in the sham group (P < 0.05). L5-6 vertebral histological scores in the DM and bilateral variectomy plus DM groups were significantly higher than those in the other groups (P < 0.05). Similar with the bilateral variectomy group, there were chondrometaplasia and mucoid degeneration of nucleus pulposus cells in the bilateral variectomy plus DM group, and the histological scores were significantly higher than those in the sham and DM groups (P < 0.05). Compared with the sham group, the intervertebral disc height in the bilateral variectomy and bilateral variectomy plus DM groups was significantly decreased (P < 0.05). While, there was no significant difference in the endplate thickness among groups. These results indicate the combination of high-fat diet and low-dose streptozotocin-induced rat T2DM models possess diabetic characteristics, but the rat intervertebral disc tissues show no significant differences from the normal ones; therefore, this model may be unsuitable for the study on T2DM-related intervertebral disc degeneration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Diabetes Melitus, Type 2, Osteoporosis, Bone Density, Intervertebral Disk Degeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘光源，戴慕巍，田发明，袁雷亮，耿林丹，卑明健，张柳，王文雅. 高脂饲料配合链脲佐菌素诱导2型糖尿病模型大鼠的椎间盘形态[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(12): 1883-1888.

Liu Guang-yuan, Dai Mu-wei, Tian Fa-ming, Yuan Lei-liang, Geng Lin-dan, Bei Ming-jian, Zhang Liu, Wang Wen-ya. Morphology of the intervertebral disc in high fat combined with streptozotocin-induced type II diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(12): 1883-1888.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 32只SD大鼠随机分为4组，即假手术组、双侧卵巢切除组、糖尿病组、双侧卵巢切除+糖尿病组，每组8只。实验动物共饲养14周，全程无动物死亡。

2.2 体质量变化各组大鼠在整个饲养14周期间，体质量均呈现逐渐增长的趋势(第1-5周平均8.29 g/周)。大鼠在双侧卵巢切除术后，其体质量增长速度(第5-14周双侧卵巢切除组平均13.00 g/周，双侧卵巢切除+糖尿病组平均8.41 g/周)显著高于未接受双侧卵巢切除大鼠(第5-14周假手术组平均6.68 g/周，糖尿病组平均1.64 g/周)。大鼠在接受链脲佐菌素注射前各组间体质量在各时间点差异无显著性意义。但是，在接受链脲佐菌素 35 mg/kg腹腔注射后1周，糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组大鼠体质量增长速度减慢甚至出现下降，之后体质量恢复增长，但糖尿病组(292.49±15.81) g和双侧卵巢切除+糖尿病组(359.10± 36.80) g仍分别显著低于假手术组(326.15±30.04) g和双侧卵巢切除组(393.22±34.60) g，各组间比较P均< 0.05，见图2。

2.3 血糖变化各组动物在注射链脲佐菌素或安慰剂之前空腹血糖水平差异无显著性意义。在腹腔注射后第3天空腹血糖在糖尿病组(22.22±4.99) mmol/L和双侧卵巢切除+糖尿病组(19.75±2.63) mmol/L显著高于其余2组[假手术组为(5.1±0.47) mmol/L，双侧卵巢切除组为(4.96±0.35) mmol/L]，P均< 0.05。之后2组空腹血糖值出现轻度下降并趋于稳定，但仍高于11.1 mmol/L的阈值。糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组比较各时间点血糖值差异无显著性意义，假手术组和双侧卵巢切除组比较各时间点空腹血糖值差异无显著性意义，见图3。

于饲养第10周测定各组大鼠随机血糖结果显示，糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组的随机血糖水平均显著高于11.1 mmol/L，且均显著高于假手术组和双侧卵巢切除组，P均< 0.05。糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组比较各时间点血糖值差异无显著性意义，假手术组和双侧卵巢切除组比较各时间点空腹血糖值差异无显著性意义，见图4。

于饲养第12周对所有大鼠行口服糖耐量试验结果显示糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组大鼠糖耐量明显异常(见图5)，2组动物血糖值在任意时间点均显著高于假手术组和双侧卵巢切除+糖尿病组。2组胰岛素敏感性显著下降，K值均显著小于假手术组和双侧卵巢切除+糖尿病组(表2)。

2.4 L₄-L₆椎体骨密度对L₄-L₆椎体进行骨密度测定结果见表3。双侧卵巢切除组L₄椎体骨密度显著低于假手术组 (P < 0.05)，双侧卵巢切除组、糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组的L₅、L₆椎体骨密度均显著低于假手术组(P < 0.05)，其余各组间比较差异未见显著性意义。

2.5 L_5/6椎间盘退变评分对各组大鼠L₅_-6椎间盘切片进行VG染色并评分(图6)，结果如表4所示。假手术组椎间盘髓核中含有大量脊索细胞，数量多而形态好，细胞外基质深染；纤维环各层排列整齐。双侧卵巢切除组可见髓核中脊索细胞减少，边缘出现软骨化生及黏液样变性，内层纤

维环排列紊乱，评分显著高于假手术组(P < 0.05)。糖尿病组髓核脊索细胞数量及形态未见明显改变，纤维环各层排列整齐，评分与假手术组差异无显著性意义。双侧卵巢切除+糖尿病组表现与双侧卵巢切除组相仿，可见髓核细胞软骨化生及黏液变性，其评分结果显著高于假手术组和糖尿病组(P 均< 0.05)，但与双侧卵巢切除组相比差异未见显著性意义。

2.6 L_5/6椎间盘数据测量结果(高度、厚度) 椎间盘高度测量(图7)：与假手术组相比，双侧卵巢切除组和双侧卵巢切除+糖尿病组椎间盘高度明显降低(P < 0.05)，糖尿病组有所降低，但差异无显著性意义。

终板厚度测量(图8)：4组间终板厚度差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 材料

1.2.1 实验动物 3月龄雌性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，购自北京维通利华公司，平均体质量(246±14) g，于屏障实验室使用大鼠维持饲料适应性饲养1周，自由进食饮水。

1.2.2 试剂大鼠维持饲料[北京科澳协力公司生产，执行标准：GB 13078和GB14924.2，脂肪含量≥ 4%(以kcal%计)]，高脂饲料[北京华阜康公司定制，配方：Research Diets-D12492，脂肪含量60%(以kcal%计)]。链脲佐菌素(购自Sigma公司)，VG染色试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司生产)。

1.3 方法

1.3.1 动物处理 SD大鼠按数字随机表法分为4组，即假手术组、双侧卵巢切除组、糖尿病组、双侧卵巢切除+糖尿病组，每组8只。实验流程如图1所示。适应性饲养1周后，对假手术组和双侧卵巢切除组继续投喂大鼠维持饲料，自由饮食水；对糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组投喂高脂饲料至实验终点，自由饮食水。饲养第5周，对双侧卵巢切除组和双侧卵巢切除+糖尿病组在7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉下施行双侧卵巢切除术。双侧卵巢切除术后1周，对糖尿病组和双侧卵巢切除+糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg，溶于pH 4.4的0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中，于给药前配制)，对假手术组和双侧卵巢切除组给予等量的柠檬酸缓冲液。实验动物共饲养14周，全程无动物死亡。

1.3.2 动物血糖监测所有动物于饲养第1，5，6，7，10，14周当日上午9点测定空腹血糖：测定前一晚9点开始禁食、自由饮水，测定后恢复动物进食。取尾静脉血使用罗氏ACCU-CHEK Active血糖仪测定大鼠空腹血糖，以血糖值为11.1 mmol/L为造模成功标准。

于饲养第10周前一日上午9点取大鼠尾静脉血测定所有动物随机血糖。于饲养第12周当日上午9点行口服糖耐量试验：测定前1 d开始9点开始禁食，自由饮水，50%葡萄糖溶液灌胃(4 mL/kg)后0，15，30，60，90，120 min取尾静脉血测定血糖值。以K值代表胰岛素敏感性，即以时间为横坐标，血糖值经自然对数转换为纵坐标，拟合线性回归模型所得的回归系数值。

1.3.3 X射线检测及骨密度测定于饲养第14周当日对各组动物在7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉下，置于Hologic QDR4500A型双能X射线骨密度仪测定腰椎(L₄_-₆)的骨密度。

1.3.4 动物处死及取材于饲养第14周当日测定空腹血糖后，各组动物在过量水合氯醛腹腔注射麻醉下处死并分离L₅_-₆腰椎，于体积分数10%甲醛PBS中固定72 h，经10%EDTA-Na2/PBS(pH 7.2)脱钙完全后脱水、包埋，采用Leica 2245切片机制备6 μm石蜡切片，采用VG试剂盒染色，进行间盘退变评分(表1)。

表1 椎间盘退变评分

Table 1 Histological degeneration scoring of the intervertebral disc

分数	髓核	纤维环	骨赘
0	呈凝胶状内含丰富的脊索细胞	纤维环完整	无
1	脊索细胞丢失，出现软骨样细胞	纤维软骨组织增生，髓核-纤维环边界模糊	小骨赘
2	局灶性黏液变性，出现裂隙	纤维环中出现裂隙	大骨赘
3	弥漫性黏液变性，髓核遍布裂隙

1.3.5 椎间盘高度和软骨终板厚度椎间盘数据测量是通过椎间盘VG染色图像，使用显微镜内置软件进行测量。椎间盘高度是指组织学样本中头尾部生长板的距离。每一张组织学照片都是左侧、中间以及右侧3个部位的平均高度。软骨终板厚度则是头部生长板到髓核与软骨终板交界的距离。每一张组织学照片软骨终板的厚度是10个软骨终板厚度的平均值。

1.4 主要观察指标监测各组大鼠体质量、血糖及糖耐量，链脲佐菌素处理后8周检测骨密度后处死动物，取L₅_-₆节段脱钙后正中矢状位切片行VG染色并进行椎间盘退变评分，分析椎间盘高度和软骨终板厚度。

1.5 统计学分析所有数据输入SPSS 20.0软件中进行处理，结果以x(_)±s表示。对定量数据先行正态性检验，符合正态分布的数据进行单因素方差分析处理，组间比较采用LSD t 检验或Dunnett’s T3检验；不符合正态分布的定量数据和组织学评分采用Kruskal-Wallis非参数检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

本实验中大鼠在接受4周的高脂饲料喂养后经腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg处理，其空腹血糖均显著升高，胰岛素敏感性下降。同时，即使在高脂饲料饲养条件下，这些大鼠的体质量均低于相应未经链脲佐菌素处理的动物。因此，可以认为成功诱导这些SD大鼠发生糖尿病，并且其特征与Srinivasan等^[9]的研究相符合。

对各组大鼠的骨密度检测结果提示糖尿病组大鼠显著低于正常大鼠，这一结果与这与2型糖尿病患者的表现并不一致。虽然2型糖尿病患者的骨折风险增加，但其往往具有较高的骨密度^[14-15]。而与之相反，1型糖尿病患者的骨密度则显著低于同龄健康人群^[16]。Nakashima等^[17]就这2种糖尿病患者的不同表现提出患者的骨密度可能受到胰岛素水平的影响，2型糖尿病患者表现为体内胰岛素相对不足，其胰岛素水平通常高于正常人群，因此其骨密度亦高于正常水平。Hou等^[18]的研究为这一假说提供支持，其发现在患病1-3年的2型糖尿病患者中，使用胰岛素替代疗法的患者L₂_-₄椎体骨密度显著高于服用胰岛素促进剂者。因此，2型糖尿病对患者骨组织代谢的影响可能与其胰岛素水平密切相关。而对于本实验中使用的大鼠模型，其胰腺β细胞已经受到链脲佐菌素的破坏，虽然动物存在胰岛素抵抗的表现，但是其胰岛素分泌不足，因此其在骨组织的表现上更接近1型糖尿病患者。

本实验显示，双侧卵巢切除不仅导致SD大鼠椎体骨密度降低，还可以导致椎间盘发生退变，椎间盘高度也出现明显降低，这与作者以往进行的研究相符^[19]。但是，无论对正常的还是经双侧卵巢切除处理的大鼠进行高脂饲料配合低剂量链脲佐菌素造模，除发现其骨密度显著降低外，椎间盘评分差异未见显著性意义，而仅椎间盘高度出现降低。这一结果可能是因为椎间盘评分是大体观察，而椎间盘高度测量相对准确一些，但终板厚度未观察到变化。如前所述，2型糖尿病患者胰岛素水平相对不足，但是绝对水平仍高于正常人群。而研究发现胰岛素对促进成骨细胞分裂和分化具有重要作用^[20]。Clemens等^[21]认为成骨细胞可作为胰岛素作用的靶细胞进而发挥调节血糖的功能。Fields等^[22]对UCD(The University of California at Davis)-2型糖尿病大鼠进行研究发现该品种大鼠的椎体终板有明显的硬化征象，并认为其与UCD-2型糖尿病大鼠的高胰岛素水平有关。而椎体终板硬化是造成椎间盘退变的重要因素之一。因此，胰岛素分泌的绝对不足可能就是在链脲佐菌素造模的大鼠中无法观察到椎间盘退变的原因。

综上所述，链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型具有典型的糖尿病表现，但是未观察到其间盘组织较正常大鼠有显著改变，需要进一步的免疫组织化学方法对这种造模方式进行研究。因此根据本研究的结果推断，这一模型可能并不适合用于2型糖尿病对间盘影响的研究。

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