干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
CD133：是一种重要的表面标志物，具有独特的信号传递通路，可参与到淋巴细胞再循环过程中，与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系。以CD133为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同肿瘤干细胞进行分选和研究。此次实验中，即以CD133为标志物对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选，获得CD133+/CD133- MHCC97-H细胞。
Notch信号途径：是一种细胞间相互作用的基本途径，调控着细胞增殖、分化、凋亡等过程。在Notch途径被激活时，干细胞发生增殖，活性受到抑制时，干细胞开始发生分化。

摘要
背景：以CD133为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同的肿瘤干细胞进行分选和研究。
目的：探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外增殖特性。
方法：对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选，分别获得CD133⁺与CD133^-MHCC97-H细胞，检测CD133表达及细胞迁移侵袭能力；培养14 d，检测细胞克隆形成率；培养7 d，检测细胞增殖及Notch基因蛋白表达。将CD133⁺与CD133^-MHCC97-H细胞分别接种于裸鼠背部皮下，4周后，检测成瘤情况。
结果与结论：①CD133表达与细胞克隆形成率：CD133⁺MHCC97-H细胞CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133^-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；②细胞增殖：CD133⁺MHCC97-H细胞培养3-7 d的吸光度值大于CD133^-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；③细胞迁移侵袭：CD133⁺MHCC97-H细胞迁移与侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133^-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；④Notch基因蛋白：CD133⁺MHCC97-H细胞Notch基因蛋白表达多于CD133^-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；⑤成瘤实验：CD133^-MHCC97-H细胞组成瘤体积大于CD133^-MHCC97-H细胞组(P < 0.05)；⑥结果表明：CD133阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性，具有一定的肿瘤干细胞特性，并有较强的侵袭、转移及致瘤能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5015-9381(张宝芹)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肝癌, 干细胞表面标志, 细胞亚群, 细胞增殖, 侵袭, 转移, 干细胞特性, 移植瘤, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: CD133 has been used as a marker to separate and study different tumor stem cells by using its protein specific features.

OBJECTIVE: To investigate the expression of stem cell surface marker CD133 in hepatocellular carcinoma and the in vitro proliferation of its positive subsets.

METHODS: The human hepatoma MHCC97-H cell lines were cultured and sorted, CD133⁺and CD133^- MHCC97-H cells were obtained, and the expression of CD133 and cell migration and invasion were detected. After 7 days of culture, cell proliferation ability and Notch expression were detected. After 14 days of culture, cell cloning efficiency was detected. CD133⁺ and CD133^-MHCC97-H cells were implanted into nude mice subcutaneously, and 4 weeks later, tumor formation in mice was detected.

RESULTS AND CONCLUSION:(1) CD133 expression and cell clone formation: The expression of CD133 and cell cloning efficiency of CD133⁺MHCC97-H cells were significantly higher than those of CD133^-MHCC97-H cells (P < 0.05). (2) Cell proliferation: After 3-7 days of culture, the absorbance value of CD133⁺MHCC97-H cells was significantly higher than that of CD133^-MHCC97-H cells (P < 0.05). (3) Cell migration and invasion: The number of CD133⁺MHCC97-H cells passing through the cell membrane was significantly more than that of CD133^-MHCC97-H cells (P < 0.05). (4) The Notch protein expression of CD133⁺MHCC97-H cells was significantly higher than that of CD133^-MHCC97-H cells (P < 0.05). (6) Tumor formation test: The tumor size of CD133 ^-MHCC97-H cells was larger than that of CD133^-MHCC97-H cells (P < 0.05). To conclude, CD133⁺ hepatocellular carcinoma cell subsets with strong proliferation ability have some characteristics of cancer stem cells, and strong invasion, metastasis and tumorigenic abilities.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Neoplastic Stem Cells, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞观察性实验及随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年8至12月在北京大学滨海医院实验室完成。

1.3 材料 人肝癌细胞株MHCC97-H由上海信裕生物技术有限公司提供；11周龄雄性BALB/c裸鼠10只，体质量20-25 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SYXK(京)2013-0058。

主要试剂和仪器：DMEM培养基、兔抗人Notch单克隆抗体(北京博尔迈生物技术有限公司)；胎牛血清(北京智杰方远科技有限公司)；CD133抗体(澳大利亚，Hyclone公司)；胰蛋白酶(上海素尔生物科技有限公司)；FCR封阻试剂(北京方程生物科技有限公司)；CD133免疫微珠(北京德诺生物科技有限公司)；Giemsa染色液(北京普博斯生物科技有限公司)；MTT(上海沪鼎生物科技有限公司)；细胞裂解液(上海普飞生物技术有限公司)；PVDF膜上(上海睿安生物科技有限公司)；Transwell 小室(上海博耀生物科技有限公司)；光学显微镜(上海市恒斐生物科技有限公司)；流式细胞仪(上海雷浩信息科技有限公司)；酶标仪(北京东胜创新生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 肝癌细胞的培养 利用含胎牛血清的DMEM培养基对人肝癌MHCC97-H细胞株进行常规培养。观察细胞生长情况，待细胞大部分长满后进行传代培养。去掉培养液，PBS洗涤后添加胰蛋白酶进行消化。收集脱落细胞，添加完全培养基，置于培养瓶中进行培养。收集对数期细胞，进行后续实验。

1.4.2 肝癌细胞中的CD133表达率 对MHCC97-H细胞进行重悬，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹后，添加CD133抗体进行孵育。30 min后离心，再次重悬，上流式细胞仪进行检测，记录细胞CD133表达率。

1.4.3 CD133⁺/CD133^-MHCC97-H细胞分选^[5-6] 添加胰蛋白酶对MHCC97-H细胞进行消化，进行细胞重悬，离心后去掉上清，再次进行细胞重悬。添加FCR封阻试剂和CD133免疫微珠，孵育后进行离心和细胞重悬，过柱后分别收集CD133⁺、CD133^-细胞。进行细胞计数和传代培养，上流式细胞仪进行检测，对分选后细胞的CD133表达率进行检测和记录。

1.4.4 克隆形成实验^[7] 对CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H细胞进行稀释，接种在6孔板中。连续培养14 d，PBS洗涤后向各孔添加Giemsa染色液，置于镜下进行观察和细胞集落数计数，计算细胞克隆形成率。计算方法为：克隆形成率=集落数/细胞接种数×100%。

1.4.5 细胞体外增殖^[8] 将CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H细胞接种在96孔板上，添加含体积分数10%牛血清的DMEM培养液，连续培养7 d。每天利用MTT色法对各组细胞的增殖情况进行检测，记录490 nm的吸光度值，描绘体外生长曲线。

1.4.6 Transwell小室侵袭、转移实验^[9] 利用无血清的DMEM培养液对CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H细胞进行重悬，调整细胞浓度，利用Transwell小室进行侵袭和迁移实验。置于在光学显微镜下进行观察，对穿膜细胞进行计数。

1.4.7 干细胞相关基因蛋白的表达^[10] 添加胰蛋白酶对增殖实验培养7 d的两组细胞进行消化，PBS洗涤后离心，去掉上清。添加细胞裂解液，再次离心收集上清。进行凝胶电泳，通过湿法电转移法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。添加兔抗人Notch单克隆抗体，置于4 ℃环境下。过夜后去掉一抗，添加二抗。常规曝光、显影、定影后利用图像软件检测两组的目的蛋白条带的光密度值，记录相对吸光度值。

1.4.8 裸鼠成瘤实验^[11] 将10只裸鼠随机分为2组，每组5只。对CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H细胞浓度进行调整，分别调整为1×10⁶，1×10⁷ L^-¹，之后分别接种于两组裸鼠背部皮下。接种完毕对裸鼠进行常规饲养，每日观察，连续观察4周。麻醉后处死两组裸鼠，即刻获得移植瘤标本，观察移植瘤大小，分析两组成瘤情况。

1.5 主要观察指标 不同细胞干细胞相关Notch基因蛋白表达情况、克隆形成率、迁移侵袭及成瘤能力。

1.6 统计学分析 研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件。计量资料符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着干细胞学说和相关研究的不断发展，人们开始积极的将肿瘤治疗与干细胞理论结合起来^[12]。通过研究发现在肿瘤细胞中，存在一些特殊的细胞亚群，这些细胞亚群具有干细胞相似的特性，可自我更新，并具有很强的增殖和分化能力^[13-14]。学者们还由此提出了“肿瘤干细胞理论”，认为肿瘤干细胞会对肿瘤的浸润和复发及转移等过程产生极大的影响^[15-16]。以往的众多研究均发现，肝癌干细胞与疾病的复发和转移关系密切^[17-19]。

目前对肝癌的治疗主要有手术、放疗、化疗及生物治疗等，总体治疗效果不佳。分析出现上述情况的原因，与肿瘤干细胞之间存在一定的关系。在对肿瘤干细胞进行研究时，通过使用一定的干细胞标记物，可更好地对不同肿瘤干细胞进行识别。目前，CD133⁺被认为是一种重要的肝癌干细胞表面标志物。CD133是一种具有5个跨膜结构的细胞表面糖蛋白，编码一个长度为120 ku的蛋白，最初是从造血干细胞和前体细胞表面中发现的。以往研究已证实，CD133与多种恶性肿瘤，例如肝癌等患者的预后之间存在十分密切的联系^[20-22]。另外，对肝癌细胞株进行培养可获得不同的细胞亚群。此次实验中即以CD133⁺为标志物，对MHCC97-H肝癌细胞进行分选。实验中，经分选获得CD133⁺ MHCC97-H、CD133^-MHCC97-H细胞亚群。在经过CD133表达检测和克隆形成实验之后发现，CD133⁺MHCC97-H细胞的CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133^-MHCC97-H细胞。体外培养结果也显示，CD133⁺MHCC97-H细胞体外生长曲线较为陡峭，CD133^-MHCC97-H细胞较为平缓。上述结果表明，CD133⁺MHCC97-H细胞较之CD133^-MHCC97-H细胞具有较强的体外增殖能力。对于肝癌等恶性肿瘤而言，肿瘤侵袭转移导致预后复发的重要原因之一。目前，在对肿瘤干细胞侵袭转移能力进行检测时，Transwell 小室实验具有检测速度快等特点，是一种十分简单有效的检测方法^[23-25]。此次实验中，经Transwell室检测，CD133⁺MHCC97-H细胞迁移和侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133^-MHCC97-H细胞。即提示较之CD133^-MHCC97-H细胞，CD133⁺MHCC97-H细胞具有更强的迁移和侵袭能力。在肿瘤干细胞的增殖和分化过程中，会受到一些基因的调控。以往 Nicolis等^[26]通过研究指出，与正常细胞相比，肿瘤干细胞的一些生物学特性与之相似。出现这一情况的原因，是因为肿瘤干细胞具有一些自我更新、增殖和分化相关的调控基因。

Notch受体是一种细胞表面受体，较为保守，属于整合型膜蛋白^[27]。在与周围配体接触之后会发生激活，胞浆区从细胞膜上发生脱落，并向细胞核进行转移。然后发挥信号传递作用，将信号传递给下游的信号分子。肝癌具有发病率高、病情隐匿、预后凶险等临床特征，以往大量研究已经证实，某些信号转导通路的激活或抑制与肝癌的发生、发展等有着紧密的联系。信号通路的激活、失调与多种疾病之间存在十分紧密的联系，在一定的条件下，通过Wnt信号通路的激活、失调，可以按照介导蛋白的不同，Wnt信号通路可分为多种类型^[23]。其中，β-连环蛋白(β-catenin)信号通路是一种重要的类型，这一通路通过稳定核内β-Catenin的方式，对下游靶基因予以有效激活。Notch信号途径是一种细胞间相互作用的基本途径，调控着细胞增殖、分化、凋亡等过程。在Notch途径被激活时，干细胞发生增殖，活性受到抑制时，干细胞开始发生分化^[26-28]。此次实验结果显示，CD133⁺MHCC97-H细胞的Notch基因蛋白表达水平显著高于CD133^-MHCC97-H细胞，相应的蛋白条带光密度也存在明显差异。上述结果提示，CD133⁺ MHCC97-H细胞亚群的高表达与干细胞相关基因之间存在十分密切的联系，同时也表明，CD133⁺MHCC97-H细胞具有一定的干细胞特性。在肝癌患者外周血中存在少数能够在裸鼠体内成瘤的肝癌干细胞，可穿透血管壁进入门静脉系统，形成循环中的肝癌干细胞迁移到肝内其他部位。在对细胞的致瘤性进行研究时，体内成瘤实验是常用的方法。动物致瘤性实验是指用一定数量的肿瘤细胞悬液接种动物相应部位，能够生长成为实体瘤，其组织学形态与原发瘤相似。通过对相应的细胞亚群进行动物体内接种，并观察接种后的移植瘤生成效果，可较为直接地观察到细胞致瘤能力^[29]。以往兰曦等^[30]利用流式分选技术筛选CD133⁺ HepG2肝癌细胞，并通过体内成瘤实验对细胞的“干性”进行分析，获得了理想的效果。此次实验中，CD133MHCC97-H细胞、CD133^-MHCC97-H细胞的裸鼠移植瘤体积分别为(1 203.12±185.23) mm³和(412.33±50.25) mm³，即提示CD133⁺MHCC97-H细胞具有高强的致瘤能力。

综上所述，通过此次实验可以证实，对肝癌细胞株进行培养和分选可以获得CD133阳性肝癌细胞亚群，相应的CD133阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性，具有一定的肿瘤干细胞特性，并有较强的侵袭、转移及致瘤能力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程