骨髓间充质干细胞分离培养方法及其对CD8+T淋巴细胞的免疫调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
间充质干细胞的功能：促进缺损组织修复和再生、支持肿瘤靶向治疗、免疫调节功能、支持造血干细胞重建造血。此外，间充质干细胞还对多种免疫细胞(包括树突细胞、T淋巴细胞等)具有免疫抑制作用。骨髓间充质干细胞具有自我更新和多项分化功能，并且能分泌多种生长因子，包括白细胞介素6、白细胞介素11、对正常造血功能和造血细胞分化发挥作用。因此，研究骨髓间充质干细胞在免疫性疾病中治疗、预防中的作用能提高免疫性疾病治愈率。
骨髓间充质干细胞的免疫原性：骨髓间充质干细胞具有弱免疫原性，对T淋巴细胞的作用并不会受到主要组织相容性复合物的限制，并且无论骨髓间充质干细胞源于自供体、受体还是第三者均会产生类似的免疫调节功能。研究中，将1×10³、1×10⁴及1×10⁵/well的骨髓间充质干细胞与CD8⁺T淋巴细胞进行混合，不同浓度骨髓间充质干细胞对CD8⁺T淋巴细胞均有抑制作用。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞具有免疫调节特性，使其在免疫抑制方面有可预期的应用价值。
目的：探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法及其对CD8⁺T淋巴细胞的免疫调控。
方法：采用骨髓直接贴壁法获得原代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，利用差速贴壁结合消化法纯化原代细胞，加入Ⅰ型胶原蛋白作为细胞外基质，扩增骨髓间充质干细胞。取第2代骨髓间充质干细胞，分别将0，1×10³，1×10⁴，1×10⁵ /well的骨髓间充质干细胞与CD8⁺T淋巴细胞共培养，植物血凝素刺激68 h，荧光CFSE法观察CD8⁺T淋巴细胞聚集，MTT法检测CD8+T淋巴细胞增殖率。
结果与结论：①不同密度骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞均有抑制作用，1×10³/well组抑制能力最弱，形成集落现象；1×10⁵/well组抑制能力最强，细胞未见明显聚集现象；②1×10³，1×10⁴，1×10⁵/well组CD8⁺T淋巴细胞增殖率分别为(44.83±4.92)%、(31.94±6.28)%及(15.77 ±3.98)%，3组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，采用全骨髓直接贴壁法能获得原代大鼠骨髓间充质干细胞，采用差速贴壁联合消化控制法能完成细胞纯化，骨髓间充质干细胞浓度依赖性抑制T淋巴细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9456-0073(赵小强)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 组织细胞, 免疫调节, 骨髓直接贴壁法, 差速贴壁结合消化法, I型胶原蛋白, 细胞外基质, 尼龙柱法, T淋巴细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have immunomodulatory properties and have potential applications in immunosuppression.
OBJECTIVE: To investigate the isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells and the immunoregulation of CD8⁺T lymphocytes.
METHODS: Primary bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from Wistar rats by bone marrow adherence method. The primary cells were purified by differential adherence and digestion, and collagen type I was added as extracellular matrix to expand bone marrow mesenchymal stem cells. Passage 2 bone marrow mesenchymal stem cells at densities of 0, 1×10³, 1×10⁴ and 1×10⁵/well were co-cultured with CD8⁺T lymphocytes, followed by phytohemagglutinin stimulation for 68 hours. T lymphocyte aggregation and proliferation were detected by staining with staining with 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester and MTT, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Different concentrations of bone marrow mesenchymal stem cells had an inhibitory effect on T lymphocytes, but this effect was weakest for the cells at the density of 1×10³ per well and strongest for the cells at the density of 1×10⁵ per well. Obvious agglomeration was observed in the same media. The proliferation rates of CD8⁺T lymphocytes were (44.83±4.92)%, (31.94±6.28)% and (15.77±3.98)%, respectively, after co-culture with 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵/well bone marrow mesenchymal stem cells. There were significant differences between groups (P < 0.05). These results showed that primary rat bone marrow mesenchymal stem cells could be obtained by direct adherence method of the whole bone marrow, and the cells could be purified by differential adherence combined with digestion and control method. Bone marrow mesenchymal stem cells could inhibit T lymphocyte proliferation in a concentration- dependent manner.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, T-Lymphocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵小强，邵明，杨海平，孙玲. 骨髓间充质干细胞分离培养方法及其对CD8⁺T淋巴细胞的免疫调控[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 682-686.

Zhao Xiao-qiang, Shao Ming, Yang Hai-ping, Sun Ling. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells and their effects on immune regulation of CD8⁺T lymphocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 682-686.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Castorina A, Szychlinska MA, Marzagalli R, et al. Mesenchymal stem cells-based therapy as a potential treatment in neurodegenerative disorders: is the escape from senescence an answer? . Neural Regen Res. 2015;10 (6): 850-858.

[2] Kim JY, Park CD,Lee JH,et al.Co-culture of melanocytes with adipose-derived stem cells as a potential substitute for co-culture with keratinocytes.Acta Derm Venereol. 2012; 92(1):16-23.

[3] Tejedor LS, Skripuletz T, Stangel M,et al.Mesenchymal stem cells require the peripheral immune system for immunomodulating effects in animal models of multiple sclerosis. Neural Regen Res. 2016;11(1): 90-91.

[4] 银广悦,陈素萍,丁俊丽,等.小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨[J].中国实验诊断学,2013,17(4):647-650.

[5] Tomar GB,Srivastava RK,Gupta N,et al.Human gingiva-derived mesenchymal stem cells are superior to bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cell therapy in regenerative medicine. Biochem Biophys Res Commun.2010; 393(3): 377-383.

[6] Guan JJ,Niu X,Gong FX,et al.Biological characteristics of human-urine-derived stem cells: potential for cell-based therapy in neurology.Tissue Eng A.2014;20:1794-1806.

[7] 张创杰,张连峰,周琳.自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌中的表达及临床意义[J].世界华人消化杂志,2015, 35(2):318-323.

[8] Fu Y,Guan J,Guo S,et al.Human urine-derived stem cells in combination with polycaprolactone/gelatin nanofibrous membranes enhance wound healing by promoting angiogenesis. J Transl Med.2014;12:274.

[9] Wang S,Li Y,Zhao J,et al.Mesenchymal stem cells ameliorate podocyte injury and proteinuria in a type 1 diabetic nephropathy rat model.Biol Blood Marrow Transplant.2013;19(4):538-546.

[10] Liu LY,Hon YS,Chai JK,et al.Basic fibroblast growth factor/vascular endothelial growth factor in the serum from severe bum patients stimulates the proliferation of cultured human umbilical cord mesenchymal stem cells via activation of Notch signaling pathways.J Trauma Acute Care Surg.2013; 75(5):789-797.

[11] 吕金,惠艳,多兰•达力汗.窄谱中波紫外线联合中药药浴治疗寻常型银屑病疗效观察[J].长春中医药大学学报,2012,28(3): 514-515.

[12] Sivamani RK,Goodarzi H,Garcia MS,et al.Biologic therapies in the treatment of psoriasis: a comprehensive evidence-based basic science and clinical review and a practical guide to tuberculosis monitoring.Clin Rev Allergy Immunol.2013;44(2): 121-140.

[13] 杨斌,邓立欢,李秉航,等.角质细胞生长因子及氯化锂诱导毛囊干细胞定向分化中的信号通路[J].中国组织工程研究,2014, 18(19):3060-3068.

[14] 王克勇,张福业,王永刚,等.人脐带间充质干细胞辅助的一种脂肪移植的实验研究[J].东南大学学报,2013,32(6):733-737.

[15] Lee Y,Jung J,Cho KJ,et al.Increased SCF/c - kit by hypoxia promotes autophagy of human placental chorionic plate - derived mesenchymal stem cells via regulating the phosphorylation of mTOR.J Cell Biochem.2013;114(1):79-88.

[16] 张瑞,刘明.球形多孔微载体支持下高密度培养人肝细胞L-02的定时形态变化[J].中国组织工程研究,2015,19(12):1924-1930．

[17] 刘芃芃,于文文,程亚楠,等.基于3D细胞培养系统的肺癌类干细胞的分离和鉴定[J].中国肿瘤临床,2014,41(16):1013-1016．

[18] 张巍,徐宏光,俞云飞.短时间机械循环压力对3D培养脊柱终板软骨细胞的影响[J].皖南医学院学报,2015,34(1):17-20．

[19] 舒申友,陈露,李雪雪,等.人体外泌汗腺细胞的三维培养及形态学观察[J].中国修复重建外科杂志,2014,28(2):162-166．

[20] Alessio N,Bohn W,Rauchberger V,et al.Silencing of RB1 but not of RB2/P130 induces cellular senescence and impairs the differentiation potential of human mesenchymal stem cells. Cell Mol Life Sci.2013;70(9):1637-1651.

[21] Kotini AG,Mpakali A,Agalioti T. Dnmt3a1 upregulates transcription of distinct genes and targets chromosomal gene clusters for epigenetic silencing in mouse embryonic stem cells.Mol Cell Biol.2011;31(7):1577-1592.

[22] Ackermann M,Lachmann N,Hartung S,et al.Promoter and lineage independent anti-silencing activity of the A2 ubiquitous chromatin opening element for optimized human pluripotent stem cell-based gene therapy. Biomaterials. 2014; 35(5):1531-1542.

[23] 李丽丽,王巧燕,代克强,等.人脐带间充质干细胞的分离、培养及其肝细胞生物学特性分析[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(2): 187-191.

[24] 刘建平,朱静,田杰,等.肿瘤微环境中过表达的IL-6对大鼠间充质干细胞恶性转化的影响[J].解放军医学杂志,2012,37(10): 930-934

[25] 任莉莉,陈丽娟,齐晖,等.胎胰蛋白促进人脂肪来源的间充质干细胞向胰岛素及C-肽阳性细胞的分化及细胞鉴定[J].吉林大学学报(医学版),2013,39(1):19-24.

[26] Erakat MS,Chuang SK,Shanti RM,et al.Interval between injury and lingual nerve repair as a prognostic factor for success using type I collagen conduit.J Oral Maxillofac Surg. 2013;71(5):833-838．

[27] 王欢,杨曦,魏琴,等.5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究[J].新疆医科大学学报,2012,35(12):1590-1594.

引言

干细胞属于是一类特殊细胞，具有无限增殖能力及多向分化潜能。根据干细胞的分化程度及分化能力可分为胚胎干细胞、诱导性多能干细胞和成体细胞，成体细胞又包括造血干细胞和间充质干细胞。间充质干细胞来源相对广泛，多在骨髓、脂肪、脐带等组织中表达，骨髓间充质干细胞因取材方便等而在临床运用最广^[1]。从功能来说，间充质干细胞主要有4方面功能：促进缺损组织修复和再生，支持肿瘤靶向治疗，免疫调节功能，支持造血干细胞重建造血。此外，间充质干细胞还对多种免疫细胞(包括树突细胞、T淋巴细胞等)具有免疫抑制作用^[2-3]。而骨髓间充质干细胞具有自我更新和多项分化功能，并且能分泌多种生长因子，包括白细胞介素6、白细胞介素11、对正常造血功能和造血细胞分化发挥作用。因此，研究骨髓间充质干细胞在免疫性疾病中治疗、预防中的作用能提高免疫性疾病治愈率^[4-5]。

临床上间充质干细胞治疗免疫性疾病的机制尚不完全知晓，并且治疗时难以保证间充质干细胞的长期疗效及安全性^[6]。CD8⁺T淋巴细胞及其激活后产生的细胞毒性T淋巴细胞，是直接参与移植物抗宿主病的主要效应免疫细胞。鉴于间充质干细胞在免疫疾病中的广泛应用，加强骨髓间充质干细胞在CD8⁺T淋巴细胞的免疫调控机制研究是目前的热点^[7]。但由于骨髓间充质干细胞含量相对较低，并且临床多需要的骨髓间充质干细胞相对较低。因此，需研究体外分离、培养及扩增足够骨髓间充质干细胞的有效方法^[8-9]。

实验探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法及其对CD8⁺T淋巴细胞免疫调控的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年1月至2016年1月在河南科技大学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级Wistar大鼠4只，雌雄随机，体质量135-160 g，平均(153±6)g，所选动物均由河南科技大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK2016-0164。实验过程中对Wistar大鼠的饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[10]。

主要仪器和试剂：陆眠灵注射液(河南科技大学附属医院)；L-DMEM培养基、胎牛血清(南美洲Hyclone公司)；青霉素和链霉素(华北制药厂)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；恒温孵育箱(德国GmbH公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

1.4 方法

骨髓间充质干细胞的分离、培养：取4只Wistar大鼠，采用陆眠灵注射液进行全身麻醉，将其浸泡在体积分数75%乙醇中(头露在外)，待麻醉生效后消毒、铺巾，在无菌条件下取Wistar大鼠两侧股骨与胫骨，去除骨表面附着的软组织，采用PBS进行3-5次清洗，利用咬骨钳切除两侧干骺骨，充分暴露骨髓腔，在4 ℃下吸取体积分数10% L-DMEM培养基冲洗骨髓，并利用离心管进行采集，反复吹打制备单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，去除上层清夜，加入体积分数2%胎牛血清、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子及L-DMEM培养基，取(1-9)×10⁹ L^-¹细胞接种在培养瓶中，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中进行培养，每天换液1次，及时清除未贴壁细胞，然后每三四天换液1次，待细胞融合80%以上后开始传代培养。加入2.5 g/L胰蛋白酶消化1.0-2.0 min，获得细胞，1 400 r/min离心7 min，完成细胞重悬，以(1-5)×10⁹ L^-¹的浓度接种在未经胶原处理的培养瓶中，10 min后转移到经I型胶原处理的培养瓶中继续培养，每3 d换液1次，将第2代骨髓间充质干细胞作为实验细胞^[11-12]。

骨髓间充质干细胞的鉴定：取第2代骨髓间充质干细胞，胰酶消化，重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，加入相应荧光染料标记的抗体，轻轻混合均匀后，避光孵育15-30 min，采用PBS冲洗，采用流式细胞仪检测细胞完成骨髓间充质干细胞的鉴定。

CD8⁺T淋巴细胞的分选：①T淋巴细胞制备：在骨髓间充质干细胞制备前，取4只Wistar大鼠新鲜外周血2 mL，肝素抗凝，采用M1640培养液进行稀释，利用吸管缓慢移到等量的Ficon分离液上，2 000 r/min离心15 min，取中间乳白色细胞层，以RPMI1640培养液洗涤2次，1 000 r/min离心15 min，将获得的细胞重悬在含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种在尼龙棉株内，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养1 h，采用含体积分数10%新生牛血清的M1640培养液清洗2次，采集冲洗滤液，1 000 r/min离心15 min，离心管下的沉淀物即为实验所需的CD8⁺T淋巴细胞^[13]。

骨髓间充质干细胞对CD8⁺T淋巴细胞的免疫调控^[14-15]：取经2.5 g/mL丝裂霉素处理的第2代骨髓间充质干细胞，分别以0，1×10³，1×10⁴，1×10⁵/well与1×10⁹ L^-¹的CD8⁺T淋巴细胞共培养，经植物血凝素刺激68 h，采用荧光CFSE法检测淋巴细胞荧光强度，MTT法检测淋巴细胞增殖率。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的形态及鉴定^[16]；②不同密度骨髓间充质干细胞对CD8⁺T淋巴细胞生长的抑制情况，观察细胞聚集情况^[17]；不同密度骨髓间充质干细胞对CD8⁺T淋巴细胞增殖的抑制作用情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理，计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

讨论

干细胞属于是一类多向分化潜能提高，能自我复制。由于骨髓间充质干细胞在人体中分布范围较广，取材相对简单，在临床运用较广泛^[19]。骨髓间充质干细胞具有免疫系统调节功能而成为研究的热点，在免疫性疾病中预防和治疗中发挥了重要作用^[19]。早在1976年，国外学者第一次采用体外方法从骨髓中分离出能贴壁的细胞，后研究将其拟定为骨髓间充质干细胞^[20-21]。

通常来说，人体中骨髓间充质干细胞含量相对较低，而细胞在体外具有扩增能力，但其具体分离、培养方法尚缺乏统一的标准^[22]。目前，骨髓间充质干细胞分离培养方法较多，包括全骨髓法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法等，这些方法在骨髓间充质干细胞分离培养中各有优缺点，均能获得纯度较高的细胞，但细胞数量相对有限，难以满足实验需要^[23]。鉴于骨髓间充质干细胞培养方法，研究中采用全骨髓直接贴壁法获得原代大鼠骨髓间充质干细胞，采用差速贴壁联合消化控制法完成细胞纯化，该分离培养方法能结合不同细胞培养方法的优势，不仅操作简单，还能完成细胞的进一步纯化，能获得数量较多、质量较高的骨髓间充质干细胞。研究中，刚刚接种的原代骨髓间充质干细胞呈圆形，培养24 h后部分细胞开始贴壁，呈椭圆形或多边形；培养48 h后细胞生长迅速，多为贴壁伸展细胞；原代细胞培养七八天后融合90%；传代细胞培养 1 h后有少许细胞贴壁，24 h后几乎全部细胞贴壁。由此看出分离培养的骨髓间充质干细胞符合干细胞特性^[24-25]。从骨髓间充质干细胞生长周期来说，细胞生长起初处于适应状态，该时间段细胞增殖相对缓慢，然后过度到对数生长期、抑制期，细胞的生长具有高分化潜能。研究中，制备的骨髓间充质干细胞在一二天生长相对缓慢，属于细胞生长的适应期；3 d后细胞生长迅速，步入对数生长期；第6天后细胞进入抑制期，生长相对缓慢。目前，对于骨髓间充质干细胞尚未发现特异性标志物，CD29、CD105、CD166属于公认的阳性标志，而CD34及CD45是公认的阴性标志，利用上述标志物能完成细胞的鉴定。研究中流式细胞仪鉴定显示，骨髓间充质干细胞表面标记物CD29、CD105、CD166阳性，HLA-DR为弱表达，细胞表面不表达CD34及CD45，提示分离培养的干细胞为骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞具有弱免疫原性，对T淋巴细胞的作用并不会受到主要组织相容性复合物的限制，并且无论骨髓间充质干细胞源于自供体、受体还是第三者均会产生类似的免疫调节功能。研究中将不同密度的骨髓间充质干细胞与CD8⁺T淋巴细胞进共培养，结果显示不同密度骨髓间充质干细胞对CD8⁺T淋巴细胞聚集均有抑制作用，1×10³/well组抑制能力最弱，形成集落现象；1×10⁵/well组抑制能力最强，细胞未见明显聚集现象。由此看出，骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞的增殖^[26]。骨髓间充质干细胞能分泌PGEZ，抑制T淋巴细胞增殖^[27]。研究中， 1×10³，1×10⁴，1×10⁵/well组CD8⁺T淋巴细胞增殖率分别为(44.83±4.92)%、(31.94±6.28)%及(15.77±3.98)%，3组两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。由此看出，骨髓间充质干细胞在抑制T淋巴细胞免疫增殖时呈现浓度依赖性。文献报道显示，骨髓间充质干细胞与脐血充质干细胞的免疫调控作用与细胞数量有关，如果数量过低，调控作用尚不确定，需要进一步研究和探讨。

综上所述，采用全骨髓直接贴壁法能获得原代大鼠骨髓间充质干细胞，采用差速贴壁联合消化控制法能完成细胞纯化，骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞增殖并呈浓度依赖性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程