骨髓间充质干细胞对经转化生长因子β1、骨桥蛋白基因沉默肝癌细胞MHCC97-H的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (5): 687-692.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.006

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骨髓间充质干细胞对经转化生长因子β1、骨桥蛋白基因沉默肝癌细胞MHCC97-H的影响

李天然¹，黄晓斌²，黄楚恒²，卢光明³，李延军³

1解放军总医院第一附属医院放射科，北京市 100048
2解放军第九五医院放射科，福建省莆田市 351100
3解放军南京总医院医学影像科，江苏省南京市 210000

出版日期:2017-02-18 发布日期:2017-03-20
通讯作者: 卢光明，主任医师，教授，博士生导师，解放军南京总医院医学影像科，江苏省南京市 210000
作者简介:李天然，男，1970 年生，黑龙江省富锦市人，汉族，2012 年北京大学医学部毕业，博士后，副主任医师，主要从事肝癌分子影像学研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81271607)；南京军区医药卫生重点资助项目(11Z035)；中国博士后基金(2015M572810)

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on MHCC97-H cells after transforming growth factor beta1 and osteopontin gene interference

Li Tian-ran¹, Huang Xiao-bin², Huang Chu-heng², Lu Guang-ming³, Li Yan-jun³

1Radiology Department of the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
2Radiology Department of Chinese PLA 95th Hospital, Putian 351100, Fujian Province, China
3Radiology Department of Chinese PLA Nanjing General Hospital, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Online:2017-02-18 Published:2017-03-20
Contact: Lu Guang-ming, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Radiology Department of Chinese PLA Nanjing General Hospital, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China
About author:Li Tian-ran, M.D., Associate chief physician, Radiology Department of the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81271607; the Key Medicine and Health Funding Project of the Nanjing Military Region of Chinese PLA, No. 11Z035; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2015M572810

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因沉默技术：双链RNA被特异的核酸酶降解，产生小干扰RNA，这些小干扰RNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
骨桥蛋白：为一种分泌型磷酸化糖蛋白，其分子结构中含有RGD多肽序列，骨桥蛋白主要通过与其受体整合素相互作用，参与肿瘤转移的多个过程。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞对肝癌增殖能力和转移能力的影响是研究的热点，可通过基因工程技术对肝癌细胞进行改造，使其降低生物活性因子的表达，从而寻找合适的干预靶点，提高骨髓间充质干细胞的干预效能。
目的：经转化生长因子β1、骨桥蛋白基因沉默的高转移潜能肝癌细胞(MHCC97-H)与骨髓间充质干细胞共培养，观察MHCC97-H细胞侵袭能力的变化，并通过动物模型荧光成像观察骨髓间充质干细胞对MHCC97-H肝癌组织动物模型的干预作用。
方法：①将MHCC97-H细胞细胞分为4组，MHCC97-H设为空白对照组，MHCC97-H基因沉默转染阴性对照为阴性对照组，MHCC97-H-转化生长因子β1为转化生长因子β1基因沉默组，MHCC97-H-骨桥蛋白为骨桥蛋白基因沉默组；②Transwells法进行各组细胞与骨髓间充质干细胞共培养实验，48 h后结晶紫染色，随机取3个视野，计数；③结合有红色荧光蛋白基因的各组MHCC97-H细胞株，分别自裸鼠右侧腋下接种复制皮下移植瘤模型。肿瘤体积到50 mm3开始瘤内注射骨髓间充质干细胞，4周后进行荧光强度分析；肝癌组织冰冻切片二脒基苯基吲哚细胞核染色后行荧光显微镜观察。
结果与结论：①细胞计数结果表明，骨髓间充质干细胞使经基因沉默后的MHCC97-H细胞迁移数量明显减少；结晶紫染色病理图片显示，经基因修饰的MHCC97-H细胞迁移能力明显降低；②体内荧光成像结果显示，骨桥蛋白基因沉默组肿瘤体积明显缩小，荧光亮度低于其他组别，定量结果显示骨桥蛋白基因沉默组吸光度值明显降低，表明骨髓间充质干细胞对经骨桥蛋白干扰的MHCC97-H高转移潜能肝癌动物模型干预效能最佳；③病理切片荧光观察结果显示，骨髓间充质干细胞主要分布在肿瘤坏死区附近，骨桥蛋白基因沉默组荧光表达较转化生长因子β1基因沉默组和空白对照组多，表明MHCC97-H细胞经骨桥蛋白基因沉默后骨髓间充质干细胞在肿瘤中的分布增多；④结果提示，通过抑制骨桥蛋白和转化生长因子β1两种因子的表达可以降低肝癌细胞侵袭能力，经骨桥蛋白沉默可能更有利于基于骨髓间充质干细胞的生物治疗。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7033-2092(李天然)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 肿瘤, 骨髓间充质干细胞, 转化生长因子β1, 骨桥蛋白, MHCC97-H细胞, 动物模型, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are the focus of research on the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma cells. By genetic engineering techniques, the hepatocellular carcinoma cells can be induced to reduce the expression of bioactive factors, thereby seeking suitable intervention targets for improving the interventional effect of BMSCs.
OBJECTIVE: To silence the expression of transforming growth factor beta1 (TGFβ1) and osteopontin (OPN) in high metastatic potential hepatocellular carcinoma cells (MHCC97-H) followed by co-culture with BMSCs and then to observe the change of MHCC97-H cell invasion ability as well as the interventional effect of BMSCs on the animal model of hepatocellular carcinoma tissue MHCC97-H by fluorescence imaging in vivo.
METHODS: MHCC97-H cells were divided into four groups: MHCC97-H group was set as a blank control group, and MHCC97-H NC siRNA as negative control group, and MHCC97-H siRNA TGFβ1 and siRNA OPN were experimental groups. Transwells assay was carried out for co-culture experiments. After 48 hours of co-culture, crystal violet staining was performed for cell counting in three randomly selected fields of vision. Combined with the red fluorescence protein gene, MHCC97-H cell lines in each group were inoculated via the right subaxillary subcutaneous transplantation to make a tumor model in nude mice. When the tumor volume was up to about 50 mm3, BMSCs were injected into the tumor in the nude mice, and 4 weeks later, fluorescence images were analyzed using software for fluorescence intensity. Frozen hepatocellular carcinoma tissue sections were taken for 4’,6-diamidino-2-phenylindole staining and fluorescence microscope observation.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell counting results showed that BMSCs significantly decreased MHCC97-H cells after gene silencing, and crystal violet staining showed that the migration ability of MHCC97-H cells was significantly decreased. Tumor volume shown by the fluorescence imaging was significantly reduced after the OPN gene transfection, the fluorescence intensity was lower than that in the other groups, and quantitative results showed that the absorbance value of OPN shRNA cells decreased significantly compared with other groups, indicating the BMSCs exhibit best interventional effectiveness in OPN-silenced MHCC97-H cells. Pathological sections showed that BMSCs were mainly distributed in the tumor necrosis area, and the fluorescence expression in the OPN siRNA group was more than that in the TGFβ1 siRNA group and the blank control group, indicating that after OPN gene silencing of MHCC97-H cells, the distribution of BMSCs in the tumor was increased. To conclude, it is able to reduce the invasive ability of hepatocellular carcinoma cells by inhibiting the expression of OPN and TGF β1 factors, and OPN silencing may be more conductive to BMSCs biotherapy.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Bone Marrow, Liver Neoplasms, Models, Animal

中图分类号:

R394.2

李天然，黄晓斌，黄楚恒，卢光明，李延军. 骨髓间充质干细胞对经转化生长因子β1、骨桥蛋白基因沉默肝癌细胞MHCC97-H的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 687-692.

Li Tian-ran, Huang Xiao-bin, Huang Chu-heng, Lu Guang-ming, Li Yan-jun . Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on MHCC97-H cells after transforming growth factor beta1 and osteopontin gene interference[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 687-692.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 24只裸鼠制备皮下移植瘤模型，所有动物肿瘤均接种成功，分为4组进行实验干预。

2.2 Transwells法迁移MHCC97-H细胞计数结果 实验中阴性对照组迁移细胞数为(139.67±14.01)个，转化生长因子β1基因沉默组迁移细胞数为(45.67±3.51)个，骨桥蛋白基因沉默组迁移细胞数为(69.67±7.02)个，空白对照组迁移细胞数为(196.00±14.42)个。组间比较见图1。

结果显示，各组间比较差异有显著性意义(F=7.461，P < 0.001)，表明经基因沉默后细胞迁移数量明显减少，尤其是骨桥蛋白基因沉默组和转化生长因子β1基因沉默组细胞迁移数量显著减少。

2.3 Transwells法迁移MHCC97-H细胞的病理学染色结果 MHCC97-H细胞结晶紫染色，光镜下观察。结果显示，经基因修饰的MHCC97-H细胞迁移能力明显降低(见图2)。

2.4 骨髓间充质干细胞对MHCC97-H细胞的干预情况荧光成像 与阴性对照组比较，骨桥蛋白基因沉默组肿瘤体积明显缩小，荧光亮度降低；而转化生长因子β1基因沉默组肿瘤大小和荧光强度与阴性对照组大致相仿(见图3)。

2.5 Image J软件分析荧光成像数据吸光度(A)定量分析 分析骨髓间充质干细胞对经基因干扰肝癌的影响情况，由图4可见，骨桥蛋白基因沉默组A值明显降低，与阴性对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，表明骨髓间充质干细胞对经骨桥蛋白干扰的高转移潜能肝癌(MHCC97-H)动物模型干预效能最佳。

2.6 骨髓间充质干细胞对高转移潜能肝癌(MHCC97-H)干预情况 病理切片荧光成像由镜下观察可见，骨髓间充质干细胞主要分布在肿瘤坏死区附近，骨桥蛋白基因沉默组荧光表达较转化生长因子β1基因沉默组和空白对照组多，表明MHCC97-H细胞经骨桥蛋白基因沉默后，骨髓间充质干细胞在肿瘤中的分布增多(图5)。

参考文献

[1] 郭晓钟,刘旭,王迪,等.自体骨髓干细胞移植对不同病因肝硬化的疗效研究[J]. 中华消化杂志,2011,31(1):53-54.

[2] Vainshtein JM, Kabarriti R, Mehta KJ, et al. Bone marrow-derived stromal cell therapy in cirrhosis: clinical evidence, cellular mechanisms, and implications for the treatment of hepatocellular carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2014,89(4):786-803.

[3] 李天然,卢光明,宋斌,等. hMSC对高低转移潜能肝癌细胞影响的实验研究[J].胃肠病学与肝病学杂志,2014,23(9):1056-1060.

[4] Li G, Zhang H, Zhao Q, et al.Mesenchymal stem cells promote tumor angiogenesis via the action of transforming growth factor β1. Oncol Lett. 2016;11(2): 1089-1094.

[5] Liu GK,Fan XY,Tang M, et al. Osteopontin induces autophagy to promote chemo-resistance in human hepatocellular carcinoma cells. Cancer Lett. 2016;383(2): 171-182.

[6] 舒宏,康晓楠,刘银坤.肝癌转移、复发预测的蛋白质分子标志物[J].世界华人消化杂志, 2010,18(13):1350-1355.

[7] 徐冰,姚明. 国内肝癌转移动物模型研究概况[J].中国医学工程, 2012,20(5):184-187.

[8] 汤钊猷. 转移复发一肝癌研究的重中之重[J].中华消化外科杂志, 2007,6(1):2.

[9] Tian MM, Cheng H, Wang ZQ, et al. Phosphoproteomic Analysis of the Highly-Metastatic Hepatocellular Carcinoma Cell Line, MHCC97-H. Int J Mol Sci. 2015;16(2): 4209-4225.

[10] Lin WF, Zhong MF, Liang SF,et al. Emodin inhibits migration and invasion of MHCC-97H human hepatocellular carcinoma cells. Exp Ther Med. 2016;l(12):3369-3374.

[11] Wang G,Chen S,Zhao C,et al. Comparative analysis of gene expression profiles of OPN signalling pathway in four kinds of liver diseases. J of Genet. 2016;95(3):741-750.

[12] Wang G, Li, X, Chen S, et al. Expression profiles uncover the correlation of OPN signaling pathways with rat liver regeneration at cellular level. Cell Biol Int.2015;39(11): 1329-1340.

[13] 李天然,蔡立杰,赵绍宏,等.骨桥蛋白转染骨髓间充质干细胞对高转移潜能肝癌细胞的影响[J].胃肠病学与肝病学杂志,2015, 24(9):1057-1061.

[14] 李天然,杜湘珂,宋斌,等. 转化生长因子β1转染hMSC对MHCC97-H影响的实验研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2013, 22(7):615-619.

[15] 刘昆鹏,张炳远,卢云,等.Transwell侵袭实验测定M受体对胆管癌细胞侵袭的影响[J].国际外科学杂志, 2011,38(5):298-301.

[16] Inoue M, Shinohara ML. Intracellular osteopontin (iOPN) and immunity. Immunol Res 2011;49:160-172.

[17] Xie H, Song J, Du R et al. Prognostic significance of osteopontin in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma. Dig Liver Dis 2007;39:67-172.

[18] Sodek J, Zhu B, Huynh MH, et al. Novel functions of the matricellular proteins osteopontin and osteonectin/SPARC. Connect Tissue Res. 2002;43:308-419.

[19] Rangaswami H, Bulbule A, Kundu C. Nuclear factor-inducing kinase plays a crucial role in osteopontin-induced MAPK/I kappa B alpha kinase-dependent nuclear factor kappa B-mediated promatrix metalloproteinase-9 activation.J Biol Chem.2004;279(37):921-935.

[20] Huang H, Zhang XF, Zhou HJ, et al. Expression and prognostic significance of osteopontin and caspase-3 in hepatocellular carcinoma patients after curative resection. Cancer Sci. 2010;101:1314-1319.

[21] Phillips RJ, Helbig KJ, Van der Hoek KH, et al. Osteopontin increases hepatocellular carcinoma cell growth in a CD44 dependant manner. World J Gastroenterol. 2012;18: 3389- 3399.

[22] Li TR, Zhao S, Song B, et al. Effects of transforming growth factor β-1 infected human bone marrow mesenchymal stem cells on high- and low-metastatic potential hepatocellular carcinoma. Eur J Med Res. 2015;20(1):56.

[23] Scaggiante B, Kazemi M, Pozzato G, et al. Novel hepatocellular carcinoma molecules with prognostic and therapeutic potentials. World J Gastroenterol. 2014;20(5): 1268-1288.

[24] Lee D, Chung YH, Kim JA, et al. Transforming growth factor beta 1 overexpression is closely related to invasiveness of hepatocellular carcinoma. Oncology. 2012;82:11-18.

[25] Okumoto K, Hattori E, Tamura K, et al. Possible contribution of circulating transforming growth factor-beta1 to immunity and prognosis in unresectable hepatocellular carcinoma. Liver Int. 2004;24:21-28.

[26] Mazzocca A, Fransvea E, Dituri F, et al. Down-regulation of connective tissue growth factor by inhibition of transforming growth factor beta blocks the tumor-stroma cross-talk and tumor progression in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2010;51:523-534.

[27] Giannelli G, Bergamini C, Fransvea E, et al. Laminin-5 with transforming growth factor-beta1 induces epithelial to mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2005;129:1375-1383.

[28] van Zijl F, Mair M, Csiszar A, et al. Hepatic tumor-stroma crosstalk guides epithelial to mesenchymal transition at the tumor edge. Oncogene. 2009;28:4022-4033.

[29] Mima K, Hayashi H, Kuroki H, et al. Epithelial-mesenchymal transition expression profiles as a prognostic factor for disease-free survival in hepatocellular carcinoma: Clinical significance of transforming growth factor-β signaling. Oncol Lett. 2013;5:149-154.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞水平的对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2014年1月至2015年12月在浙江杭州赫贝科技有限公司完成。

1.3 材料

1.3.1 动物分组 24只6周SPF级裸鼠，雌雄各半，体质量14-17 g，饲养在解放军总医院第一附属医院动物实验中心，动物实验符合国际标准(NIH Publication No.85-23, revised 1996)。按随机数字表法分为4组，每组6只，分别为空白对照组、阴性对照组、转化生长因子β1基因沉默组、骨桥蛋白基因沉默组。

1.3.2 实验细胞及分组 高转移潜能肝癌细胞(MHCC97-H)设为空白对照组，MHCC97-H-阴性对照为基因沉默转染阴性对照组，MHCC97-H-转化生长因子β1为转化生长因子β1基因沉默组，MHCC97-H-骨桥蛋白为骨桥蛋白基因沉默组。肝癌细胞由杭州赫贝科技有限公司提供，骨髓间充质干细胞由赛业(广州)生物科技有限公司提供。

1.3.3 实验试剂 DMEM培养基，Gibco公司；胎牛血清，BI公司；青-链霉素(100×P.S.)，杭州昊天生物技术有限公司；胰蛋白酶(trypsin)，Gibco公司；PBS，国药化学试剂有限公司；戊巴比妥钠，SIGMA-ALDRICH，批号：120505。

1.3.4 实验仪器及设备 二氧化碳培养箱3111型，Thermo公司；显微镜IX73型，OLYMPUS公司；超净工作台(SW-CF-2FD型)，苏州净化设备有限公司；台式低速离心机(TDZ4-WS型)，湖南湘仪离心机仪器有限公司；细胞培养瓶，Corning公司；正置荧光显微镜(BX43型)，OLYMPUS公司；小动物活体成像系统为CARESTREM Image Sation System，型号为Multimodal Pro Light Source 400 W，配套使用的软件是Carestream Molecular Imaging(MI)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 空白对照组、阴性对照组、转化生长因子β1基因沉默组、骨桥蛋白基因沉默组细胞均用体积分数10%胎牛血清 1×P.S. DMEM 培养基，37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱孵育培养，使用PBS清洗，0.25% Trypsin+0.02%EDTA 消化细胞进行传代培养并调整细胞状态。骨髓间充质干细胞用体积分数10%胎牛血清1×P.S.MSCM+ L-Glutamine 培养基，37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱孵育培养，使用PBS清洗，0.25%Trypsin+0.02%EDTA 消化细胞进行传代培养并调整细胞状态。

1.4.2 MHCC97-H细胞与骨髓间充质干细胞共培养迁移实验 取生长对数期各组MHCC97-H细胞，0.25%Trypsin + 0.02% EDTA 消化离心，计数后，以5×10⁴/孔浓度分组铺24孔板上室，下室加入 2×10³个/孔骨髓间充质干细胞， 37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱孵育培养。48 h后PBS清洗1次，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，取出，用棉签擦去上室非迁移细胞，移去 transwells，倒置，风干，在24孔板中加入200 μL 0.1%结晶紫，把小室放入其中，室温孵育10 min，取出，PBS清洗3次，随机取3个视野，照相，计数，统计结果。

1.4.3 裸鼠皮下移植瘤模型进行荧光活体成像 收集处于对数生长期的各组MHCC97-H细胞株，基因沉默组结合有红色荧光蛋白基因。各组细胞株分别自裸鼠左侧腋下接种相应组别细胞悬液0.2 mL，含细胞数5×10⁶个/只，复制4组裸鼠皮下移植瘤模型。肿瘤体积到50 mm³左右开始瘤内注射骨髓间充质干细胞，1×10⁵/只，2次/周，连续4周。4周后进行在体荧光成像，预先打开活体成像仪20 min，将CCD相机冷却到-25 ℃以下。检测前使用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉裸鼠，按照组别顺序排列在活体成像仪拍摄仓内。检测对象为RFP，使用激发光55 nm、与600 nm发射光检测，曝光时间为10 s。同时在无激发光、发射光条件下，0.17 s拍摄，保存明场图像，荧光图像采用软件进行荧光强度分析。

1.4.4 病理及荧光显微镜观察 肝癌组织于-20 ℃冰冻切片，厚度为6 μm，DAPI染核10 min，甘油PBS封固，置于荧光显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞干预4周后，观察裸鼠皮下移植瘤模型荧光活体成像实验中的荧光强度。

1.6 统计学分析 数据采用SPSS 16.0统计软件处理，组间比较采用One-Way ANOVA检验进行分析，以α=0.05为检验水准。

讨论

肝癌转移行为是肝癌研究的重点方向之一，肝癌的转移行为是影响患者预后的关键因素之一^[6-7]。2007年汤钊猷院士根据国际抗癌联盟肝癌TNM分期(2002年版)，将旧版(1997年)中所有大于或小于2 cm的字样删去，而保留血管有无侵犯的表述指出“肿瘤大小曾经是影响预后的重要因素，但根本的因素是肿瘤的生物学特性，而癌的转移复发正是癌生物学特性最集中的表现^[8]”，这说明肝癌转移行为研究具有的重要意义。肝癌组织的转移是影响肝癌预后的最重要的因素，研究肝癌转移潜能的变化的生物学机制，可以寻找合适的干预办法，阻止或减少肝癌转移的发生，延长患者的生命，改善生活质量。由上海复旦大学肝癌研究所构建的具有高低转移潜能肝癌细胞系(MHCC97-H和MHCC97-L)成为研究肝癌转移行为的最佳生物模型，该细胞系来源于人肝癌细胞，具有高肺脏转移的特点^[9-10]。骨桥蛋白是与转移相关的生物因子，通过与整合素αvβ3相结合而促进肿瘤的转移^[11-12]。前期作者的研究表明，外源性骨桥蛋白通过抑制MHCC97-H细胞释放内源性骨桥蛋白而发挥促进肿瘤侵袭的作用，主要通过激活基质金属蛋白酶2因子发挥作用^[13]。另外，前期研究还发现，转化生长因子β1与肿瘤的增殖行为有关，在高低转移潜能肝癌细胞亦存在差异^[14]。本研究通过基因工程技术手段，分别沉默(基因沉默)MHCC97-H细胞中这2种基因，使之减少表达骨桥蛋白、转化生长因子β1的生物活性因子，观察骨髓间充质干细胞对其转移潜能和增殖能力的影响情况。

实验采用transwell侵袭小室技术，该技术是利用Matrigel模拟人基底膜结构，观察具有侵袭和迁移能力的细胞穿过多孔滤膜的情况^[15]。实验结果显示，骨髓间充质干细胞使经骨桥蛋白基因沉默的MHCC97-H对基底膜侵袭能力明显下降，这说明骨髓间充质干细胞使经骨桥蛋白基因沉默的MHCC97-H迁移能力明显减低，骨桥蛋白是影响肝癌转移的因子。基础研究表明，骨桥蛋白在肝癌细胞株SK-Hep-1中高表达，在Hep3B细胞株中度表达，在CCL13细胞株低表达，与各自的体外侵袭力相对应，骨桥蛋白抗体可以明显阻断SK-Hep-1、Hep3B和其他5个肝癌细胞株体外侵袭性^[16]。研究表明，通过基因沉默技术使MHCC97-H细胞系HCCLM3骨桥蛋白基因沉默，结果显示, HCCLM3中骨桥蛋白的表达明显下降，且显著降低其侵袭力，但对细胞增殖力影响不大^[17]。骨桥蛋白是一种分泌型细胞外基质蛋白, 其分子中含有RGD(Arg-Gly-Asp)三肽序列，RGD可通过与细胞膜表面受体αvβ3整合素结合产生促进转移的作用^[18]。有研究认为骨桥蛋白通过IκB/IKK信号激活加快肿瘤细胞周围型胶原等细胞外基质降解, 同时激活Pro-MMP2(基质金属蛋白酶2酶原)为基质金属蛋白酶2因子，促进肿瘤转移^[19]。因此阻断MHCC97-H中骨桥蛋白的表达，可以降低转移的发生率，同时经骨髓见充值干细胞干预后，抑制转移的效果更加明显。动物模型实验结果与细胞学实验结果相近，经骨桥蛋白基因沉默后，与阴性基因对照组比较，经骨髓间充质干细胞干预后A值明显降低，表明其转移潜能明显下降。有研究也证实，通过在高转移潜能裸鼠动物模型敲除骨桥蛋白基因，则可明显阻止肝癌的生长和肺脏转移^[20]。转染骨桥蛋白的人肝癌SMMC-7721细胞系明显增加了肝癌的侵袭和转移能力，但增殖能力没有增加^[21]。

研究另一重要的发现是骨髓间充质干细胞使经转化生长因子β1基因沉默的MHCC97-H细胞侵袭能力降低。在细胞学水平实验显示，转移潜能减低较为明显，而在动物实验水平降低不明显，与阴性对照组比较差异无显著性意义。细胞学实验结果与动物模型实验结果的差异性是可能是由于细胞学实验因素单一，而动物模型实验属于体内实验，影响因素较为复杂有关。此外，本动物模型实验结果还提示，骨髓间充质干细胞对经骨桥蛋白基因沉默的MHCC97-H细胞的干预效果高于经转化生长因子沉默的MHCC97-H细胞组，说明骨髓间充质干细胞对于骨桥蛋白基因沉默组可能干预效果更好，更有利于基于骨髓间充质干细胞的生物治疗。转化生长因子β1是一种具有多种功能的细胞因子，通过多种途径促进肿瘤的侵袭和转移，有研究认为，转化生长因子β1通过诱导整合素的表达变化而起到促进和抑制肿瘤转移的作用^[22]。大多数细胞能够分泌转化生长因子β，转化生长因子β能够通过旁分泌机制促进HCC的进展^[23]。在正常情况下，转化生长因子β1能够阻止细胞增殖，诱导细胞分化，促进细胞凋亡。在细胞癌变早期，转化生长因子β1不在阻止细胞增殖，而是促进细胞过度增殖。在肿瘤进展时期，转化生长因子β1成为促进肿瘤纤维组织增生、血管化、免疫抑制以及肿瘤的侵袭等方面关键因子^[24-25]。在促进HCC侵袭和转移机制方面，转化生长因子β1通过上皮向间质转化刺激基因重组因子增殖而促进HCC的侵袭，一旦基因重组因子被激活，基因重组因子能够调控肿瘤的生长、肿瘤内的血管化、HCC细胞的向外播散^[26]。反之，转化生长因子β受体能够明显减少肿瘤的基质成分，并且通过减少基因重组因子的增殖减少HCC的转移^[27]。转化生长因子β激活基因重组因子可能是通过下调E-钙黏蛋白和上调Snail/PDGF信号通路实现的^[28-29]，因此，E-钙黏蛋白表达减少与肝细胞癌的低分化和较短的生存期有关。

研究结果显示，骨桥蛋白和转化生长因子β1是MHCC97-H细胞重要的转移相关因子，通过抑制2种因子的表达骨髓间充质干细胞可以降低肝癌细胞侵袭能力，但经骨桥蛋白沉默可能更有利于基于骨髓间充质干细胞的生物治疗。因此，通过基因工程技术，对MHCC97-H细胞进行修饰，寻找影响肝癌转移潜能的关键因子，探索抑制肝癌转移的方法，可为临床肝癌的治疗提供依据。

骨髓间充质干细胞对经转化生长因子β1、骨桥蛋白基因沉默肝癌细胞MHCC97-H的影响

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on MHCC97-H cells after transforming growth factor beta1 and osteopontin gene interference

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[3]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1187-1193.
[4]	李志一, 贺鹏程, 边天月, 肖玉霞, 高璐, 刘华胜. 铁死亡机制研究的文献计量学与可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1202-1209.
[5]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[6]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[7]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[8]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[9]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[10]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[11]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[12]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[13]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[14]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[15]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.