磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料填充桡骨缺损的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
磷酸钙骨水泥：是一种可降解生物材料，由一种或几种磷酸钙盐固体与液体混合而成。磷酸钙骨水泥材料具有许多的生物学优点，主要有生物降解性、骨引导活性、一定的抗压强度，是临床上较好的骨替代材料。但是，磷酸钙降解速度较慢，自身有一定脆性，显著限制了其在临床中的应用。
纤维蛋白凝胶：主要由天然细胞外基质成分构成，具有良好的生物相容性、有效的生物活性及生物可降解性，同时还具有三维多孔结构和良好的可塑性。研究发现纤维蛋白凝胶在体内的代谢过程可产生多种细胞因子，促进骨组织再生。

背景：磷酸钙骨水泥与人体自身骨矿物的化学组成和结构相似，能够填充因骨折造成的骨质塌陷，具有诱导成骨作用，但其降解速度较慢。
目的：评估磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料的生物相容性及修复桡骨缺损的可行性。
方法：①体外细胞毒性实验：分别以磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶材料浸提液、苯酚溶液，含体积分数为10%胎牛血清RPMI1640培养液培养小鼠成纤维细胞，检测细胞毒性分级；②血液相容性实验：在兔抗凝血中分别加入磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶材料浸提液、生理盐水及双蒸水，检测溶血率；③取45只新西兰大白兔，制备双侧桡骨缺损模型，随机分3组，空白对照组不进行任何干预，实验组与骨缺损处植入磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，对照组植入自体桡骨。术后4，8，16周，进行X射线、组织学、骨密度及生物力学检测。
结果与结论：①细胞毒性：磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶材料浸提液的毒性为0至1级；②血液相容性：磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶材料的溶血率为3.15%；③体内修复实验：术后16周，X射线显示，实验组和对照组骨折线完全消失，髓腔复通，塑性完全；组织学显示，对照组骨小梁重建较明显，板层骨较成熟，髓腔再通，实验组有大量新生编织骨成网格状长入材料中，材料降解明显，降解与骨长入同步；实验组与对照组骨密度、最大负荷、最大应力和破坏能量均明显高于空白对照组(P < 0.05)，实验组与对照组各指标比较差异无显著性意义；④结果表明：磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料具有良好的生物相容性，修复骨缺损可促进骨组织再生，获得与自体骨移植基本相当的治疗效果。

ORCID: 0000-0002-5443-5849(黄田)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 桡骨缺损, 磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶, 生物相容性, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: The chemical compositions and structure of calcium phosphate bone cement are similar to those of human bone, which can fill the bone collapse caused by fracture and induce osteogenesis, but its degradation rate is slow.
OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility of the calcium phosphate cement/fibrin glue and the feasibility of repairing radius defects.
METHODS: In vitro cytotoxicity experiment: Mouse fibroblasts were cultured in the calcium phosphate bone cement/fibrin glue extracts, phenol solution, and RPMI 1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum, respectively, to detect the cytotoxicity grade. Hemocompatibility experiment: Calcium phosphate bone cement/fibrin glue extracts, normal saline and distilled water were respectively added into the rabbit anticoagulation, to detect the hemolytic rate. Forty-five New Zealand white rabbits were enrolled and modeled into bilateral radius defects, followed by randomly allotted into three groups: blank control group without any intervention, experimental and control groups were given the implantation with calcium phosphate bone cement/fibrin glue and autologous radius, respectively. X-ray, histology, bone mineral density and biomechanical test were performed at postoperative 4, 8 and 16 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: The toxicity grade of the calcium phosphate cement/fibrin glue was 0 to 1. The hemolytic rate of the calcium phosphate cement/fibrin glue was 3.15%. At 16 weeks postoperatively, X-ray showed that in the experimental and control groups, the fracture line disappeared completely, pulp cavity was recanalized, and in plastic completely. Histology showed that the reconstructed bone trabecular was obvious, plate layer of bone was mature, and medullary cavity recanalization appeared in the control group; there were a large number of new grid-shaped woven bone tissues growing into the material in the experimental group, with overt degradation, and degradation rate was in parallel to bone ingrowth. The bone density, the maximum load, maximum stress and failure energy in the experimental and control groups were significantly higher than those in the blank control group (P < 0.05), and all above indicators showed no significant differences between the experimental and control groups. These results manifest that the calcium phosphate bone cement/fiber protein glue composite material holding a good biocompatibility can promote bone tissue regeneration for bone defect repair, achieving similar curative effect with autologous bone transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Fibrin Tissue Adhesive, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄田，郑南生，张育专，吴永乐，王刚. 磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料填充桡骨缺损的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(52): 7829-7835.

Huang Tian1, Zheng Nan-sheng2, Zhang Yu-zhuan1, Wu Yong-le1, Wang Gang1.

Biocompatibility of calcium phosphate cement/fibrin glue in filling radius defects

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(52): 7829-7835.

图/表（结果） 8

2.1 细胞毒性实验结果倒置显微镜下观察阳性对照组细胞几乎完全破坏，呈现明显的细胞毒性；阴性对照细胞贴壁生长良好，呈长梭形，无细胞破坏；实验组细胞形态与阴性对照组基本相同(图1)。MTT检测结果显示，实验组培养24，48，72 h的细胞相对增殖率分别为95.49%、101.12%、103.12%，该磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料细胞毒性评级为1级或0级。实验组各时间点吸光度值与阳性对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.2 血液相容性实验结果阳性对照组有溶血，实验组和阴性对照组无溶血发生。阴性对照组、阳性对照组、实验组的吸光度值分别为0.021 2±0.000 6，0.987 5± 0.012 9，0.345 1±0.001 8，计算磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料的溶血率为3.15%<5%，符合国家医疗器械生物学评价标准。

2.3 体内修复实验结果

2.3.1 一般情况分析术后所有动物全身状况良好，饮食、活动等均正常。术后7 d内，部分术区周围有一定程度肿胀，未进行特殊处理肿胀自行消退，术后创口均未出现感染现象。无死亡，所有动物均计入实验统计。

2.3.2 各组大体标本观察结果见图2。

术后4周时，实验组纤维蛋白完全吸收，植入物两端有大量骨痂形成，植入物与断端界限不清；自体骨组植入的自体骨大部分吸收，也有大量骨痂形成，植入骨与断端界限不清。术后8周时实验组植入物完全骨化，被大量骨痂包埋，形成的新骨较4周明显增多；自体骨组缺损区充满新生骨，覆盖板层骨。术后16周时，实验组植入物完全骨化，材料部分降解，缺损区骨端皮质连续，塑性完整；自体骨组缺损区消失，塑性完全，新骨成熟。空白对照组至术后16周时缺损区未有新骨组织生成，仅见软组织，断端少量骨痂形成，无骨性连接。

2.3.3 影像学检查评分结果见图3。

术后第4周，实验组骨缺损区已模糊，断端界限不清，新生骨痂密度增高；自体骨组骨折线模糊减少，骨痂密度增高。术后第8周，实验组骨缺损区密度较之前明显增高，骨折周围界限模糊不清；自体骨组骨折线基本消失，骨皮质形成，髓腔复通。术后16周，实验组和自体骨组骨折线完全消失，髓腔复通，塑性完全。至术后16周空白对照组仅少量骨痂形成，无新生骨代替，边界硬化。

Lane-Sandhu X射线评分析结果表明随时间增加，实验组和自体骨组X射线片评分逐渐增高，实验组、自体骨组Lane-Sandhu X射线评分高于空白对照组(P < 0.05)，而实验组与自体骨组Lane-Sandhu X射线评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.3.4 骨密度比较术后4，8，16周，自体骨组、实验组缺损区骨密度大于空白对照组(P < 0.05)，自体骨组和实验组缺损区骨密度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.3.5 苏木精-伊红染色结果见图4。

术后第4周，自体骨组骨折断端有纤维组织包裹，类骨组织开始转变为编织骨，纤维性骨痂中的软骨组织经软骨化骨演变为骨组织，形成骨性骨痂；实验组材料开始降解，在材料边缘有类骨质形成；空白对照组无新骨组织生成。

术后第8周，自体骨组骨小梁较粗大，可见骨小梁正常的排列结构正在重新恢复；实验组材料进一步降解，降解形成空隙结构并有新生骨小梁长入；空白对照组无新骨组织生成，骨折断端未愈合。

术后第16周，自体骨组新生骨进一步形成，骨小梁重建较明显，板层骨较成熟，髓腔再通；实验组可见新生骨小梁继续长入，进一步增长、增粗、增多，有大量新生编织骨成网格状长入材料中，材料降解明显，降解与骨长入同步；空白对照组同前，无新生骨变化。

2.3.6 生物力学检测结果术后第16周，实验组和自体骨组骨标本抗弯曲能力的最大负荷、最大应力、破坏能量值均明显高于空白对照组(P < 0.05)，实验组和自体骨组骨标本抗弯曲能力的最大负荷、最大应力、破坏能量值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组设计，对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9至12月在海南省第二人民医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：纳入50只雄性新西兰大白兔，5只用于血液相容性实验，45只用于体内修复实验，体质量2.0-3.0 kg，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所提供，许可证号：SYXK(甘)2014-0002。

试剂与仪器：RPMI1640培养基(上海榕柏生物技术有限公司)；胎牛血清(宁波新芝生物科技股份有限公司)；小鼠成纤维细胞(上海拜力生物科技有限公司)；苯酚(上海心语生物科技有限公司)；MTT液(北京百奥莱博科技有限公司)；二甲基亚砜(美国OriGen BioMedical公司)；酶标仪(北京博医康实验仪器有限公司)；离心机(北京上光仪器有限公司)。

磷酸钙水泥和纤维蛋白胶：磷酸钙水泥由强生(上海)医疗器材有限公司提供，其由质量分数为85%α-磷酸三钙、10%无水磷酸氢钙和5%羟基磷灰石晶体组成。纤维蛋白胶由广州倍绣生物材料公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 构建磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料^[5] 将磷酸钙粉末和纤维蛋白胶按5 g∶1 mL的比例混合调匀，加入1 mL固化液调和成软硬适中的溶胶，立即置于预制的模具中，待自然聚合定型后取出，制备成磷酸钙/纤维蛋白胶复合支架材料样品。

1.4.2 细胞相容性实验^[5-9]

材料浸提液的配置：取50 g磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，用生理盐水按液固比为1︰2比例调和，在糊状期制成直径6 mm、高4 mm的圆柱形小块，室温下固化24 h，辐照灭菌，灭菌后按0.2 g/mL比例与含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液混合、密封，置于37 ℃恒温箱中静置浸提24 h，小心吸取上层浸提液移入另一无菌玻璃瓶中，密封备用。

材料浸提液与细胞共培养：将小鼠结缔组织成纤维细胞加入含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。取对数生长期细胞，加入胰酶消化，吸管吹打，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640 培养基制成细胞悬液，接种于96孔培养板，置于37 ℃体积分数为5%CO₂培养箱培养24 h，待大部分细胞贴壁后，小心吸弃原培养液，实验组加入100%磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料浸提液，阳性对照组加入0.64%苯酚溶液，阴性对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液，培养24，48，72 h，每个时间点取出6孔细胞，添加20 μL MTT，37 ℃继续培养4 h后终止培养，吸去上清液，添加二甲基亚砜振荡10 min，利用酶标仪检测 490 nm 波长吸光度值，计算细胞相对增殖率。细胞相对增殖率≥100%，毒性为0级；75%-99%，毒性为1级，50%-74%，毒性为2级；25%-49%，毒性为3级；1%-25%，毒性为4级；0%，毒性为5级，细胞毒性为0级和1级时视为符合生物材料的安全性需求。

1.4.3 血液相容性实验^[10-12] 抽取5只健康新西兰兔心脏血，立即加入到含有肝素钠的试管中混合，取抗凝兔血加入生理盐水进行稀释，分装入9个试管中，每管 0.1 mL，实验组加入5 mL复合材料浸提液，阴性对照组加入5 mL生理盐水，阳性对照组加入5 mL双蒸水。将全部试管放入37 ℃水浴箱中60 min，大体观察管中溶液呈澄明红色，管底无红细胞残留，判断为有溶血。然后将各管溶液放入离心试管中离心，取上清液用多功能酶标仪测定545 nm处的吸光度值(A)，计算溶血率，溶血率(%)=(A_样品-A_阴性对照)÷(A_阳性对照- A_阴性对照)×100%。

1.4.4 体内修复实验^[13-14] 将45只新西兰大白兔随机分为实验组、自体骨组、空白对照组，每组15只。术前6 h禁食禁饮，以5%水合氯醛(5 mg/kg)腹腔麻醉，麻醉成功后妥善固定其四肢，以免术中挣扎损伤血管或神经，双前肢术区备皮，碘伏消毒，行双侧前肢前壁纵切口，充分暴露桡骨，切除桡骨干15 mm，同时去除骨膜，造成桡骨中下段骨缺损模型。按照实验设计，实验组植入预先制备好的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，自体骨组用自体桡骨原位再植修复，空白对照组未植入任何材料，修复时注意两侧断端确保无肌肉及软组织嵌入，逐层缝合关闭切口，肢体不作外固定，单笼喂养。

术后处理：术后应用抗生素5 d，每天予以青霉素40×10⁴ IU肌注，分笼饲养，自由活动，术后4，6，18周各取5只用于以下实验。

X射线观察^[^15]：术后4，8，16周对各组兔桡骨进行X射线检查，经水合氯醛耳缘静脉注射麻醉后，拍摄正、侧位X射线片。记录骨形成、骨连接和骨改建情况，根据Lane-Sandhu X射线评分标准进行分析，分数越高效果越好。取骨缺损修复标本进行骨密度检测。

X射线检查评分标准：①成骨程度：没有成骨，0分；新生骨占缺损区域的25%，50%，75%，100%分别记为1，2，3，4分；②植骨与宿主骨的连接程度：骨折线完全可见，0分；可见部分骨折线，2分；未见骨折线，4分；③骨髓腔改建程度：缺损区没有骨髓腔改建的迹象，0分；缺损区骨髓腔再通，2分；缺损区骨髓腔再通后形成皮质骨结构，4分。

病理组织学检测：术后4，8，16周时，取兔双侧桡骨缺损部位标本，取材包括原骨缺损区连同两接合端的宿主骨约0.5 cm，以及周围少许软组织。所取标本用体积分数10%甲醛固定，EDTA脱钙，脱水及石蜡包埋，制作成4 µm切片。切片经过二甲苯脱蜡、各级乙醇至水洗后风干，进行苏木精-伊红染色，最后用梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，倒置显微镜观察骨组织愈合情况。

生物力学检测：术后16周，将各组标本在日本岛津公司电子万能试验机上行三点抗弯曲实验。

1.5 统计学分析使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组间比较予以单因素方差分析，检验标准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

生物材料临床应用的前提和基础是与机体组织具有良好的生物相容性和使用安全性。磷酸钙骨水泥是一种可降解生物材料，由一种或几种磷酸钙盐固体与液体混合而成。磷酸钙骨水泥材料具有许多的生物学优点，主要有生物降解性、骨引导活性、一定的抗压强度，是临床上较好的骨替代材料。但是，磷酸钙降解速度较慢，自身有一定脆性，显著限制了其在临床中的应用。实验将磷酸钙复合纤维蛋白胶可增强其成骨作用，通过细胞毒性实验发现，实验组细胞形态与阴性对照组基本相同。MTT检测结果显示，实验组培养24，48，72 h的细胞相对增殖率分别为95.49%，101.12%，103.12%，该磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料细胞毒性评级为1级或0级，符合临床生物学材料的反应级别要求。通过溶血实验计算磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料的溶血率为3.15%<5%，符合国家医疗器械生物学评价标准。

骨缺损的修复仍然是一个世界难题，自体骨移植是治疗骨缺损的最理想方法，但来源有限，供区有一定的并发症^[16]，异体骨移植虽然克服了自体骨的一些缺点，但却易引发免疫排斥反应，传播疾病等多种并发症^[17]，所以寻找自体骨的替代材料一直是骨科学领域的研究方向。近年来，随着生物材料学、组织工程学的发展，许多人工植骨材料应用骨缺损治疗，取得了较大进展。理想的骨移植替代材料应该具备良好的机械强度和生物相容性等^[18-21]，在保证植骨效果的同时，避免对患者造成二次创伤。王剑龙等^[22]制备磷酸钙骨水泥复合材料，并对桡骨骨缺损动物模型进行修复治疗，骨缺损修复的方式和速度均十分理想，获得了较好的修复效果。廖红兴等^[23]研究表明，联合应用骨形态发生蛋白6及血管内皮生长因子对新骨形成具有协同作用，可明显提高材料的降解效率和骨传导性。李光宇等^[24]研究表明，明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料可明显促进临界性骨缺损修复，效果与自体骨移植相当。陈盈君等^[25]表明丝素纤维/磷酸钙骨水泥新型复合材料有良好的生物相容性及骨诱导性，其力学强度与富含微小颗粒骨的复合材料相似，具备一定的骨缺损修复能力。郝伟等^[26]采用重组人骨形态发生蛋白2及碱性成纤维细胞生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞并与纳米羟基磷灰石/重组类人胶原基/聚乳酸复合支架材料支架复合，构建新型骨组织工程复合体，具有较理想的骨缺损修复潜能。马佳滨等^[27]通过向磷酸钙骨水泥/聚磷酸钙纤维中加入一定比例颗粒骨来调节复合材料降解速率，使之与兔桡骨成骨速率相适应，以获得修复兔桡骨缺损的最佳复合人工骨。梁建平等^[28]磷酸钙骨水泥与自体颗粒骨以3∶1复合后明显促进了缺损修复和材料降解。刘洪等^[29]磷酸钙骨水泥/神经生长因子复合物能促进骨组织生长，可作为一种新型人工骨材料修复骨缺损。实验选择磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料植入修复新西兰大白兔桡骨缺损，并与自体骨移植效果比较。术后16 周，实验组和自体骨组骨缺损基本修复，有成熟骨小梁通过，髓腔通畅，塑形较好，空白对照组骨缺损无明显变化。术后16周，实验组和自体骨组骨标本抗弯曲能力的最大负荷、最大应力和破坏能量均明显高于空白对照组(P < 0.05)，实验组与自体骨组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。上述结果表明，磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料修复桡骨缺损可促进骨组织再生，获得与自体骨移植基本相当的治疗效果。与自体骨移植相比较，磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶来源广泛，不受限制，可更好地满足临床骨缺损修复的需求，因此具有良好的临床应用前景^[30-31]。

综上所述，以磷酸钙骨水泥和纤维蛋白胶构建的复合材料具有良好的细胞相容性和血液相容性，将其应用于桡骨缺损治疗，可以获得与自体骨移植基本相当的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程