大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.018

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (49): 7418-7424.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.018

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大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建

孙国芳1，丁浩2

南昌大学第二附属医院，1心电诊断室，2消化内科，江西省南昌市 330006

收稿日期:2016-10-13 出版日期:2016-11-30 发布日期:2016-11-30
通讯作者: 丁浩，博士，主治医师，南昌大学第二附属医院消化内科，江西省南昌市330006
作者简介:孙国芳，女，1982年生，山西省万荣县人，汉族，2011年南昌大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事心血管疾病的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81300348)；江西省青年科学基金资助项目(20151BAB215006)；江西省青年科学基金资助项目(20132BAB215015)

Cloning of rat C-sis gene and construction of its eukaryotic expression vector

Sun Guo-fang1, Ding Hao2

1Diagnosis Room of ECG, 2Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Received:2016-10-13 Online:2016-11-30 Published:2016-11-30
Contact: Ding Hao, M.D., Attending physician, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Sun Guo-fang, Master, Attending physician, Diagnosis Room of ECG, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81300348; the Science Foundation for the Youth of Jiangxi Province, No. 20151BAB215006, 20132BAB215015

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因克隆：是20世纪70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为分、切、连、转、选。“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入宿主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。
C-sis：是血小板衍生生长因子B链的编码基因。C-sis的基本功能是通过多种机制促使有丝分裂信号向胞内转导并促进细胞增殖。C-sis编码的蛋白血小板衍生生长因子B是一种较强的促有丝分裂源和化学诱导剂，可刺激间胚叶来源细胞的分裂、增殖，对血管的再生及创伤愈合有良好的促进作用。故C-sis具有促进细胞增殖并抑制凋亡，进而促进组织修复的功能。

摘要
背景：原癌基因C-sis具有促进细胞增殖并抑制凋亡，进而促进组织修复的功能。假设C-sis可能在受损肝组织的修复和暴发性肝衰竭的治疗中发挥积极作用。
目的：构建pcDNA3.1/C-sis真核表达载体，检测其在大鼠正常肝细胞株BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。
方法：通过RT-PCR的方法克隆C-sis基因的选全长编码序列，构建pcDNA3.1/C-sis真核表达载体。鉴定无误后经脂质体介导转染到BRL细胞中，并通过将质粒注入尾静脉后导入大鼠肝脏。最后通过荧光定量PCR和Western Blot鉴定其在BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。
结果与结论：①成功克隆了C-sis基因全长编码区；测序证明pcDNA3.1/C-sis重组真核表达载体构建成功；②将其转染至BRL细胞和在体大鼠肝脏，可使C-sis表达升高；③实验结果为后续研究C-sis基因对大鼠暴发性肝衰竭的影响提供了先决条件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0001-8793-9069(孙国芳)

关键词: 实验动物, 基因病毒载体相关因子模型, 基因克隆, C-sis, 大鼠, 转染, 真核表达载体, 酶切, 脂质体, 鼠尾静脉, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: C-sis proto-oncogene can promote tissue repair by inducing cell proliferation and inhibiting cell apoptosis. Therefore, C-sis may play a positive role in the repair of damaged liver tissue and the treatment of fulminant hepatic failure.
OBJECTIVE: To construct pcDNA3.1/C-sis eukaryotic expression vector and detect its expression in BRL cells (the normal liver cells of rats) and rat liver cells in vivo.
METHODS: The full-length coding sequence of C-sis gene was cloned through real time-PCR. pcDNA3.1/C-sis eukaryotic expression vector was constructed and sequenced, followed by transfected into BRL cells using liposome and injected into the rat liver via tail vein. Finally, its expression in BRL cells and rat liver cells in vivo was identified by fluorescence quantitative PCR and western blotting.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The full length of encoding region of C-sis gene was successfully cloned. Sequencing proved that pcDNA3. 1/C-sis recombinant eukaryotic expression vector was constructed successfully. (2) The expression of C-sis was increased after transfected into BRL cells and rat liver. (3) These results provide basis for the subsequent study of the effect of C-sis gene on fulminant hepatic failure in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Models, Animal, Genes, Liposomes, Transfection, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙国芳，丁浩. 大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7418-7424.

Sun Guo-fang, Ding Hao. Cloning of rat C-sis gene and construction of its eukaryotic expression vector[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7418-7424.

图/表（结果） 1

2.1 造模方法的改进首先克隆了大鼠C-sis基因，并构建pcDNA3.1/C-sis真核表达载体，通过酶切测序以证实C-sis基因克隆成功与否。然后将pcDNA3.1/C-sis转染进入大鼠肝脏细胞，并通过RT-PCR和Western Blot检测C-sis基因在大鼠正常肝细胞株BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。

2.2 模型稳定性结果显示，pcDNA3.1/C-sis真核表达载体构建成功，且将其转染入BRL细胞及导入在体大鼠肝脏，RT-PCR和Western Blot均显示C-sis的表达增加。C-sis能在肝脏稳定高表达，这为后续研究C-sis对暴发性肝衰竭的治疗作用提供了稳定模型。

2.3 大鼠C-sis基因的RT-PCR扩增大鼠C-sis基因通过特异性引物扩展的PCR产物只有一条亮带，位于726 bp的位置。根据数据库GenBank所收录的C-sis的基因序列(NM_24628)，所得产物大小与预期值相符合，见图1。

2.4 真核表达载体pcDNA3.1/C-sis的鉴定限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ酶切重组质粒pcDNA3.1/C-sis，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，初步鉴定重组质粒pcDNA3.1/ C-sis构建成功，见图2。经南京金斯瑞公司测序，与Pubmed数据库中GenBank所给序列(No：NM24628)对比同源性达到100%，进一步证实重组质粒pcDNA3.1/C-sis构建成功。

2.5 真核表达载体pcDNA3.1/C-sis的结构图如图3所示，dh-1015即为C-sis基因，其余所示为酶切的位点。

2.6 pcDNA3.1/C-sis转染BRL细胞后C-sis mRNA的表达与空白对照组和空载质粒组比较，C-sis质粒组的C-sis mRNA表达量有明显增加，见图4。

2.7 pcDNA3.1/C-sis转染BRL细胞后C-sis蛋白的表达与空白对照组、空载质粒组比较，C-sis质粒组的C-sis蛋白表达量有明显增加，见图5。

2.8 pcDNA3.1/C-sis导入大鼠肝脏后C-sis mRNA的表达实验结果由荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager自动进行统计和计算。与空白对照组和空载质粒组比较，C-sis质粒组的C-sis mRNA表达量有明显增加，见图6。

2.9 pcDNA3.1/C-sis导入大鼠肝脏后C-sis蛋白的表达与空白对照组、空载质粒组比较，C-sis质粒组的C-sis蛋白表达量有明显增加，见图7。

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引言

材料方法

1.1 实验材料实验于2015年1至6月在南昌大学第二附属医院分子医学中心完成。空载质粒pcDNA3.1(+)和克隆菌株DH5α感受态细胞由实验室保存；大鼠正常肝细胞株BRL细胞购自上海中科院细胞库；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自Axygen公司；质粒中抽试剂盒OMEGA公司。分子生物学实验所用到的工具酶购自Fermentas公司；DNA 分子量标准和蛋白低分子量标准购自捷瑞生物；引物合成由上海Invitrogen生物公司完成。

1.2 实验动物 SD大鼠雌雄不限，均为3月龄±15 d，由南昌大学医学院医学实验动物科学部提供，动物合格证为医动字021-0916。实验方案中有关动物伦理问题已经由南昌大学第二附属医院实验动物伦理委员会讨论批准。

1.3 造模方法

1.3.1 引物合成与测序及总RNA的抽提利用primer premier 5.0设计一对引物，扩增片段大小为726 bp，引物序列如下：正向引物(L1)：5’-CGC GAA TTC ATG AAT CGC TGC TGG GC-3’(划线处为EcoRI酶切位点)，反向引物(L2)：5’-CCC TCT AGA CTA GGC TCC AAG GAT CTC-3’(划线处为XbaⅠ酶切位点)。测序工作由南京金斯瑞公司完成。参照Invitrogen的Trizol试剂说明书从大鼠肝组织中提取总RNA，并反转录为cDNA，分装后于-20 ℃保存。

1.3.2 C-sis基因的PCR扩增 PCR反应条件：预变性 94 ℃ 4 min，变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸68 ℃ 30 s(30 s/kb)，30个循环。循环结束在25 μL体系中加0.25 μL Taq酶，72 ℃ 10 min，反应结束后，取3 μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增情况。

1.3.3 目的片段的克隆 DNA纯化过程按照DNA回收试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)使用说明进行，DNA与pMDT19-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α菌感受态细胞中。

1.3.4 大鼠C-sis基因表达载体的鉴定挑取阳性克隆菌落进行摇菌扩增，将鉴定出的阳性菌种用通用引物进行测序，应用DNAman软件进行序列比对。提取重组质粒，经限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ酶切初步鉴定。

1.3.5 将pCDNA3.1/C-sis(或空载pCDNA3.1)转染进入大鼠正常肝细胞株BRL细胞 BRL细胞的培养条件：含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。取正常培养的处于对数期的BRL细胞，用0.25%Typsin+0.02%EDTA消化，1 500 r/min离心5 min，计数板下计数，铺6孔板，每孔均加入8×10⁴个细胞，放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。细胞完全贴壁后，根据lipo3000转染试剂说明书，加入相应比例的质粒和lipo3000。孵育6-8 h后吸弃原培养基后，更换为含浓度为200 μmol/L的H₂O₂培养基继续培养，作用48 h后收获细胞。分组如下：空白对照组(不做任何处理)、空载质粒组(转染空载质粒pCDNA3.1)、C-sis质粒组(转染重组质粒pCDNA3.1/ C-sis)。

1.3.6 将pCDNA3.1/C-sis(或空载pCDNA3.1)导入进入大鼠肝脏大鼠经乙醚麻醉后，800 μg质粒溶于15 mL林格氏液中，在15 s内快速从鼠尾静脉注入。48 h后提取大鼠肝组织。分组如下：空白对照组(仅注射林格氏液)、空载质粒组(注射空载质粒pCDNA3.1)、C-sis质粒组(注射重组质粒pCDNA3.1/C-sis)。造模成功的检测标准：利用荧光定量PCR和Western Blot检测C-sis质粒组的C-sis表达是否较空白对照组升高。

1.4 指标测定

1.4.1 Western Blot 用RIPA法取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取100 μg进行SDS-PAGE电泳分离蛋白。蛋白转印到硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉溶液4 ℃封闭过夜。膜分别用按相应比例稀释的C-sis和GAPDH的Ⅰ抗孵育，4 ℃过夜，Ⅱ抗孵育2 h，DAB显色照相。结果用Quantity One 4.62软件，以目的条带/GAPDH的灰度值进行分析。

1.4.2 荧光定量PCR 细胞总RNA抽提和反转录参照试剂说明书进行操作。C-sis上游引物为5'-ATG ACC CGA GCA CAT TCT GG-3’，下游引物为5’-ACA CCT CTG TAC GCG TCT TG-3’；β-actin上游引物为5’- CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3’，下游引物为5’-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’。PCR反应体系如下：2×SuperReal premix plus 10 μL，10 µmol/L上游引物1 μL，10 µmol/L下游引物1 μL，cDNA(加水稀释成一致水平) 8 μL。按下列条件进行扩增：95 ℃ 15min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s模板阅读，39个循环，熔融曲线70 ℃ to 95 ℃：增量0.5 ℃ 10 s模板阅读。实验结果通过荧光定量PCR分析软件(BIO-RAD CFX Manager)进行计算和分析。

1.5 主要观察指标通过电泳检验大鼠C-sis基因扩增的PCR产物大小与预期值是否相符合；通过酶切和电泳检验重组质粒pcDNA3.1/C-sis构建是否成功；通过荧光定量PCR和Western Blot检测C-sis基因表达。

1.6 统计学分析应用统计软件SPSS 13.0进行分析，数据采用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较则采用LSD检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

暴发性肝衰竭是指突然出现大量肝细胞坏死或肝功能显著异常，并在首发症状出现后8周内发生肝性脑病的一种综合征^[2]。暴发性肝衰竭的病因多种多样，根据病原可分为感染性、毒素性、代谢性、浸润性、自身免疫性、缺血性、放射损伤性及原因不明性^[3]。其临床特点是起病急、病情危重，症状表现多样，肝细胞广泛坏死，目前缺乏有效治疗手段，病死率高^[4]。

已知脏器正常功能的维持需要依靠组织细胞的生长和死亡维持于某种平衡状态。而这种细胞稳态或组织稳态的维持有赖于原癌基因和抑癌基因表达之间的平衡。在生理情况下，原癌基因参与了细胞的正常分裂、增殖、成熟和分化过程，特别是参与了组织稳态的维持过程^[5]。因此，原癌基因对于细胞的正常生长、组织修复起到了不可或缺的作用。组织损伤和脏器衰竭的主要原因是细胞的过度死亡和/或生长受抑。原癌基因的应用有可能从根本上逆转器官功能的衰竭并达到组织修复的目的。原癌基因也被看成为对组织急性损伤具有立即反应的“即早基因”。实验发现这类基因表达的激酶所介导的途径可修复心肌的缺血性损伤^[6]。

原癌基因C-sis是血小板衍生生长因子B链的编码基因^[7-8]。C-sis其基本功能是通过多种机制促使有丝分裂信号向胞内转导并促进细胞增殖^[9-10]。C-sis编码的蛋白血小板衍生生长因子B是一种较强的促有丝分裂源和化学诱导剂，可刺激间胚叶来源细胞的分裂、增殖，对血管的再生及创伤愈合有良好的促进作用^[11-12]。在一些恶性肿瘤中血小板衍生生长因子B表达增高，或者血小板衍生生长因子B与其发生发展相关^[13-15]。但有研究表明，血小板衍生生长因子B亦能够促进组织损伤的修复。血小板衍生生长因子B可能有助于治疗艾滋病毒感染的吸毒成瘾患者出现的神经元缺损^[16-17]。血小板衍生生长因子B也可能有益于因缺血再灌注而受损的肾小管细胞的修复^[18]。血小板衍生生长因子B能有效募集骨髓间充质干细胞，从而促进骨愈合^[19]；并能募集间充质原始细胞，进而可能有助于骨质疏松相关骨折的恢复^[20]。将用血小板衍生生长因子B修饰了的人造骨进行体内移植，可发现血小板衍生生长因子B能诱导血小板衍生生长因子受体阳性的骨髓间充质干细胞或者前成骨细胞转移至人造骨，这促进了人造骨与宿主的融合^[21]。以上提示C-sis具有促进细胞增殖并抑制凋亡，进而促进组织修复的功能。因此，可以假设C-sis可能在受损肝组织的修复和暴发性肝衰竭的治疗中发挥积极作用。因此，为研究C-sis基因对大鼠暴发性肝衰竭的影响，首先需构建大鼠C-sis基因的真核表达载体。

文章首先克隆了大鼠C-sis基因，并构建pcDNA3.1/ C-sis真核表达载体，通过酶切测序以证实C-sis基因克隆成功与否。然后将pcDNA3.1/C-sis转染进入大鼠肝脏细胞，并通过RT-PCR和Western Blot检测C-sis基因在大鼠正常肝细胞株BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。结果显示，pcDNA3.1/C-sis真核表达载体构建成功，且将其转染入BRL细胞和在体大鼠肝脏后C-sis的表达增加。

生物界的差别及不同的属性是由遗传密码所决定的，遗传密码潜藏在DNA的4种碱基不同的排列组合内^[22-23]。对人类自身永恒不变的好奇心及对生老病死规律探寻，尤其为了彻底祛除病痛的需要，导致了基因研究已成为近20年以来最具魅力的学科之一。人类基因组的作图虽早在十多年前就已完成，但是绝大多数的基因功能仍所知不多，甚至可以说还仅为未解之谜。所以，现今生命科学研究是基因功能研究的后基因组时代。基因的克隆是开展基因功能研究的必由之路^[24-25]。为研究C-sis基因对大鼠暴发性肝衰竭的影响，作者进行了C-sis基因的克隆，以便为下一步进行基因功能和基因治疗的研究提供物质基础。为开展基因克隆，能够获得高纯度目的cDNA的片段非常关键^[26-27]。为此，引物的克隆需要经过仔细的设计^[28-29]。所获得的cDNA电泳后位于726 bp的位置，与基因库的预期值相符合。另外，本实验中采用了pcDNA3.1质粒作为目的基因的亚克隆载体。质粒构建完成之后，需进行酶切鉴定^[30-31]。而酶切鉴定一般需用到限制性内切酶^[32-33]。本研究使用了限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ酶切重组质粒pcDNA3.1/ C-sis，电泳所得条带大小与预期一致。鉴定证实后需要送序列测定^[34-35]。经对比无误即所测定的序列与基因库上公布序列一致后，还要观察构建体能否在真核细胞中有效表达^[36-37]。作为机体主要的代谢及活性蛋白合成器官，肝脏已经成为进行基因功能研究和基因治疗的重要靶器官。作者下一步工作也拟以肝脏作为靶器官研究C-sis基因在动物整体内的生物学功能。

流体力学注射法是一种快速大容量裸质粒溶液体内注射方法。凭借该注射法，目的基因可经鼠尾静脉导入动物活体器官，且在靶器官中高表达。该法是Liu等^[38]人建立起来的，表明裸质粒DNA经鼠尾静脉快速地大容量注射能导致目的基因在实验鼠体内高表达，并且肝脏是该目的基因表达的主要器官。Wang等^[39]对硫代乙酰胺诱发的急性肝衰竭实验大鼠进行了基因治疗研究，结果表明a-MSH基因经鼠尾静脉注射能显著降低急性肝衰竭大鼠死亡率，明显改善肝脏组织学表现，使得肝的TUNEL阳性细胞减少。在本实验中，大鼠经乙醚麻醉后，800 μg的pcDNA3.1/C-sis裸质粒溶于15 mL林格氏液中，在15 s内快速从鼠尾静脉注入。48 h后提取大鼠肝组织，荧光定量PCR和Western Blotting显示C-sis质粒导入后的C-sis表达量有明显的增加。

本研究后续实验将从细胞水平用H₂O₂或诱导BRL细胞凋亡，然后用上述重组质粒pcDNA3.1/C-sis转染细胞，最终检测肝细胞的增殖和凋亡；其次从动物水平，用内毒素联合D-半乳糖胺处理大鼠建立暴发性肝衰竭模型，然后将pcDNA3.1/C-sis注入大鼠体内，最终检测大鼠肝脏的增殖和凋亡。大鼠C-sis基因的克隆及其真核表达载体的成功构建为上述后续实验提供了先决条件和实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建

Cloning of rat C-sis gene and construction of its eukaryotic expression vector

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