银杏平颤方对帕金森病模型小鼠多巴胺神经元丢失及其凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
特发性帕金森病：病因迄今未明，以中枢神经系统不同部位变性为主，尚有其他临床特点，某些中枢神经系统变性疾病伴Parkinson病症状，故可称之为症状性Parkinson病。如进行性核上性麻痹、纹状体黑质变性、Shy-Drager综合征及橄榄脑桥小脑萎缩(OPCA)等。还有一些疾病或因素可以产生类似帕金森病的临床症状，其病因为感染、应用多巴胺受体阻滞药等、毒物作用、血管性(多发性脑梗死)及脑外伤等所致，临床上称为帕金森综合征。
多巴胺：C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2，由脑内分泌，可影响一个人的情绪。它正式的化学名称为4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚(4-(2-aminoethyl)benzene-1，2-diol)。Arvid Carlsson确定多巴胺为脑内信息传递者的角色使他赢得了2000年诺贝尔医学奖。多巴胺是一种神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。这种脑内分泌主要负责大脑的情欲，感觉将兴奋及开心的信息传递，也与上瘾有关。

摘要
背景：现代药理研究证明银杏叶及其提取物生物具有抗氧化作用以及刺激神经生长因子产生等保护多巴胺神经元的存活，减少其凋亡。
目的：验证银杏平颤方对帕金森病小鼠多巴胺神经元丢失及其凋亡的影响以及的神经母细胞瘤衍生细胞株SH-SY5Y的增殖情况的影响。
方法：①C57BL小鼠随机分成3组。正常组10只不处理。其他2组小鼠每天腹腔注射MPTP建立小鼠帕金森病的模型，连续6周；每次腹腔注射前30 min进行灌胃处理，模型组10只灌胃生理盐水；治疗组10只灌胃中药银杏平颤方。分别在造模开始后的第15天和第30天取脑组织，免疫组织化学观察中脑黑质多巴胺神经元丢失和细胞凋亡情况；②体外培养神经母细胞瘤衍生细胞株SH-SY5Y并用银杏平颤方处理细胞，MTT 法检测人SH-SY5Y的增殖，流式细胞术检测细胞凋亡情况；Real-time PCR 和Western blotting检测细胞PARP、PTEN mRNA和蛋白质表达。
结果与结论：①动物实验结果：正常组小鼠的中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目多于模型组，并存在时间依赖关系；银杏平颤方中药治疗组小鼠中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目多于模型组(P < 0.05)；②体外细胞实验结果：银杏平颤方处理的细胞凋亡率低于模型组；银杏平颤方处理细胞的PARP、PTEN的mRNA及蛋白水平均低于模型组。③结果说明，银杏平颤方治疗可在一定程度上抑制中脑神经元细胞的凋亡；其分子机制可能是银杏平颤方通过抑制PTEN表达进而降低细胞凋亡水平，保护多巴胺神经元，阻止其丢失，起到防治帕金森病的作用。

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ORCID: 0000-0002-4661-3908(吴亚丹)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 银杏平颤方, 帕金森病, 小鼠, 多巴胺神经元, PTEN, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Current pharmacological research has administrated that Ginkgo biloba and its extracts can eliminate loss and apoptosis of dopamine neurons by antioxidation and nerve growth factor activation.
OBJECTIVE: To confirm the effects of Ginkgo biloba Pingchan Recipe on loss and apoptosis of dopamine neurons as well as proliferation of neuroblastoma derived cell lines SH-SY5Y in mice with Parkinson’s disease.
METHODS: (1) C57BL mice were randomly divided into three groups: 20 mice were modeled into Parkinson’s disease by intraperitoneal injection of MPTP for 6 weeks, and at 30 minutes before each intraperitoneal injection, mice in model group were given gavage of normal saline, mice in treatment group given Ginkgo biloba Pingchan Recipe. The other 10 mice received no any interventions as normal group. The loss and apoptosis of dopamine neurons were observed by immunohistochemistry at 15 and 30 days after modeling. (2) In vitro cultured SH-SY5Y cell lines were treated with Ginkgo biloba Pingchan Recipe. Subsequently, the cell proliferation and apoptosis were detected using MTT assay and flow cytometry, respectively; PARP and PTEN mRNA and protein levels were measured through real-time PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, the number of tyrosine hydroxylase-positive neurons at the substantia nigra compacta of midbrain was significantly increased in a time-dependant manner in the normal and treatment groups (P < 0.05). (2) The apoptosis rate and mRNA and protein levels of PARP and PTEN in the treatment group were lower than those in the model group. These results suggest that Ginkgo biloba Pingchan Recipe can partly inhibit midbrain neuron apoptosis that may be by decreasing PTEN level. As a result, it becomes possible to prevent and treat Parkinson’s disease via protecting dopamine neurons from loss.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Parkinson Disease, Dopamine, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴亚丹，梁培日，龙登毅，高炳淼. 银杏平颤方对帕金森病模型小鼠多巴胺神经元丢失及其凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7327-7333.

Wu Ya-dan, Liang Pei-ri, Long Deng-yi, Gao Bing-miao. Effects of Ginkgo biloba Pingchan Recipe on loss and apoptosis of dopamine neurons in mouse models of Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7327-7333.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程造模动物流程图见图1。

2.2 模型材料、方法的改进实验使用的模型建立方法基本是忠于经典的帕金森病模型的建立准则，在其基础上对药物浓度进行了一定的改进，在伦理学允许的情况下加大了药物浓度，从而降低了模型建立所需要的的时间，也提高了模型建立的成功率。

2.3 模型更接近人类根据该方法成功的建立了该疾病的模型，并且发现随着作用时间的延长，多巴胺神经元的丢失数量逐渐增多。该模型的建立优势在于该模型中的多巴胺神经元的丢失是一种永久性损伤，这种损伤更为接近人类的帕金森发病情况。

2.4 银杏平颤方对帕金森病鼠中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元丢失的影响正常组小鼠的中脑腹侧的黑质致密部和腹侧被盖区可见许多酪氨酸羟化酶阳性神经元和纤维，自胞体可发出1-4个突起，突起存在可见分叉。第15天模型组的腹侧被盖区内酪氨酸羟化酶阳性神经元减少，酪氨酸羟化酶阳性纤维和胞体稀疏并且以黑质致密部减少最明显；银杏平颤方治疗组黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元的数量少于正常组，但

多于模型组，建模第30天，上述差异更加明显，结果有显著性意义，结果见表1。

2.5 银杏平颤方对MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞增殖情况的影响正常组的SH-SY5Y细胞增殖速度明显高于由MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞(P < 0.01)，说明MPP+诱导后的SH-SY5Y细胞可以模拟帕金森病的神经元消退情况，经过银杏平颤方处理后，被MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞的增殖情况好于助溶剂组(仅由MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞)，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图2。

2.6 银杏平颤方对MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞凋亡情况的影响正常组的SH-SY5Y细胞凋亡明显低于由MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞(P < 0.01)，说明MPP+诱导后的SH-SY5Y细胞可以模拟帕金森病的神经元消退情况，经过银杏平颤方处理后，被MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞的凋亡情况低于助溶剂二甲基亚砜组(仅由MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞)，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图3。

2.7 银杏平颤方对MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞PARP及PTEN mRNA表达的影响银杏平颤方作用24 h后，收集细胞后检测与凋亡通路相关的分子的mRNA表达水平的变化，发现经过银杏平颤方处理后的已由MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞凋亡标志性分子PARP和PTEN mRNA的表达发生了明显的降低，见图4；通过半定量显示出相同结果，见图5；差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.8 银杏平颤方对MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞PARP及PTEN的蛋白表达的影响银杏平颤方作用24 h后，收集细胞后检测与凋亡通路相关的分子的蛋白表达水平的变化，发现经过银杏平颤方处理后的已由MPP+诱导培养后SH-SY5Y细胞的凋亡标志性分子PARP和PTEN的蛋白的表达发生了明显的降低，见图6。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料

1.1.1 中药银杏平颤方汤药内含熟地、枸杞、桑寄生、天麻、钩藤、丹参、白芍、生南星，按既定工艺煎煮成汤药，由海南医学院药物化学教研室制剂室制备。银杏平颤方全方动物用药量根据成人用药的5倍量计算，取全方用乙醇提取，得浸膏，含有生药的最终浓度为 0.60 g /mL存于4 ℃冰箱内备用，灌胃时溶于蒸馏水中。

1.1.2 实验动物 6.0-7.0周龄C57BL小鼠36只，雌性，体质量(20±2) g，购于北京维通利华公司实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2011-0011。

1.1.3 实验细胞及试剂 SH-SY5Y细胞(美国ATCC)；胎牛血清、Trypin-EDTA 及DMEM培养液(美国Gibco 公司)；MTT、二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司)；细胞周期检测试剂盒(中国上海贝博生物有限公司)；AnnexinⅤ-PI 双染试剂盒(碧波公司)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris 碱、四甲基乙二胺(tetramethylethylene diamine，TEMED)、十二烷基硫酸钠(sodiumodecyl sulfate，SDS)、过硫酸铵(tetramethyl ethyleneiamine，APS)、吐温-20(Tween- 20)(上海生工生物工程公司)；显影液west Femto 及ECL west Pico 显影液(美国Pierce 公司)；TRIzol 试剂(美国Invitrogen 公司)；反转录试剂盒(美国Fermentas 公司)；实时PCＲ试剂盒(日本Takara公司)；酪氨酸羟化酶(TH-16)抗体 (Sigma公司)；兔抗Cleaved PARP (Cell signal公司)；兔抗人PTEN单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)；鼠抗人GAPDH(上海Abmart 公司)、兔二抗、鼠二抗均(美国Santa Cruz公司)。

1.1.4 仪器化学发光仪(美国GE Healthcare，型号LAS4000)；垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司，型号165-3301)；荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司，型号Mx3000P)；CO₂细胞培养箱(美国Thermo公司，型号Forma 3111)。

1.2 动物体内实验

1.2.1 帕金森病鼠模型建立选用C57BL雄性小鼠腹腔注射用生理盐水配制的0.3%MPTP，25 mg/(kg·d)，连续6周。

1.2.2 造模成功的检测标准经过药物处理的小鼠，在行为学上出现向健侧旋转的行为，并且随着时间的推移，出现旋转的小鼠数量明显增多，旋转速度加快，6周后，经诱导出现旋转的小鼠数量和旋转速度相对稳定，其中20只恒定向健侧旋转，视为成功建立帕金森病小鼠模型。

1.2.3 动物分组及处理动物随机分成3组，每组10只，除正常组外，其他各组每次腹腔注射M PTP前30 min进行灌胃处理。①正常组不处理;②模型组灌胃生理盐水每只25 g/(kg·d)；③银杏平颤治疗组(简称治疗组)灌胃中药每只25 g/(kg·d)；动物分别在造模开始后的第15天和第30天取脑进行检查。

1.2.4 取材及材料处理造模期满后用体积分数 10%的水合氯醛腹腔麻醉，打开胸腔后经升主动脉尽量快速推注生理盐水25 mL，然后缓慢推注体积分数4%甲醛固定。取脑，置于体积分数4%甲醛固定固定过夜。脑组织经常规步骤处理后，石蜡包埋，切片、片厚4 μm，常温保存备用。

1.2.5 免疫组织化学方法采用常规免疫组织化学 ABC法显示小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶的表达。阴性对照切片用PBS代替一抗，其他处理相同。光镜观察切片。

1.3 体外细胞实验

1.3.1 细胞培养将神经母细胞瘤衍生细胞株SH-SY5Y用含有体积分数15%胎牛血清的DMEM 培养基培养，置于37 ℃，体积分数5%CO₂的细胞培养箱中常规培养。用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液消化细胞，并进行传代，传至4，5代，选取生长状态良好，增殖旺盛的细胞用于试验研究。

1.3.2 药物处理银杏平颤方溶于二甲基亚砜，储存浓度为0.8 mmol/L MPP+溶于无菌ddH₂O，储存浓度为0.8 mol/L，避光-20 ℃冰箱储存。使用时按所需浓度溶于培养基中，用于细胞处理。

1.3.3 MTT法检测人SH-SY5Y的增殖取生长状况良好的对数期SH-SY5Y细胞进行MPP+诱导培养后进行消化，轻柔吹匀，调整为浓度为(3-3.5)×10⁷L^-1的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200 μL，每组每个时间点设置3个重复孔，培养6 h后，实验组加入含有银杏平颤方成分的培基，并在0 h的实验组和对照组每孔中加入20 μL的MTT。反应4 h后，弃液，加入150 μL二甲基亚砜，置于摇床上匀速摇30 min，带结晶完全溶解后，用空白调零，利用自动酶标仪测定490 nm下各孔的光吸收值，一每组3个复孔的平均值作为各组的实验值，重复3次实验，实验组的抑制率=1-A_实验组/A_对照组×100%。

1.3.4 AnnexinⅤ-PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡选取生长状态好、处于对数生长期的SH-SY5Y细胞进行MPP+诱导培养后，以浓度为2×10⁸ L^-1接种于6孔板内，每孔加入2 mL培基。放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h。换成含有1%血清的DMEM，37 ℃继续孵育18 h，使细胞进入静止期。丢弃上清，用PBS清洗3次，实验分组：空白细胞对照组(1%血清的DMEM培基2 mL)、助溶剂二甲基亚砜对照组(1%血清的DMEM培基2 mL，二甲基亚砜终浓度为0.8 μmol/L)和银杏平颤方实验组(1%血清的DMEM培基2 mL，银杏平颤方终浓度为0.8 μmol/L)，培养24 h后，将细胞消化下来，离心，收集细胞。按照说明书对细胞进行染色：加入550 μL的结合缓冲液重新悬浮细胞，然后向细胞悬液中加入6 μL Annexin V/FITC 混匀后，加入6 μL Propidium Iodide，轻柔混匀。避光室温静置20 min，利用流式细胞仪上机分析。CELL Quest 软件自动获取每样品1×10⁴个细胞。流式细胞仪定量分析，计算Annexin V-FITC及PI双标阳性细胞含量的百分比。

1.3.5 PARP PTEN mRNA表达的检测采用实时PCR检测加入银杏平颤方后，SH-SY5Y细胞的PARP PTEN mRNA的相对表达量。首先用TRIzol提取细胞总RNA，将总RNA反转录合成cDNA。反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。以反转录反应产物cDNA为模板，PARP forward，AGG TTC TGG GAC AGC AAC TGT T，reverse，AGCT GAT GCA TGT GCC TGA AG；PTEN：forward，GAG ACA CAA ATA TGA GCA CAC AGG TAA，reverse，ATG ATG CTT GTG TTT AAA TGC CTT T。实时PCR反应条件如下：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共39个循环。溶解曲线条件：95℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。根据反应结束后的Ct值(Ct值即为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所对应的循环数)，通过2^-^??Ct法计算样品中多种mRNA 的相对表达量所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证^[6]。

1.3.6 Western blot分析将3组细胞：细胞对照组、二甲基亚砜助溶剂对照组和银杏平颤方组培养至对数生长期，细胞按7×10⁵/孔的数量加入6孔板中，培养24 h后，用预冷的PBS漂洗2次，立即以细胞刮刀收集细胞， 1 900 r/min 离心10 min，弃上清。用蛋白裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度，然后加入5×loading在100 ℃沸水浴中煮7 min。等质量蛋白进凝胶电泳，用湿式转膜仪将凝胶中的蛋白转移到pvdf膜上，5%的脱脂牛奶封闭60 min，将pvdf膜用TBST洗涤2次，每次3 min。分别加入兔抗PARP多抗体，PTEN抗体，内参照用鼠抗人GAPDH，阴性对照用等量PBS代替一抗，4 ℃孵育过夜后弃去一抗，用TBST洗涤3次×15 min。再分别加入辣根酶标记的兔抗羊二抗或鼠抗兔二抗，37 ℃孵育1 h。弃酶标抗体，然后用TBST洗涤3次，每次15 min。化学发光仪使用ECL显影液进行显影。以GAPDH作为内参。

1.4 主要观察指标 ①银杏平颤方对帕金森病鼠中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元丢失的影响；②银杏平颤方对MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响；③银杏平颤方对MPP+诱导培养后的SH-SY5Y细胞PARP及PTEN mRNA和蛋白表达的影响。

1.5 统计学分析采用SPSS18.0统计软件进行方差分析和t 检验，将P < 0.05判定为差异有显著性意义。

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讨论

1817年，英国医生 James Parkinson 首次详细描述这种第二大年龄相关的神经系统退行性疾病。之后，作为现代神经病学的奠基人Jean Martin Charcot 在对震颤麻痹进行了深入细致的观察和研究后，提议Parkinson 定义的这种疾病命名成帕金森病。随着社会人口老龄化的日益加重，以老年人易患的帕金森病的患病率及发病率正在呈现迅速增加的状态。已有报道显示：帕金森病发病的平均年龄为55岁，并且随着年龄的增长，发病率已经从20/10万快速增长到120/10万。据不完全统计在年龄65岁以上的人群中，帕金森病发病率已高达1%。因此，帕金森病已然成为继阿尔海默茨病之后影响老年人群心身健康的第二大神经退行性疾病^[7]。

目前，采用MPTP腹腔注射小鼠诱发的模型已被公认为是最理想的帕金森病动物模型之一，用于帕金森病发病机制及药物作用机理的研究。实验根据该方法成功的建立了该疾病的模型，并且发现随着作用时间的延长，多巴胺神经元的丢失数量逐渐增多。该模型的建立优势在于该模型中的多巴胺神经元的丢失是一种永久性损伤，这种损伤更为接近人类的帕金森发病情况，该模型中神经元的丢失是一种可控制的因素，与药物的作用时间呈现一定的正相关关系，并且模型的建立技术成熟，该模型的建立将于人类帕金森疾病的发病情况进行一定程度上的重现，能够用于药物的开发与实验，具有转化医学发展所需的相应条件，为转化医学的实现提供了理论基础。

随着研究的深入，研究者发现多巴胺能神经元的细胞丢失的另一种方式在于细胞凋亡的异常发生，细胞凋亡可能参与了多巴胺神经元的死亡过程，加速了帕金森病的发生与发展^[8-9]，因此，研究者开始着手在中药药材中寻找能够治疗帕金森病的药物，帕金森病属中医学 “颤振”、“震颤”等范畴，因此，选择“平肝熄风、解毒通络”的银杏平颤方治疗帕金森病。现代药理研究证明银杏叶及其提取物生物具有抗氧化作用以及刺激神经生长因子产生等保护多巴胺神经元的存活，减少其凋亡^[10-11]。

PTEN基因作为一种肿瘤抑制因子，通过阻止细胞生长、分裂的速度过快或者分裂不受控制的方式，进而调控细胞分裂周期^[12-14]。PTEN酶参与化学通路的传导，可以把信号传导给细胞，使细胞停止分裂并进入程序性死亡(细胞凋亡)。这些功能可以阻止不受控制的细胞生长进而限制肿瘤的形成^[15-17]。

本实验分为2部分，第1部分的研究结果表明，在MPTP诱导的帕金森病小鼠中，经过银杏平颤方处理的帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元是具有具有保护作用，在第2部分中对其保护机制进行了进一步的研究，结果发现在对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞模型进行银杏平颤方药物治疗后，细胞增殖速度加快、细胞凋亡减少、细胞凋亡相关分子PARP、PTEN的表达水平明显降低，相关分子在帕金森疾病的发生发展中具有重要作用，这说明银杏平颤方能够通过下调凋亡通路关键节点蛋白PTEN来降低细胞凋亡，具有保护多巴胺神经元的存活的能力，为进一步临床医用提供理论依据。

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