人参皂苷Rb3对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
心肌缺血再灌注损伤：是常见心血管疾病，指心脏血流灌注减少，心脏供氧减少，心肌能量代谢失常，无法支持心脏正常工作的一种病理状态，常见原因是冠状动脉粥样硬化。再灌注是指组织或器官缺血后恢复供血的过程，此过程往往会加重组织损伤。心肌缺血再灌注损伤已成为冠状动脉搭桥手术、介入治疗及冠状动脉溶栓治疗的常见并发症，目前临床上治疗此病药物主要有硝酸酯类、他汀类、钙离子拮抗剂等，近年来中药也成为心肌缺血再灌注损伤治疗的热点。
人参皂苷：为人参的主要有效成分，对中枢神经系统、循环系统、代谢系统、造血系统等具有丰富的药理药效作用。人参皂苷种类繁多，含量约为4%，一般可分为人参二醇类皂苷、原人参三醇类及齐墩果酸类3种。其中原人参二醇类皂苷约有20种，主要有Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等，约占人参总皂苷的55%；而原人参三醇类在约有10种，主要有Re、Rg1、Rg2等，约占人参总皂苷的40%；齐墩果酸。

摘要
背景：人参皂苷Rb3具有多种生理活性，主要集中体现在心血管方面。
目的：观察人参皂苷Rb3对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
方法：将120只SD大鼠随机分6组，每组20只，模型组、假手术组灌胃给予生理盐水2 mL/(kg•d)，连续2 d；阳性药物组灌胃给予地尔硫卓2 mL/(kg•d)，连续2 d；低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组分别灌胃给予人参皂苷Rb3 10，20，30 mg/(kg•d)，连续2 d。给药2 d后，假手术组只开胸，不做任何处理；其余5组结扎左侧冠状动脉前降支，建立心肌缺血再灌注损伤模型，48 h后，观察大鼠心肌组织病理切片，计算脏器系数与心肌梗死面积百分比，测定血清中同工酶、丙二醛、乳酸脱氢酶、内皮舒张因子、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶等生化指标的水平。
结果与结论：①病理切片：中剂量与高剂量人参皂苷Rb3对心肌缺血再灌注组织损伤有显著改善作用；②脏器系数与心肌梗死面积百分比：与模型组比较，中剂量与高剂量人参皂苷Rb3能显著降低大鼠脏器系数及心肌梗死面积百分比(P < 0.05，P < 0.01)；③血清指标：与模型组比较，人参皂苷Rb3呈剂量依赖性降低同工酶、丙二醛、乳酸脱氢酶、内皮舒张因子水平，呈剂量依赖性升高谷胱甘肽过氧化酶、超氧化物歧化酶水平；④结果表明：人参皂苷Rb3对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用，其作用机制可能与抗细胞过脂质化、抗自由基、抗炎症反应及影响心肌酶参与体内能量代谢的过程有关。

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ORCID: 0000-0002-7776-1049(吴惠珍)

关键词: 实验动物, 心肺损伤与修复动物模型, 人参皂苷Rb3, 心肌缺血再灌注损伤大鼠, 血清, 心肌组织, 生化指标

Abstract:

BACKGROUND: Ginsenoside Rb3 has a variety of physiological activities, which mainly reflected in the cardiovascular treatment.
OBJECTIVE: To study the protective effects of ginsenoside Rb3 on the ischemia/reperfusion injury of rats.
METHODS: 120 Sprague-Dawley rats were randomly assigned to six groups, with 20 in each group. Rats in the model and sham operation groups were intragastrically given physiological saline 2 mL/kg•d for 2 consecutive days. Rats in the positive drug group were intragastrically given diltiazem 2 mL/kg•d for 2 consecutive days. Rats in the low-dose drug group, moderate-dose drug group and high-dose drug group were intragastrically given ginsenoside Rb3 10, 20, 30 mg/kg•d, for 2 consecutive days. At 2 days after administration, the chest of rats in the sham operation was opened, but these rats did not receive any other treatment. In other five groups, anterior descending branch of left coronary artery was ligated to establish models of ischemia/reperfusion injury. 48 hours later, we observed pathological sections of rat cardiac muscle, calculated percentage of organ coefficient and myocardial infarction area, measured the levels of serum isozyme, malondialdehyde, lactate dehydrogenase, endothelial relaxing factor, superoxide dismutase and glutathione peroxidase.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Pathological sections: ginsenoside Rb3 significantly improved the ischemia/reperfusion injury. (2) Percentages of organ coefficient and myocardial infarction area: compared with the model group, the percentages were significantly lower in the moderate-dose and high-dose drug groups (P < 0.05, P < 0.01). (3) Serum indexes: compared with the model group, ginsenoside Rb3 decreased isozyme, malondialdehyde, lactate dehydrogenase and endothelial relaxing factor levels in a dose-dependent manner, but increased superoxide dismutase and glutathione peroxidase levels in a dose-dependent manner. (4) Results suggested that ginsenoside Rb3 has protective effects on ischemia/reperfusion injury. Its mechanism of action may be associated with anti-lipid peroxide activities in cells, the anti-free radical effects, anti-inflammatory functions and the influence of cardiac enzymes on energy metabolism.

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Key words: Drugs, Chinese Herbal, Myocardial Ischemia, Myocardial Reperfusion Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴惠珍，贾庆忠. 人参皂苷Rb3对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的保护[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7320-7326.

Wu Hui-zhen, Jia Qing-zhong. Protective effects of ginsenoside Rb3 on a rat model of ischemia/reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7320-7326.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 120只大鼠均进入结果分析。

2.2 人参皂苷Rb₃对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响假手术组心肌组织结构完整，排列整齐，肌原纤维规则，间质可见微量纤维组织，心肌细胞界限清晰，核内物质分布均匀，未见梗死病灶，无大量红细胞和炎细胞浸润；模型组心肌组织出现局部坏死，心肌细胞呈现肿胀，间质增大，边界不清晰，心肌细胞排列紊乱，细胞核不规则，胞浆呈不规则颗粒状，心肌纤维间质有大量红细胞或中性粒细胞浸润；低剂量给药组局部心肌组织出血坏死，心肌细胞结构模糊，界限不清晰；中剂量给药组心肌细胞边界模糊，细胞核聚集，存在炎性细胞浸润；高剂量给药组组心肌细胞完整，排列规整，细胞间质有轻度水肿；阳性药物组心肌细胞完整，排列整齐，细胞间质轻度水肿，见图1。

2.3 人参皂苷Rb₃对大鼠心肌梗死面积百分比及脏器系数的影响假手术组中无心肌梗死面积，因此实验结果皆与模型组进行比较。由表1可知，模型组大鼠脏器系数及心肌梗死面积百分比最大，阳性药物组脏器系数及心肌梗死面积百分比最小，两组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)；低剂量给药组脏器系数、梗死面积百分比与模型组比较差异无显著性意义，可认为10 mg/(kg•d)的给药剂量对大鼠心肌梗死面积无显著性影响；中剂量给药组脏器系数与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，梗死面积百分比与模型组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)；高剂量给药组脏器系数、梗死面积百分比与模型组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，提示人参皂苷Rb₃在给药剂量为20 mg/(kg•d)与30 mg/(kg•d)能显著降低大鼠心肌梗死面积，降低大鼠心肌缺血再灌注损伤。

2.4 人参皂苷Rb₃对心肌缺血再灌注损伤大鼠生化指标影响与假手术组相比，模型组大鼠血清中的超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化酶、同工酶、内皮舒张因子均有极其显著性变化(P < 0.01)；与模型组相比，阳性药物地尔硫卓对大鼠血清中的超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化酶、同工酶、内皮舒张因子都有显著影响(P < 0.05，P < 0.01)，表明阳性药物对大鼠心肌缺血再灌注损伤有明显改善作用；人参皂苷Rb₃3个剂量组对大鼠血清生化指标的影响有一定区别，与模型组相比：①低剂量给药组能显著降低大鼠血清中同工酶水平(P < 0.05)，升高血清中谷胱甘肽过氧化酶含量(P < 0.01)，而对内皮舒张因子、超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸脱氢酶的影响较小，不具有统计学意义；②中剂量给药组能显著降低大鼠血

清中丙二醛、乳酸脱氢酶、同工酶及内皮舒张因子水平(P < 0.05，P < 0.01)，提高谷胱甘肽过氧化酶含量(P < 0.01)，其中对乳酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化酶、同工酶含量的影响极其显著；③高剂量给药组对大鼠血清中的所有生化指标具有显著影响(P < 0.01)，表明人参皂苷Rb₃对大鼠心肌缺血再灌注损伤有明显的改善作用，且随着给药剂量的增大效果越明显，见图2，表2，表3。

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引言

人参为五加科多年生草本植物，最早记载于《神农本草经》，中国药用历史悠久，味甘，微寒，归脾、肺、心经，具有补气、生津、固脱、益智、安神作用^[1]，临床上被广泛应用于治疗心血管疾病^[2]、神经衰弱^[3]、胃和肝脏疾病、抗肿瘤^[4]、抗氧化等^[5]。研究表明，人参中含有多种有效化学成分，如皂苷类^[6]、有机酸、黄酮类^[7]、挥发性成分^[8]、糖类^[9]、酯类^[10]、蛋白质等^[11]，其中，人参黄酮类成分具有抗氧化活性^[12]；挥发性成分则具有消炎、抗疲劳、镇咳的药理作用^[13]；糖类具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射等药理作用^[14]；人参皂苷为人参的主要有效成分，对中枢神经系统、循环系统、代谢系统、造血系统等具有丰富的药理药效作用。人参皂苷种类繁多，含量约为4%，一般可分为人参二醇类皂苷、原人参三醇类及齐墩果酸类3种^[6]。其中原人参二醇类皂苷约有20种，主要有Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc、Rd等^[15]，约占人参总皂苷的55%；而原人参三醇类在约有10种，主要有Re、Rg₁、Rg₂等^[16]，约占人参总皂苷的40%；齐墩果酸皂苷则仅有1种，为人参皂苷Ro^[17]。

作为人参的主要有效成分，人参皂苷具有丰富的药理作用^[18]。研究表明，人参皂苷对心血管疾病^[19]、心力衰竭^[20]、心律失常等具有较好的临床疗效^[21-22]。国内学者在对心肌细胞凋亡的研究中发现，人参皂苷Rb₁和人参皂苷Re可减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡，且发现Rb₁的效果更优^[23]。在大鼠体内模型中，不同剂量的人参皂苷Rb₁对大鼠心率、动脉压、左室舒张压和左室内压有明显下调作用，且呈剂量依赖性^[24]。而人参皂苷Rb₃作为原人参二醇类皂苷中的主要单体成分，引起了国内外许多学者的关注。在对神经系统作用方面，Rb₃主要体现在对缺血性脑损伤的保护，作用机制与清除氧自由基、抑制脂质过氧化、阻止缺血缺氧时钠通道的变构有关^[25]。张宏伟等^[26]通过建立大鼠不完全脑瘫模型，观察人参皂苷Rb₃对脑含水量、血清和脑组织中丙二醛、内皮舒张因子含量及一氧化氮合酶活性的作用，发现人参皂苷Rb₃可通过抑制脂质过氧化、提高抗氧化酶活性等对大鼠脑缺血损伤起到保护作用。在对血液系统方面，催秀明等^[27]通过体外研究发现，人参皂苷Rb₃可抑制由腺苷二磷酸诱导的家兔血小板凝集；而体内研究则发现，尾静脉注射人参皂苷Rb₃对小鼠肺微循环血栓有保护作用，可明显减少小鼠死亡数。沈洪妹等^[28]通过大鼠脑缺氧模型研究人参皂苷Rb₃对大鼠神经递质的影响发现，人参皂苷Rb_{3具有促进抑制性神经递质的作用，对缺氧性损伤具有保护作用。在对心血管系统的作用方面，韩冬等^[29]通过结扎大鼠左冠状动脉建立心肌梗死后心室重构模型，进一步证明人参皂苷Rb₃能明显改善心室重构后异常血流指标，对心肌梗死后心室重构具有明显的保护作用。刘一鸣等^[30]通过对小鼠心肌营养性血流量的研究发现，人参皂苷Rb₃具有钙通道阻滞作用，其效果可与维拉帕米相当，具有增加心肌营养性血流量的作用。通过文献查阅发现，人参皂苷Rb₃具有多种生理活性，其中心血管方面的活性研究最多，表明人参皂苷Rb₃的生理活性主要集中体现在心血管方面。

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材料方法

1.1 造模动物及材料 SPF级SD大鼠120只，雌雄各半，体质量200-250 g，由上海斯莱克实验动物公司提供，许可证：SCXK(沪)2014-0003，批号：20140320，饲养于SPF级动物饲房，定时给予全价营养饲料，光照随时间变化，室温25-27 ℃，湿度60%-70%。人参皂苷Rb₃粉末由实验室制备，纯度达99%以上，按照实验分组用注射用氯化钠溶液配置成不同浓度。

心肌缺血再灌注损伤模型实验的主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
地尔硫卓(批号：20140205)	上海化学试剂公司
戊巴比妥钠(批号：08490251)、氯化硝基四氮唑钠(批号：0824123)	sigma公司
氯化钠注射液、肝素钠注射液	山东济南步长制药有限公司(批号：089021)
丙二醛试剂盒(批号：20140521)、超氧化歧化酶试剂盒(批号：20140320)、乳酸脱氢酶试剂盒(批号20140602)、谷胱氨酸过氧化物酶试剂盒(批号：20140721)、肌酸激酶同工酶试剂盒(批号：20120421)、内皮舒张因子试剂盒(批号：20140501)	南京建成生物工程研究院
Max Vision^TM免疫组化试剂盒(批号：0802139)	上海拜力生物科技有限公司
SC-3人工呼吸器	上海医疗设备厂
BX51光学显微镜	日本Olympus
RM-2145型石蜡切片机	徕卡公司
RX-2000全自动生化分析仪	北京普利生公司
DG 3022A酶标仪	美国Technicon公司

1.2 造模方法

动物分组：将120只SD大鼠随机分为6组，每组20只，分别为假手术组、模型组、低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组和阳性药物组。假手术组灌胃给予生理盐水2 mL/(kg•d)，连续2 d；模型组灌胃给予生理盐水2 mL/(kg•d)，连续2 d；低、中、高剂量给药组分别灌胃给予10，20，30 mg/(kg•d)人参皂苷Rb₃，连续2 d；阳性对照组给予地尔硫卓20 mg/(kg•d)，连续2 d。

大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立：给药2 d后，假手术组只开胸，不做任何处理；其余5组大鼠称质量后，腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，仰卧固定在专用木板上，颈前切口，暴露气管，于2、3环状软骨之间切开大鼠气管，接入人工呼吸器，固定气管，调节人工呼吸器参数(呼吸频率60次/min，潮气量20 mL/kg，呼吸比1∶1，呼气末气压0.5-1.0 kPa)吸入室内空气。自三四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包膜，轻轻按压将心脏挤出，用4-0单股手术线结扎冠状动脉左前支，在左心耳下缘3.0-4.0 mm进针，在左室心肌穿线，深约1.5 mm，再斜向右上方肺动脉方向进针，针距3.0-4.0 mm，稳定1 min后，收紧手术线进行结扎，将心脏送回胸腔，挤出血液与空气，关闭胸腔。30 min后，松解手术线，进行心肌再灌注120 min，缝合。

1.3 造模成功标准当大鼠血清中同工酶、丙二醛、乳酸脱氢酶等生化指标明显上升时，提示造模成功。

1.4 主要观察指标

血清生化指标：大鼠心肌损伤再灌注48 h后，腹主动脉插管取血，离心制备血清，用RX-2000全自动生化分析仪进行同工酶、丙二醛、乳酸脱氢酶、内皮舒张因子、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶生化指标水平分析。

心肌组织病理变化：解剖大鼠，取出心脏，用氯化钠注射溶液去除心脏瘀血。其中各组10只大鼠进行心肌梗死面积测定，取大鼠心脏，去除心房组织与脂肪并称质量，将左心室切成5片，用氯化硝基四氮唑蓝PBS中，置37 ℃水浴锅中恒温染色后取出，切除不染色的心肌缺血部分组织，用缺血心肌与左心室湿质量比例计算心肌梗死面积。各组另外10只大鼠进行心肌组织形态分析，将心脏用预冷的PBS漂洗，去掉结缔组织和脂肪，横向切取心肌组织，随后用40 g/L多聚甲醛固定，用石蜡包封制备成石蜡切片，依次使用二甲苯进行脱蜡处理、梯度乙醇水化、苏木精及伊红进行染色、乙醇脱水、二甲苯进行透明处理，最后用中性树胶进行封固等操作制备组织切片，利用光学显微镜对心肌组织的病理变化进行观察。

1.5 统计学分析应用STATA 11.0统计软件进行统计学分析，计量资料用x(_)±s表示，多组间比较用方差分析，组间比较用t 检验。

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讨论

心肌缺血是常见心血管疾病，指心脏血流灌注减少，心脏供氧减少，心肌能量代谢失常，无法支持心脏正常工作的一种病理状态，常见原因是冠状动脉粥样硬化^[31]。再灌注是指组织或器官缺血后恢复供血的过程，此过程往往会加重组织损伤^[32]。心肌缺血再灌注损伤已成为冠状动脉搭桥手术、介入治疗及冠状动脉溶栓治疗的常见并发症，目前临床上治疗此病药物主要有硝酸酯类、他汀类、钙离子拮抗剂等，近年来中药也成为心肌缺血再灌注损伤治疗的热点^[33]。

在心肌缺血再灌注损伤中，心肌梗死的部位与心肌梗死面积决定了心肌损伤的程度^[34]，在实验中发现，随着人参皂苷Rb₃给药剂量的增大，大鼠心肌梗死面积百分比程减小趋势，且中、高剂量给药组梗死面积百分比与模型组相比有显著性差异，表明人参皂苷Rb₃在显著降低心肌梗死发生的严重程度。通过心肌组织病理切片的研究中也发现同样的趋势，心肌组织的损伤程度随着人参皂苷Rb₃剂量的增大而降低，虽然低剂量给药组心肌梗死面积百分比与模型组比较差异无显著性意义，但低剂量给药组的病理切片依然与模型组病理切片具有显著不同，表明即使用比较低剂量的人参皂苷Rb₃，对心肌损伤还是具有一定的保护作用。

乳酸脱氢酶广泛存在于心肌、肝、肾等组织中，是体内能量代谢过程中的一个重要酶；同工酶则为同工酶家族中的一员，主要来源于心肌，临床上常用于诊断急性心肌梗死，此两种酶在心肌损伤及坏死时特异性最强。在心肌缺血发生时，心肌细胞由于缺血缺氧而发生器质性损伤，导致心肌组织变性与坏死，心肌细胞中的多种活性酶如乳酸脱氢酶、同工酶等漏出，进入血清中，导致血清中的生化指标水平上升。

在实验中，人参皂苷Rb₃能显著降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中的乳酸脱氢酶及同工酶含量，且呈剂量依赖性，低剂量人参皂苷Rb₃对血清中乳酸脱氢酶无显著性影响，但中剂量及高剂量组都对乳酸脱氢酶及同工酶含量有显著性影响，表明人参皂苷Rb₃可降低大鼠心肌损伤程度，其作用机制可能与心肌酶参与体内能量代谢的过程有关。

内皮舒张因子是由内皮细胞分泌的一种舒张血管的细胞因子，具有有扩张冠状动脉、抑制血小板凝集和中性粒细胞黏附和激活、保护心肌细胞等作用^[33]。在心脏血管内皮细胞受到损伤时，会造成内源性内皮舒张因子生成缺陷，其在血清中的含量也随之下降，因此内皮舒张因子是心肌缺血受损的直接指标^[35]。当心脏恢复供血时，大量氧气充盈心肌组织，使得心肌组织代谢产物积聚，产生自由基，引起细胞过脂质化，造成血清中丙二醛水平上升、超氧化物歧化酶水平下降、谷胱甘肽过氧化酶活性降低^[36]。超氧化物歧化酶的作用为歧化氧自由基，清除体内过量自由基，从而保护细胞免受氧自由基的攻击，因此，超氧化物歧化酶水平下降，会导致体内清除氧自由基的能力降低，同时细胞膜中的不饱和脂肪酸在受到氧自由基攻击时，发生氧化反应，生成丙二醛，通过测定体内丙二醛含量可间接反映机体氧化损伤的程度^[37]。

实验通过研究人参皂苷Rb₃对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用发现，人参皂苷Rb₃能够显著降低大鼠血清中的同工酶、丙二醛、乳酸脱氢酶及内皮舒张因子的水平，显著升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶水平，且具有一定的剂量依赖性，在低剂量人参皂苷Rb₃只对谷胱甘肽过氧化酶、同工酶的水平有显著性影响，而中剂量人参皂苷Rb₃能影响除超氧化物歧化酶以外的其他所有生化指标水平，高剂量人参皂苷Rb₃能显著影响所有生化指标，表明人参皂苷Rb₃能减少心肌细胞的氧化损伤，抑制心肌细胞脂质过氧化，增强心肌细胞的抗氧化能力，保护和改善心脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程