甲胎蛋白和其他血生化指标构建潜在的胆道闭锁患儿早期诊断模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1426

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (31): 5046-5051.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1426

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甲胎蛋白和其他血生化指标构建潜在的胆道闭锁患儿早期诊断模型

杨添淇1，胡晓雯1，周科军2，万春玲1

(1上海交通大学Bio-X研究院，上海市 200030；2上海市儿科医学研究所，上海市 200093)

收稿日期:2019-05-08 出版日期:2019-11-08 发布日期:2019-11-08
通讯作者: 周科军，助理研究员，上海市儿科医学研究所，上海市 200093 通讯作者：万春玲，研究员，博士生导师，上海交通大学Bio-X研究院，上海市 200030
作者简介:杨添淇，男，1994年生，河北省衡水市人，汉族，上海交通大学在读硕士，主要从事复杂遗传疾病的相关研究。
基金资助:
上海市卫生和计划生育委员会科研课题(201640153)，项目负责人：周科军

Plasma alpha-fetoprotein and other biochemical indicators for constructing early diagnosis models of potential biliary atresia in children

Yang Tianqi1, Hu Xiaowen1, Zhou Kejun2, Wan Chunling1

(1Bio-X Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China; 2Shanghai Institute of Pediatric Medicine, Shanghai 200093, China)

Received:2019-05-08 Online:2019-11-08 Published:2019-11-08
Contact: Zhou Kejun, Research assistant, Shanghai Institute of Pediatric Medicine, Shanghai 200093, China Corresponding author: Wan Chunling, Researcher, Doctoral supervisor, Bio-X Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China
About author:Yang Tianqi, Master candidate, Bio-X Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China
Supported by:
the Shanghai Health and Family Planning Commission Research Project, No. 201640153 (to ZKJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胆道闭锁：是一种严重的新生儿肝胆外科疾病，特征为肝内或肝外胆管闭塞引发的黄疸和进行性肝纤维化，早期诊断和治疗对该病患儿的意义重大。但该疾病在病理特征上与新生儿肝炎相类似，目前只能通过腹腔探查等手术手段最终确诊，这些方法操作复杂且对患儿伤害较大，不适合早期诊断。因此寻找简单有效的生物标志物是胆道闭锁研究的重要内容。
甲胎蛋白：由肝脏合成，是血浆白蛋白的胎儿形式，在胎儿及新生儿血浆中含量丰富，在出生后1年内迅速下降至成人水平。甲胎蛋白的表达与肝细胞增殖或肝损伤后的再生过程有关，肝癌或其他类型的肝损伤将导致甲胎蛋白的表达量升高。

摘要
背景：胆道闭锁主要依赖于术中诊断，操作复杂且对待诊患儿的伤害较大，不适合作为早期诊断的方法。因此，寻找简单有效的血液生化诊断指标将改善早期诊断效率。
目的：检测胆道闭锁患儿血浆甲胎蛋白水平，探索甲胎蛋白和血液生化指标在胆道闭锁临床诊断中的应用价值。
方法：收集48例胆道闭锁患儿、20例肝炎患儿与9名健康婴儿血液样本，采用酶联免疫吸附试验测定患儿血浆中甲胎蛋白质量浓度，分析甲胎蛋白与血生化指标的相关性，建立潜在的诊断模型。试验通过新华医院伦理委员会的批准(批准号：XHEC-D-2013-026)。
结果与结论：①胆道闭锁组和肝炎组甲胎蛋白质量浓度显著高于健康组(P < 0.001)，胆道闭锁组和肝炎组甲胎蛋白质量浓度比较差异无显著性意义(P > 0.05)；②48例胆道闭锁患儿中，不同肝纤维分级患儿间的甲胎蛋白质量浓度比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③血液生化指标显示，胆道闭锁组和肝炎组均有严重的肝损伤，两组前白蛋白、γ-谷氨酰胺转肽酶水平比较差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.001)；④甲胎蛋白和 γ-谷氨酰胺转肽酶水平呈现负相关(r=-0.516，P < 0.01)；⑤结合甲胎蛋白、前白蛋白、γ-谷氨酰胺转肽酶及患儿年龄和性别建立了一个潜在的诊断模型，敏感性为81.82%，特异性为91.67%，模型的曲线下面积AUC达到0.939；⑥结果说明，胆道闭锁患儿血浆甲胎蛋白水平明显升高，通过甲胎蛋白等生化指标构建的诊断模型对胆道闭锁临床诊断有一定的参考价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7560-7208(杨添淇)

关键词: 甲胎蛋白, 胆道闭锁, 新生儿肝炎, γ-谷氨酰胺转肽酶, 前白蛋白, 血生化指标, 诊断模型, 诊断标记物

Abstract:

BACKGROUND: Biliary atresia is not suitable as a method for early diagnosis because it mainly depends on intraoperative diagnosis, and the operation is complicated, and there is a great injury to the child. Therefore, finding simple and effective blood biochemical diagnostic indicators will improve early diagnosis efficiency.
OBJECTIVE: To measure the plasma alpha-fetoprotein level in children with biliary atresia and to investigate the application value of plasma alpha-fetoprotein level and blood biochemical indicators.
METHODS: Blood samples were harvested from 48 infants with biliary atresia, 20 infants with neonatal hepatitis, and 9 healthy controls. Plasma alpha-fetoprotein level was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The correlation between plasma alpha-fetoprotein level and blood biochemical indicators was analyzed to establish a potential diagnosis model. This study was approved by the Ethics Committee of Xinhua Hospital, China (approval No. XHEC-D-2013-026).
RESULTS AND CONCLUSION: Plasma alpha-fetoprotein level in infants with biliary atresia and neonatal hepatitis was significantly higher than that in the healthy controls (P < 0.001), but no significant difference in plasma alpha-fetoprotein level was observed between infants with biliary atresia and neonatal hepatitis (P > 0.05). There was no significant difference in plasma alpha-fetoprotein level between infants with different stages of cirrhosis (P > 0.05). Blood biochemical indexes indicated severe liver injury in infants with biliary atresia and neonatal hepatitis. There were significant differences in plasma prealbumin (P < 0.05) and γ-glutaminyl transpeptidase levels between infants with biliary atresia and neonatal hepatitis (P < 0.01). Plasma alpha-fetoprotein level was negatively correlated with γ-glutaminyl transpeptidase level (r =-0.516, P < 0.01). A potential diagnosis model was established based on plasma alpha-fetoprotein, prealbumin, γ-glutaminyl transpeptidase levels, age and sex of infant patients, with a sensitivity of 81.82%, specificity of 91.67%, and area under the curve of 0.939. Results suggest that plasma alpha-fetoprotein level increased in infants with biliary atresia. Establishing a diagnosis model based on blood biochemical indicators such as plasma alpha-fetoprotein is of certain reference value for clinical diagnosis of biliary atresia.

Key words: alpha-fetoprotein, biliary atresia, neonatal hepatitis, γ-glutaminyl transpeptidase, prealbumin, blood biochemical indicators, diagnostic model, biomarker

中图分类号:

杨添淇，胡晓雯，周科军，万春玲. 甲胎蛋白和其他血生化指标构建潜在的胆道闭锁患儿早期诊断模型[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 5046-5051.

Yang Tianqi1, Hu Xiaowen1, Zhou Kejun2, Wan Chunling1. Plasma alpha-fetoprotein and other biochemical indicators for constructing early diagnosis models of potential biliary atresia in children[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(31): 5046-5051.

图/表（结果） 5

2.1 参与者数量分析 48例胆道闭锁患儿、20例肝炎患儿与9名健康患儿血液样本均进入结果分析。

2.2 试验流程研究以甲胎蛋白水平与血生化指标为基础，在胆道闭锁与新生儿肝炎患儿中进行了一系列的分析，以探讨甲胎蛋白及其他指标在早期诊断的应用价值。试验流程见图1。

2.3 甲胎蛋白在各组中的水平研究中样本的一般信息见表1所示。据文献报道，正常婴儿出生后其血液的甲胎蛋白含量会有迅速降低的趋势，因此研究婴儿血浆甲胎蛋白浓度时必须考虑年龄的影响，理想情况下应当选择日龄相差较小且组间相互匹配的样本。研究所采用的样本中，胆道闭锁组和肝炎组年龄相匹配，一般都在1-3个月。但肝炎组分布较宽，与其他2组不完全匹配。因此，将所有样本按照日龄分为4个亚组，分别进行比较。同时引入了Wu等^[11]的研究作为参考值，为各个年龄段的婴儿甲胎蛋白水平提供参考。

图2A检测结果显示，胆道闭锁组和肝炎组血浆甲胎蛋白水平均显著高于健康组(K-W检验P < 0.001)，同时胆道闭锁组和肝炎组血浆甲胎蛋白值差异无显著性意义(K-W检验P > 0.05)，见表2。

2.4 胆道闭锁患儿肝纤维化水平与甲胎蛋白浓度无关胆道闭锁患儿一般伴发不同程度的肝纤维化，并呈渐进性发展趋势。肝纤维化水平可反映胆道闭锁患儿肝脏损伤的严重程度。

研究中的48例胆道闭锁患儿均伴发肝纤维化，纤维化水平由临床医生通过METAVIR标准进行分级，分级标准：0为无纤维化；1为汇管区纤维性扩大，但无纤维间隔形成；2为汇管区纤维性扩大，少数纤维间隔形成；3为多数纤维间隔形成，无硬化结节；4为肝硬化。依据肝纤维化水平对胆道闭锁患儿进行分组，比较了组间甲胎蛋白水平，发现不同肝纤维化水平的患儿血浆甲胎蛋白无显著差异，见图2B。

2.5 胆道闭锁患儿血生化指标总体情况收集了患儿一系列血生化检查的指标，包括血细胞统计指标、肝功能指标和凝血功能指标等。但由于各个患者所接受的检查差别较大，一些指标缺失值较多。此次研究中保留了缺失值小于50%的生化指标纳入后续分析。在这些指标中，有9项指标在胆道闭锁组或肝炎组中出现异常，分别是前白蛋白、总胆汁酸、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、总胆红素、直接胆红素和白球比。异常指标均与肝功能相关，提示胆道闭锁和肝炎患儿肝脏均受到严重损伤。在这些异常指标中，有2项指标在胆道闭锁和肝炎组之间表现出显著的差异，见图3A，B，分别是前白蛋白和γ-谷氨酰转肽酶，提示这2种物质有作为鉴别两种疾病的潜力。

2.6 γ-谷氨酰转肽酶水平与甲胎蛋白浓度负相关通过Spearman检验方法研究了胆道闭锁和肝炎患儿各项血生化指标与甲胎蛋白水平之间的相关性。发现在所有纳入分析的血生化指标中，仅有γ-谷氨酰转肽酶一项与甲胎蛋白值显著相关，见图3C。甲胎蛋白和γ-谷氨酰转肽酶水平呈现负相关，Spearman相关系关系数为r=-0.516，P < 0.01。不仅如此，当胆道闭锁和肝炎分别进行计算时， γ-谷氨酰转肽酶和甲胎蛋白仍然都呈现出显著的相关性及相似的相关系数(胆道闭锁组：r=-0.513；肝炎组：r=-0.446)。

2.7 通过血生化指标构建诊断模型研究中联合了年龄、性别、甲胎蛋白、前白蛋白、γ-谷氨酰转肽酶5项指标，通过二元Logistic回归方法构建了用于鉴别胆道闭锁和新生儿肝炎的诊断模型。通过该模型，可以将胆道闭锁患者和新生儿肝炎患者很好的区分开。图3D的ROC曲线显示该模型的曲线下面积AUC可达0.939，该模型的敏感性为81.92%，精确性为91.67%。

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引言

胆道闭锁是最严重的新生儿肝胆外科疾病之一，其病理特征为肝内或肝外胆管闭塞引起的严重胆汁淤积与进行性加重的肝纤维化^[1]。如果不经治疗，胆道闭锁患儿通常在1年内死亡^[2]，一般而言，在出生后60 d左右行Kasai手术的患儿存活率最高^[3]。但由于胆道闭锁和新生儿肝炎两种疾病症状相似，难于鉴别，目前诊断胆道闭锁主要依赖于肝活检和剖腹探查和术中胆管造影等方法，这些方法虽然准确率高，但操作复杂且对待诊患儿的伤害较大，不适合作为早期诊断的方法。与此相对，血生化检查易于实施且对患儿伤害甚微，而且众多的生化指标可全面反映患儿病理状态。因此，寻找简单有效的生化指标是胆道闭锁早期诊断的重要研究方向。

甲胎蛋白是胎儿血浆蛋白的主要组成成分之一^[4]，一般被认为是血浆白蛋白的胎儿形式。甲胎蛋白在胎儿及新生儿血浆中浓度极高，并在出生后快速下降^[5-6]，在1岁之前降至成年人水平，即低于10 µg/L^[7]。某些癌症可引起甲胎蛋白异常升高，如肝细胞癌^[8]、非精原细胞性生殖细胞瘤^[9]、卵黄囊瘤^[10]。因此，甲胎蛋白作为肝癌筛查的生物标记物已使用多年。甲胎蛋白在多种新生儿肝病中也被发现升高，但甲胎蛋白在胆道闭锁这一疾病中较少被研究。甲胎蛋白作为血生化指标的一种，在临床诊断上应用广泛且易于检测，考虑到胆道闭锁患儿肝脏功能严重受损，可能会出现甲胎蛋白水平异常。试验的目标在于研究胆道闭锁患儿血浆甲胎蛋白的水平，并通过通过甲胎蛋白和其他血生化指标构建潜在的诊断模型，为胆道闭锁的早期诊断提供参考。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计观察性试验。

1.2 时间及地点试验于2017年4月至2018年10月在上海交通大学附属新华医院及上海交通大学Bio-X研究院完成。

1.3 对象收集48例胆道闭锁、20例肝炎患儿和9名健康对照婴儿的血液样本，其中胆道闭锁患儿血液样本为腹腔探查术前采血或血生化检测剩余血样。所有样本均收集自上海交通大学医学院附属新华医院小儿外科。研究中所涉及的临床信息包括血生化指标、年龄、性别等均采集自患儿病例。血样和临床信息的采集经过新华医院伦理委员会的批准(批准号：XHEC-D-2013-026)，所有患儿监护人均已签署书面知情同意。

1.4 方法使用Human Alpha-fetoprotein Quantikine ELISA试剂盒(R&D Diagnostic Products，Minneapolis， US)检测血浆甲胎蛋白水平。用试剂盒中提供的标准品建立甲胎蛋白标准曲线，所有血浆样品预先稀释5倍以满足线性检测范围；将每个样品或标准溶液总共50 μL添加到96孔板中，板底结合有人甲胎蛋白特异性单克隆抗体，之后用辣根过氧化物酶结合的人甲胎蛋白多克隆抗体结合甲胎蛋白分子，添加底物溶液与辣根过氧化物酶反应30 min；最后，加入停止液终止反应，测定450 nm处的吸光度。根据吸收率、标准曲线和稀释率计算各样品中甲胎蛋白质量浓度。

1.5 主要观察指标各组血样甲胎蛋白质量浓度。

1.6 统计学分析由于数据呈非正态分布，使用非参数检验(包括Kruskal-Wallis检验或Mann-Whitney检验)来评估各组之间的差异。使用Spearman相关性检验评估甲胎蛋白与其他血生化指标的相关性。数据分析通过SPSS 18.0 (SPSS，Chicago，IL，USA)统计软件完成，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

胆道闭锁的早期诊断对患者意义重大，可节省患者宝贵的治疗时间。术前诊断方法包括肝活检、胰胆管造影、肝胆造影和十二指肠管检查，诊断准确率高，但操作复杂且费用高，增加了患者家庭的经济负担。此外，肝活检和十二指肠管检查将涉及不必要的手术，并给疑似患儿带来额外伤害。因此，简单有效的诊断生物标志物对胆道闭锁的早期诊断具有重要意义。血液生化检查在临床上应用广泛，可反映患者体内许多重要情况的细节，但目前较少有研究关注胆道闭锁的血液生化指标。此次研究发现胆道闭锁患者血浆甲胎蛋白水平明显高于正常婴儿。此外综合比较了胆道闭锁和肝炎患儿的血生化指标，构建了一个有效的诊断模型。该模型中涉及的指标在临床上均容易检测，增强了该模型的实用性。

此次研究发现，胆道闭锁患儿的血浆甲胎蛋白水平明显高于健康婴儿。甲胎蛋白在胎儿肝脏中高度表达，最高质量浓度约为105 µg/L^[11]，但在健康成人肝脏中几乎不能检测到。在某些病理条件下，甲胎蛋白可在肝脏的特定区域被检测到。研究表明，D-半乳糖胺(GalN)致大鼠化学损伤4 d后，血浆甲胎蛋白达到(2.08±0.67) mg/L的峰值质量浓度^[12]。肝切除术后肝脏中也可检测到高甲胎蛋白表达。甲胎蛋白表达与肝损伤后的再生过程有关。在胆道闭锁患儿肝脏中，由胆汁毒性和炎症引起了肝细胞坏死^[13]，随后在肝脏再生过程中细胞增殖过程被激活。此次研究中观察到胆道闭锁婴儿血浆甲胎蛋白水平显著升高，这一现象提示胆道闭锁患儿肝受损伤后处于细胞增殖活跃的状态。

不同种类的肝损伤对应不同的肝再生模型，轻度损伤或部分肝切除后，肝再生主要表现为原先存在的肝细胞的增殖^[14-15]；急性肝坏死时，肝祖细胞(也称卵圆细胞)聚集在门静脉周围，主导肝再生的过程^[16]。肝祖细胞可分化为肝细胞或胆管细胞^[17]，这些新生的细胞可从门脉区迁移到实质并替换受损的细胞^[18]。在2种模型肝再生中均可检测到甲胎蛋白表达的显著增加。胆道闭锁患者的肝组织常发生进行性肝纤维化和导管反应(导管反应是指由于胆管细胞增殖，在门脉基质周边出现的小管增生^[19])，并可在门区周围检测到肝祖细胞的出现^[20]。由于这些原因，作者认为胆道闭锁的肝再生模式主要基于第2种模型。在这个模型中卵圆细胞通常被认为是甲胎蛋白的主要来源^[21]。

肝纤维化是胆道闭锁的主要病理特征之一，纤维化始于肝星状细胞的激活。肝星状细胞主要由转化生长因子β激活^[22]，并由单核细胞趋化蛋白1募集^[23]。在胆道闭锁患者中，导管反应中的未成熟胆管细胞表达高水平的转化生长因子β和单核细胞趋化蛋白1，可促进肝星状细胞的活化和募集^[24-25]。但肝星状细胞对甲胎蛋白的表达几乎不起作用。此次研究发现不同纤维化程度的胆道闭锁患儿甲胎蛋白水平无显著性差异。这一发现表明，尽管胆道闭锁婴儿的肝脏中同时存在纤维化和肝再生，但它们应该是相对独立的过程。

血液生化检查发现，胆道闭锁患者血浆γ-谷氨酰转肽酶浓度显著高于肝炎患者。γ-谷氨酰转肽酶是一种催化功能性γ-谷氨酰基团转移的酶^[26]，它通常作为肝功能的指标，在胆汁淤积性黄疸或其他肝病患者的血清中可检测到水平异常升高^[27]。然而，与肝炎和其他类型的胆汁淤积性黄疸婴儿相比，胆道闭锁患儿的血浆γ-谷氨酰转肽酶水平明显更高^[28-29]。γ-谷氨酰转肽酶主要由胆管上皮细胞表达^[30]，研究表明与肝炎患者相比，胆道闭锁患者肝组织中有更多的胆管细胞^[19]，符合病理性导管反应。该模式与此次研究结果一致，即胆道闭锁患儿的γ-谷氨酰转肽酶水平高于肝炎患儿，因此认为γ-谷氨酰转肽酶是胆道闭锁患者肝内胆管细胞异常增殖的结果。

此次研究发现甲胎蛋白指标在胆道闭锁中的异常表现，并提供了一个基于易于获取的生化指标区分胆道闭锁和肝炎的模型，该模型表现良好。但研究也存在一定的局限性：首先，研究中所纳入的样本量不是很大，胆道闭锁作为发病率在万分之一以下的一种罕见疾病，病理样本十分稀缺，在胆道闭锁的研究中47例样本的规模已比较可观，但以这样的样本量进行诊断方法学的研究仍然略显不足；其次，未能从生物学原理层面揭示γ-谷氨酰转肽酶与甲胎蛋白负相关的关系。由于缺乏相关报道，目前还无法对这一结果做出很好的解释。相信随着研究的进一步深入，这种负相关的生物学机制终将被揭示。

总之，随着研究的深入与检测技术的日渐成熟，越来越多的血生化指标将被应用于胆道闭锁的临床诊断中，相信日后胆道闭锁的诊断会变得更精准、更快速、更便捷。

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甲胎蛋白和其他血生化指标构建潜在的胆道闭锁患儿早期诊断模型

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