构建靶向性载脂蛋白E修饰脂质体介导的HSVtk/丙氧鸟苷系统

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.023

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (5): 788-793.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.023

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

构建靶向性载脂蛋白E修饰脂质体介导的HSVtk/丙氧鸟苷系统

张悦红^1，2，高然朋^1，2，于保锋^1，2，王惠珍^1，2，张栋^1，2，弓韬^1，2，郭睿^1，2，王海龙^1，2，程牛亮^1，2，解军^1，2，牛凯³，秦琴³，徐钧³

山西医科大学，¹基础医学院生物化学与分子生物学教研室，²细胞生理学省部共建教育部重点实验室，山西省太原市 030001；³山西医科大学附属山西省人民医院普外科，山西省太原市 030012

修回日期:2014-10-30 出版日期:2015-01-30 发布日期:2015-03-02
通讯作者: 解军，博士，教授，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001；徐钧，博士，主任医师，教授，山西医科大学附属山西省人民医院普外科，山西省太原市 030012
作者简介:张悦红，男，1958年生，山西省临汾市人，汉族，1984年山西医学院毕业，高级实验师，主要从事生物化学与分子生物学专业的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30901821，81172136)；2011年山西省高等学校优秀青年学术带头人项目(晋教财[2011]205号)

Construction of targeting apolipoprotein E-modified liposome-mediated HSVtk/ganciclovir system

Zhang Yue-hong^{1, 2}, Gao Ran-peng^{1, 2}, Yu Bao-feng^{1, 2}, Wang Hui-zhen^{1, 2}, Zhang Dong^{1, 2}, Gong Tao^{1, 2}, Guo Rui^{1, 2}, Wang Hai-long^{1, 2}, Cheng Niu-liang^{1, 2}, Xie Jun^{1, 2}, Niu Kai³, Qin Qin³, Xu Jun³

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
2Key Laboratory of Cellular Physiology by Shanxi Province and State Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
3Department of General Surgery, Affiliated Shanxi People’s Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030012, Shanxi Province, China

Revised:2014-10-30 Online:2015-01-30 Published:2015-03-02
Contact: Xie Jun, M.D., Professor, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Key Laboratory of Cellular Physiology by Shanxi Province and State Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Xu Jun, M.D., Chief physician, Professor, Department of General Surgery, Affiliated Shanxi People’s Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030012, Shanxi Province, China
About author:Zhang Yue-hong, Senior experimentalist, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Key Laboratory of Cellular Physiology by Shanxi Province and State Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30901821, 81172136; the Program for Outstanding Innovative Teams of Higher Learning Institutions of Shanxi Province in 2011, No. [2011]205

摘要/Abstract

摘要：

背景：自杀基因系统无选择性，不仅能杀伤癌细胞，对正常细胞也有同样作用，所以构建靶向性基因治疗载体成为迫切需要解决的问题。
目的：评价载脂蛋白E修饰脂质体(apoE-lipoplexes)介导TK/丙氧鸟苷自杀基因质粒转染对Li-7肝癌细胞的杀伤效果。
方法：apoE-lipoplexes包裹pAFP-TK-IRES2-EGFP真核表达质粒转染Li-7细胞，筛选HSVtk稳定表达细胞克隆(Li-7-tk)，荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白表达，Western blotting检测HSVtk基因表达，MTT法评价HSVtk/丙氧鸟苷系统对Li-7肝癌细胞的杀伤作用。
结果与结论：自杀基因质粒转染Li-7细胞经筛选得到稳定克隆(Li-7-tk)，HSVtk/丙氧鸟苷系统作用于Li-7细胞后，细胞凋亡明显增加(P < 0.01)。在甲胎蛋白阳性的Li-7肝癌细胞中，自杀基因载体稳定表达并有效杀灭癌细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织工程, 脂质体, 甲胎蛋白, 启动子, 单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶, 肝癌细胞, 增强型绿色荧光蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Suicide gene system without selectivity not only kills cancer cells, but also has the same effect on normal cells, so the construction of targeting vector of gene therapy has become an urgent problem to be solved.
OBJECTIVE: To evaluate killing effects of apolipoprotein E modified liposomes (apoE-lipoplexes) mediated TK/ganciclovir suicide gene transfection on hepatocellular carcinoma Li-7 cells.
METHODS: The apoE-lipoplexes packed pAFP-TK-IRES2-EGFP eukaryotic expression plasmids were transfected into Li-7 cells. HSVtk stably expressing cell clone (Li-7-tk) was screened. Fluorescence microscopy was used to observe the expression of enhanced green fluorescent protein. HSVtk gene expression was detected using western blotting. MTT method was used to evaluate the killing effects of HSVtk/GCV system on Li-7 cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Stable clone (Li-7-tk) was obtained through screening suicide gene transfected Li-7 cells. After HSVtk/ganciclovir system acting on Li-7 cells, cell apoptosis rate was significantly increased (P < 0.01). In alpha fetoprotein-positive hepatocellular carcinoma cell line Li-7, suicide gene vector expresses stably and effectively kills cancer cells.

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Key words: Liver Neoplasms, Liposomes, alpha-Fetoproteins, Green Fluorescent Proteins

中图分类号:

R318

张悦红，高然朋，于保锋，王惠珍，张栋，弓韬，郭睿，王海龙，程牛亮，解军，牛凯，秦琴，徐钧. 构建靶向性载脂蛋白E修饰脂质体介导的HSVtk/丙氧鸟苷系统[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 788-793.

Zhang Yue-hong, Gao Ran-peng, Yu Bao-feng, Wang Hui-zhen, Zhang Dong, Gong Tao, Guo Rui, Wang Hai-long, Cheng Niu-liang, Xie Jun, Niu Kai, Qin Qin, Xu Jun. Construction of targeting apolipoprotein E-modified liposome-mediated HSVtk/ganciclovir system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(5): 788-793.

图/表（结果） 3

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引言

原发性肝细胞癌在全球恶性肿瘤排第3位，死亡率很高^[1]。传统疗法如瘤体切除、化疗、放疗，甚至肝移植等，预后均很差^[2]。据此，基因治疗成为肝癌治疗的一种新策略。
自杀基因治疗可以诱导细胞坏死、凋亡，阻碍肿瘤进展^[3-6]。目前HSVtk/丙氧鸟苷自杀基因系统的研究已较成熟，HSVtk基因进入细胞后表达胸苷激酶，与细胞内原有的磷酸激酶共同作用，将丙氧鸟苷磷酸化，生成三磷酸丙氧甲基鸟嘌呤，三磷酸丙氧甲基鸟嘌呤能和dGTP竞争，抑制DNA合成，导致细胞凋亡，同时通过“旁观者效应”杀伤邻近癌细胞^[7-12]。自杀基因系统无选择性，不仅杀伤癌细胞，对正常细胞也有同样作用，所以构建靶向性基因治疗载体成为迫切需要解决的问题。

为增强HSVtk/丙氧鸟苷自杀基因系统对肝癌细胞的靶向性杀伤作用，作者设计出双靶向非病毒基因治疗载体系统。根据apoE可以与肝细胞膜上的低密度脂蛋白受体相关蛋白特异结合的特性^[13-15]，将apoE与普通脂质体结合，构建靶向结合肝细胞的apoE修饰脂质体(apoE-lipoplexes)作为DNA穿膜运输载体，该载体可以携带目的基因靶向转染肝细胞。为了保证HSVtk自杀基因只在肝癌细胞(而不在正常肝细胞)中表达，在质粒DNA载体上重组了甲胎蛋白启动子序列，只在肝癌细胞内启动其下游的HSVtk基因表达，避免HSVtk基因非特异性表达对正常肝细胞的杀伤作用。

文章使用apoE修饰脂质体(apoE-lipoplexes)作为靶向运输基因的载体，以及只在肝癌细胞内表达的自杀基因质粒载体pAFP-TK-IRES2-EGFP，作为一种新的靶向基因治疗系统，研究其对甲胎蛋白表达阳性的肝癌细胞株Li-7的杀伤作用。

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材料方法

设计：靶向基因载体功能实验。

时间及地点：于2012年10月至2014年5月在山西医科大学生物化学和分子生物学实验室完成。

材料：人肝癌细胞株Li-7、载脂蛋白E修饰脂质体(apoE-lipoplexes)和pAFP-TK- IRES2-EGFP真核表达载体由本实验室前期制备并保存^[16-17]。

方法：

HSVtk真核表达质粒载体的扩增：pAFP- TK-IRES2-EGFP真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌，挑取单克隆菌落，在LB培养基内将挑取的菌落接种，于37 ℃，摇床200 r/min充分的振荡培养13 h，取5 mL菌液，于室温下，8 000 r/min离心2 min收集菌体沉淀，将培养基的上清倒去或吸干，在菌体的沉淀中加入250 μL Buffer P1，用枪尖吸打，或采用振荡方法直至菌体彻底悬浮。加入250 μL Buffer P2，立即温和的颠倒离心管8次，混匀后，室温内静置3 min。加入350 μL Buffer P3，立即温和的颠倒离心管8次，至混匀。12 000 r/min离心8 min，将离心后的上清液，全部倒入或吸入吸附柱，9 000 r/min离心30 s，将收集管中的液体倒掉，将吸附柱还放回该收集管中。在吸附柱中加入500 μL去蛋白液Buffer DW1，9 000 r/min的转速离心30 s，将收集管中的液体倒掉，将吸附柱放回收集管中。在吸附柱中加入500 μL wash solution，9 000 r/min离心30 s，弃去收集管中液体，将吸附柱放回同一收集管。将空吸附柱和收集管放入离心机，9 000 r/min离心1 min。取50 μL Elution buffer加入到吸附膜的中央，室温静置2 min，9 000 r/min离心1 min。收集管中得到质粒DNA溶液，-20 ℃保存。

Li-7细胞培养及转染：将Li-7细胞置于含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基内，在体积分数5%CO₂， 37 ℃于细胞培养箱内培养。apoE-lipoplexes脂质体的主要成分为DDAB、DOPE、DSPE-PEG-MAL和apoE，将ApoE-lipoplexes 10 μL包裹4 μg pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒，转染Li-7肝癌细胞。当6孔培养板中Li-7肝癌细胞浓度达到90%时，准备进行转染，将无血清培养基、Opti-MEM从冰箱取出进行复温，注意要平衡好；从培养箱取出Li-7细胞，将原先的培养基吸取弃去，加入无血清培养基，再放回到培养箱培养；取灭菌好的EP管，加入质粒(约5 μg/孔)，每管再加入250 μL Opti-MEM，混匀；另取一个EP管，加入ApoE-lipoplexes(10 μL/孔)和Opti-MEM培养基(250 μL/孔)，轻轻混匀，室温下静置5 min；将2个EP管中的内容合并，250 μL/孔，混匀；室温下静置20 min，将ApoE-lipoplexes-pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒混合液滴加到六孔培养板中，500 μL/孔；将细胞重新放回CO2培养箱培养，4 h之后更换成含体积分数10%血清的RPMI-1640完全培养基。

G418筛选稳定表达HSVtk基因的细胞克隆：细胞转染48 h后，用G418试剂筛选，浓度维持在600 mg/L，2周后，获得稳定表达HSVtk基因的细胞株(Li-7-tk)。配制1 mol/L浓度的HEPES：23.8 g的HEPES(此试剂缓冲能力较强)粉末溶解于100 mL的去离子H₂O，用10 mol/L的NaOH(加入的量会较多)调整pH到7.3，采用滤器过滤除菌(较难进行过滤)，HEPES的终浓度为1 mol/L，4 ℃保存备用。取5 g的G418试剂溶解于10 mL的1 mol/L浓度的HEPES溶液(pH 7.3)，使G418的终浓度为500 g/L，-20 ℃保存备用。制备筛选用的培养基：用RPMI-1640培养基将G418溶液稀释到0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000，1 100，1 200 mg/L共13个浓度，取24孔培养板，每孔加入1 mL含有G418和血清的完全培养基，每个G418浓度设置4个重复，这样每次换培养液就需各个浓度的培养基4 mL，注意要现用现配。筛选稳定表达目的基因的细胞系的实验步骤：将冻存细胞进行复苏，培养，传代3至4次，此时细胞到达良好生长的状态，将细胞分至24孔板(20 000个细胞/孔)，12 h换液，加入G418筛选培养基，继续培养。G418最佳筛选浓度的确定：将培养孔内的培养基用吸头吸除，PBS洗涤1次后，每孔内加入不同G418的浓度筛选用培养基，每隔1 d将筛选培养基更换1次，继续培养10-14 d，以导致细胞全部死亡的最低G418浓度为基准。实验中确定的最适宜的筛选浓度为600 mg/L。将Li-7细胞铺6孔板(20×10⁴/孔)，第2天进行pAFP-TK- IRES2-EGFP质粒转染，6 h后更换新鲜的正常RPMI-1640培养基。转染后的24 h加入最适宜G418浓度的筛选培养基，隔1 d换液1次。在换液一两次后(换液之后培养要过夜)，细胞浓度达50%-80%的时候，枪头吸出所有的培养液，3 000-4 000 r/min离心，吸取上清用0.22 μm滤膜过滤，加2倍体积的新鲜的最佳G418筛选浓度的培养液，混匀(标记为适应性培养基)，4 ℃保存备用。细胞培养到6 d左右，细胞发生大量死亡时，可以更换采用适应性培养基。或者，增加血清浓度，继续培养，如将体积分数10%的血清浓度更换为体积分数20%的血清浓度。培养10 d后，G418浓度调整为原来的1/2，维持筛选的压力。筛选大约14 d后，可有抗性克隆的出现。挑取单克隆：高倍显微镜下，将阳性克隆进行标记，套环法或者刮除法，并和有限稀释法结合，筛选阳性细胞克隆，将其转移入多孔培养板进行培养。套环法：用套环圈住阳性细胞克隆，在套环内加入胰酶或EDTA进行消化，把消化之后的液体吸取到另一个新培养孔中，继续培养。刮除法：刮除隐性的细胞克隆，将阳性克隆消化后继续进行筛选培养。单克隆的鉴定：细胞大量繁殖扩增后，收获细胞提取总RNA，RT-PCR法检测HSVtk基因的表达，同时提取细胞蛋白，用western-blot法检测目的蛋白。

Western blotting检测蛋白表达：将稳定转染pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒的细胞用PBS漂洗3遍，加入细胞裂解液，冰上放置以减少细胞内蛋白的降解，裂解2 h后，14 000 r/min离心15 min，提取细胞蛋白。细胞蛋白经12% SDS-PAGE电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜，以HSVtk抗体(1∶500稀释)为一抗，HRP标记的兔抗山羊IgG(1∶5 000稀释)为二抗，经孵育、洗膜后ECL化学发光并照相，观察细胞HSVtk蛋白的表达，以β-actin为内参照。

MTT法检测丙氧鸟苷对Li-7-tk细胞生长的抑制作用：将Li-7-tk和Li-7细胞以5×10³/孔的浓度接种96孔细胞培养板，加入细胞培养基200 μL，置于体积分数5%CO₂，37 ℃培养24 h，加入丙氧鸟苷，浓度分别为0，25，50，100，200，300，400，500，600，700 mg/L，每个处理均设3个复孔，实验中设置不加细胞的调零组，培养5 d，检测前弃上清，每孔加100 μL含1 g/L MTT的无血清培养基，37 ℃培养4 h，弃上清，每孔加150 μL DMSO，水平震荡，待细胞内的蓝紫色结晶物质充分溶解后，酶标仪上570 nm波长测吸光度(A值)。

细胞生存率 =(A_Li-7-tk-A_调零组)/(A_Li-7-A_调零组)×100%。

主要观察指标：①Li-7-tk细胞克隆生长状况及形态。②Li-7-tk和Li-7细胞中HSVtk蛋白的表达。③HSVtk/丙氧鸟苷系统对Li-7肝癌细胞杀伤后的存活情况。

统计学分析：高然朋负责统计学处理，数据处理应用SPSS 17.0软件和 Graphpad Prism v 5.01软件，采用析因设计分析丙氧鸟苷对Li-7-tk细胞的杀伤作用，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

肝癌基因治疗采用的基因主要有自杀基因、抑癌基因及细胞因子基因(如白细胞介素2、α-干扰素)等^[18-23]。目前应用较多的是HSVtk/丙氧鸟苷自杀基因系统，HSVtk基因表达胸苷激酶后将无毒药物前体丙氧鸟苷转变成细胞毒性物质，诱导细胞凋亡或死亡，还可通过“旁观者效应”将周围肿瘤细胞杀伤^[8-9]。代谢产物直接的毒性作用：自杀基因导入肿瘤细胞后，全身或局部给予注射无毒或低毒的前体药物，在自杀基因表达产生的特异性酶的催化作用下，原来无毒、低毒的前体药物在表达自杀基因的局部被激活，转化成为有杀伤肿瘤细胞作用的高毒性产物，在肿瘤组织局部形成药物浓聚区域，从而可以高效的杀灭肿瘤细胞。自杀基因的杀伤效率，取决于表达特异性酶的肿瘤细胞的数量，并且受到与药物前体转化有关的其他因素的影响。“旁观者”效应。研究发现，HSV-tk系统中，只要转染细胞的含量达到10%-50%，就可以有效的消灭肿瘤，这表明自杀基因的作用，不仅是通过代谢产物直接的毒性作用，诱导转染了自杀基因的肿瘤细胞的死亡，还可以通过“旁观者”效应去杀伤未导入自杀基因的邻近的细胞，最终使杀伤效应得到显著增强^[24]。目前对“旁观者”效应的机制尚没有明确的结论，可能与几种因素有关：细胞凋亡，细胞凋亡发生时，出现大量凋亡小体，凋亡小体中的小泡会包裹自杀基因相关的一些毒性产物和相关的表达产物，包裹后的小泡会被邻近未转染导入自杀基因的肿瘤细胞所吞噬，这样就会将有自杀功能的蛋白质转移给这些肿瘤细胞，导致这些肿瘤细胞发生继发的凋亡^[25-26]。肿瘤血管，肿瘤细胞会分泌产生促血管生长的因子，使得肿瘤组织内血管内皮细胞增殖活跃，容易被携带自杀基因的载体所转染。自杀基因一边杀伤肿瘤细胞，另一边还能杀伤肿瘤的血管内皮的细胞，因此可以抑制肿瘤中血管的生长，减少肿瘤的血液供应，肿瘤组织因此发生缺血性死亡而消失^[27]。免疫炎症反应，有研究认为宿主免疫系统功能的完整是是保证自杀基因治疗实现的前提^[28]。自杀基因治疗过程中，不仅有炎症细胞浸润，还会有细胞因子释放，引起免疫调节分子增加等过程。

但如何将治疗基因靶向和高效的转入肿瘤细胞，目前仍是学者们研究的热点。目前，应用较多的基因导入细胞的载体系统主要有病毒载体和脂质体载体。病毒载体存在制备复杂、有免疫原性、不能体内反复应用、安全隐患等问题，非病毒的脂质体载体系统受到研究者的重视^[29]。脂质体介导DNA进入细胞的研究，已有20多年历史，但其转染率低、稳定性差，限制了脂质体载体在体内的应用^[30]。

本实验根据载脂蛋白apoE可以与肝癌细胞膜上的低密度脂蛋白受体相关蛋白特异结合的特性^[13-15]，将载脂蛋白apoE和普通阳离子脂质体lipoplexes偶联构建一种具有肝癌细胞靶向性的apoE-lipoplexes脂质体。作者在以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的质粒载体上，重组甲胎蛋白启动子序列和HSVtk基因，使其只在甲胎蛋白启动环境阳性的肝癌细胞内表达，启动其下游的HSVtk基因表达。实验证明，pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒能够在Li-7肝癌细胞株内表达，经筛选得到稳定转染HSVtk基因的Li-7-tk细胞株在与丙氧鸟苷联合作用下，产生明显的细胞毒性作用，导致肝癌细胞死亡。稳定克隆Li-7-tk细胞，随着丙氧鸟苷浓度的增加，细胞的生长明显受到抑制，活细胞数量明显减少，表明稳定转染HSV-tk基因的Li-7细胞对HSVtk/丙氧鸟苷系统存在时间和剂量的依赖关系。而对照组Li-7细胞生长没有受到明显影响，说明HSVtk/丙氧鸟苷系统对Li-7肝癌细胞杀伤作用，是有效和安全的。随丙氧鸟苷浓度增加，Li-7-tk细胞死亡增加，当丙氧鸟苷浓度达700 mg/L时，杀伤作用最强。而Li-7细胞组，随丙氧鸟苷浓度增加，未表现出明显杀伤作用。实验表明在不同浓度丙氧鸟苷作用下，细胞存活率也不同(P < 0.01)，Li-7-tk细胞与丙氧鸟苷存在交互作用(P < 0.01)。本研究为肝癌的靶向基因治疗提供一种新的可能。

构建靶向性载脂蛋白E修饰脂质体介导的HSVtk/丙氧鸟苷系统

Construction of targeting apolipoprotein E-modified liposome-mediated HSVtk/ganciclovir system

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