肝匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.009

中国组织工程研究

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

肝匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞

马欣¹，薛改²，刘建芳²，李建立³，侯艳宁^1，2

1河北医科大学研究生学院，河北省石家庄市 050017；2解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北省石家庄市 050082；3河北省人民医院麻醉科，河北省石家庄市 050051

修回日期:2013-08-08 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 侯艳宁，博士，主任药师，博士生导师，解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北省石家庄市 050082 houyn@163.com
作者简介:马欣★，女，1986年生，河北省邯郸市人，汉族，河北医科大学在读硕士，主要从事干细胞方向的研究。 biph2011@163.com
基金资助:
军队“十二五”重点课题(BWS11J002)*，课题名称：成体间充质干细胞移植修复战创伤重要器官功能损害的前沿技术研究

Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by liver homogenate supernatants

Ma Xin¹, Xue Gai², Liu Jian-fang², Li Jian-li³, Hou Yan-ning^{1, 2}

1Graduate School, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China; 2Department of Pharmacology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China; 3Department of Anesthesiology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Revised:2013-08-08 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Hou Yan-ning, M.D., Chief pharmacist, Doctoral supervisor, Graduate School, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China; Department of Pharmacology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China houyn@163.com
About author:Ma Xin★, Studying for master’s degree, Graduate School, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China biph2011@163.com
Supported by:
the Military “Twelfth Five-Year Plan ”, No. BWS11J002*

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验证明大鼠肝组织匀浆上清液能诱导人脐带间充质干细胞发生形态学变化，但诱导后细胞是否具有肝细胞的表型和功能特征尚不清楚。
目的：以人脐带间充质干细胞为研究对象，对肝组织匀浆上清液定向诱导分化后细胞是否具有肝细胞的表型和功能特性进行初步验证。
方法：选取第3代人脐带间充质干细胞，采用肝组织匀浆上清液作为诱导培养基，进行如下分组：单纯肝组织匀浆上清液作为阴性对照组，QSG-7701人肝细胞株作为阳性对照组，基础培养的人脐带间充质干细胞作为标准对照组；肝组织匀浆上清液处理3，5，7 d诱导组；在蛋白水平和转录水平对肝细胞特异性标志物甲胎蛋白、角蛋白18和色氨酸2，3-加双氧酶进行检测。
结果与结论：经肝组织匀浆上清液诱导后，细胞形态发生了显著变化，随诱导时间延长梭形干细胞逐渐减少，细胞呈三角形，多角形或不规则形。肝组织匀浆上清液诱导干细胞3，5，7 d后肝细胞标志物甲胎蛋白、人细胞角蛋白18和色氨酸2，3-加双氧酶在蛋白和mRNA水平均显著高于标准对照组(P < 0.01)。实验结果提示在体外经肝组织匀浆上清液诱导后，人脐带间充质干细胞能够分化为具有肝细胞特异性标记的肝样细胞，并具有部分肝细胞功能。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 人脐带间充质干细胞, 诱导分化, 肝组织匀浆上清液, 肝样细胞, 甲胎蛋白, 人细胞角蛋白, 细胞角蛋白18, 其他基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary experiments have demonstrated that rat liver homogenate supernatants can induce the morphological changes of human umbilical cord mesenchymal stem cells. However, little is known about whether the induced cells have some phenotypic and functional features of hepatocytes.
OBJECTIVE: To investigate whether human umbilical cord mesenchymal stem cells have some phenotypic and functional characteristic of hepatocytes after being induced by liver homogenate supernatants.
METHODS: Passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cells were used and divided into control group (cells were cultured in basic culture medium) and liver homogenate supernatant group (cells were cultured in liver homogenate supernatants for 3, 5, 7 days). Meanwhile, positive control group (QSG-7701 human liver cell lines) and negative control group (simple liver homogenate supernatants) were set up. The protein and mRNA level of hepatocyte markers, alpha-fetoprotein, cytokeratin 18 and tryptophan 2,3-dioxygenase enzyme, were detected at different time points.
RESULTS AND CONCLUSION: After inducement, the stem cells of fusiform shape began to lose their sharp edges and progressively shrunk, and then they changed into hepatocyte-like cells with the morphous of triangle, polygon and anomalism shape. Compared with the control group, the protein and mRNA level of alpha-fetoprotein, cytokeratin 18 and tryptophan 2,3-dioxygenase enzyme significantly increased time dependently after inducement with liver homogenate supernatants (P < 0.01). This study demonstrated that human umbilical cord mesenchymal stem cells are able to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro that possess some functions of liver cells.

Key words: stem cells, cell differentiation, hepatocytes, keratins

中图分类号:

R394.2

马欣，薛改，刘建芳，李建立，侯艳宁. 肝匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.009.

Ma Xin, Xue Gai, Liu Jian-fang, Li Jian-li, Hou Yan-ning. Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by liver homogenate supernatants[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.009.

图/表（结果） 7

2.1 人脐带间充质干细胞的表型及分化潜能鉴定流式细胞仪检测结果显示细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD73、CD105等间充质细胞标志，不表达CD34、CD45、CD31等造血细胞、内皮细胞标志和主要组织相容性抗原HLA-DR。成功进行成骨和成脂诱导，染色后可见脂滴和钙结节。
2.2 肝匀浆上清液诱导培养人脐带间充质干细胞的细胞形态学变化倒置显微镜下观察，未进行诱导培养的人脐带间充质干细胞为均一的长梭形的成纤维样细胞，呈放射状或旋涡状排列生长，见图1。
人脐带间充质干细胞经肝组织匀浆上清液诱导培养3 d后，梭形细胞开始减少，细胞两极回缩，胞体变短，见图2；诱导培养5 d后，梭形细胞继续减少，部分细胞呈三角形或多角形，见图3；诱导培养7 d后，大多数细胞呈不规则形或类圆形，核大而圆，见图4。

2.3 肝匀浆上清液对人脐带间充质干细胞肝细胞相关蛋白表达的影响 Western-blot结果显示：阴性对照组均未见任何蛋白出现，与标准对照组相比，不同时间诱导组甲胎蛋白、色氨酸2，3-加双氧酶和人细胞角蛋白18蛋白表达均显著增强，其中，甲胎蛋白的表达量在诱导5 d时达到峰值，随后下降；人细胞角蛋白18、色氨酸2，3-加双氧酶的表达量均随诱导时间延长而增加，见图5-8。

2.4 肝匀浆上清液对人脐带间充质干细胞肝细胞相关蛋白mRNA表达的影响 RT-PCR结果显示：各诱导组与对照组相比甲胎蛋白、色氨酸2，3-加双氧酶和人细胞角蛋白18 mRNA表达均明显增强，且表达量随诱导时间延长而增加，其中，甲胎蛋白的表达量在诱导5 d时达到峰值，随后下降，与Western-blot结果一致，见图9-12。

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引言

近年来随着组织工程的研究进展，干细胞治疗终末期肝病已经成为最具前景的发展方向。间充质干细胞是一群具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞^[1-2]。脐带间充质干细胞是存在于脐带沃顿胶和血管周围组织中的一种干细胞，相对于其它来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞具有来源丰富、采集方便、分化潜能大、增殖能力强、低排斥免疫原性等显著的优点^[3-5]。

干细胞所处的组织微环境对干细胞的存活、增殖、分化进行严格调控，干细胞在适宜的微环境中能分化为其他类型的细胞。多项研究证实，干细胞移植后可归巢至受损组织器官改善受损组织器官的功能，但其作用机制仍不清楚。近年来有研究者在体外条件下采用组织提取物模拟组织微环境对干细胞进行诱导，从而研究在特定的组织微环境中干细胞能否向该组织细胞定向分化及调控其分化的关键因素。

Choi等^[6]在体外条件下采用大鼠胰腺组织提取物诱导骨髓间充质干细胞，诱导后的细胞聚集成簇形似小岛，能够分泌胰岛素、胰高血糖素、胰多肽、生长抑素等胰腺分泌激素。Wang等^[7]的研究采用大鼠脑组织匀浆上清液模拟脑组织微环境诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞分化，分化后的细胞具有神经细胞形态，表达神经元特异性标志物NSE和神经胶质细胞特异性标志物GFAP。以上研究结果表明体外条件下组织提取液模拟组织微环境能够诱导干细胞向该组织细胞定向分化。

实验采用组织块培养法分离培养人脐带间充质干细胞，利用大鼠肝组织匀浆上清液模拟肝组织微环境对其进行诱导，选取肝细胞特征性标志物如甲胎蛋白、人细胞角蛋白18、色氨酸2，3-加双氧酶等作为评价指标，考察人脐带间充质干细胞在肝组织微环境中是否具有向肝细胞定向分化的能力，以期为临床应用干细胞治疗终末期肝病提供理论和实验依据。

材料方法

设计：细胞形态学观察、分子水平检测。

时间及地点：于2011年1月至2012年8月在白求恩国际和平医院药剂科完成。

材料：

实验动物：健康成年SD大鼠，雄性，体质量(250± 20) g，购于河北省实验动物中心，清洁Ⅱ级，合格证号：1202104。动物饲养环境为清洁级，实验过程对动物的处置符合动物伦理学要求。

脐带来源：取白求恩国际和平医院妇产科足月健康胎儿脐带，约20 cm，经伦理委员会批准，产妇及家属知情同意。

肝匀浆上清液体外诱导人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞实验的主要试剂与仪器：

实验方法：

人脐带间充质干细胞的分离培养、表型及分化潜能鉴定：采用组织块培养法分离获得脐带间充质干细胞，用DMEM/F12培养基+体积分数10%FBS进行传代培养。取处于对数生长期的第3代细胞，采用流式细胞术进行表型鉴定，检测CD105、CD29、CD44、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。并分别进行成骨、成脂诱导， 14 d后分别采用VonKossa染色法检测钙化基质沉淀和油红O染色法检测脂滴^[8]。

诱导培养基的制备：取SD大鼠，2%戊巴比妥钠麻醉后常规消毒，用4 ℃预冷的生理盐水自肝门静脉进行肝脏灌流20 min。灌流结束，取出肝组织置于冰上，剔除被膜及韧带。称取湿质量，按150 g/L加入DMEM/F12培养基；冰浴条件下，用匀浆器将肝组织匀浆。4 ℃，15 000×g离心30 min，取上清液，用0.22 µm的滤器过滤除菌，-70 ℃冰箱保存备用。

实验分组：取第3代人脐带间充质干细胞，以5×10⁵/瓶的细胞密度接种于25 cm²的塑料培养瓶中，待细胞长至80%汇合，吸弃培养液，加入诱导培养基。进行实验分组：①阴性对照组：单纯肝组织匀浆上清液。②阳性对照组：QSG-7701人肝细胞株(上海拜力生物科技有限公司)+高糖DMEM +体积分数10%FBS。③标准对照组：基础培养的人脐带间充质干细胞+ DMEM/F12 +体积分数10%FBS。④诱导培养人脐带间充质干细胞3 d组(3 d)组。⑤诱导培养人脐带间充质干细胞5 d组(5 d)。⑥诱导培养人脐带间充质干细胞7 d组(7 d)。后3组均为肝匀浆上清液诱导培养基培养。倒置显微镜下观察并记录各组细胞形态。并与不同时间收集细胞。

细胞总蛋白提取及Western-blot检测：采用细胞裂解法提取细胞总蛋白，BCA法测定各组样品的蛋白浓度， -70 ℃保存备用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，水浴式电印迹将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入兔抗人甲胎蛋白(1∶100)、色氨酸2，3-加双氧酶(1∶100)、人细胞角蛋白18(1∶10 000)、β-Actin (1∶3 000)一抗；4 ℃，摇动过夜。洗膜后加入羊抗兔二抗(1∶2 000)，室温孵育1.5 h，洗膜后采用化学发光法CEL显影，X射线胶片曝光。扫描后应用ImageJ图像分析软件对条带进行相对定量分析。

细胞总RNA提取及RT-PCR检测：采用Trizol法提取各组细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定A₂₆₀数值，计算RNA浓度；并对提取的RNA进行纯度和完整性鉴定。取1 µg总RNA经反转录后得到cDNA，采用RT-PCR方法检测各组肝细胞标志物甲胎蛋白、人细胞角蛋白18、色氨酸2，3-加双氧酶的mRNA表达水平。

参考GenBank发表的mRNA序列，应用GeneTool和Oligo引物设计程序设计引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列、产物长度及相应的退火温度和时间见表1。

凝胶电泳法分析RT-PCR产物，采用Leica凝胶成像系统对电泳结果进行拍照；ImageJ图像分析软件分析电泳结果。

主要观察指标：①细胞流式技术检测细胞表型。②Western blot检测与肝细胞相关标志分子蛋白表达。③RT- PCR检测与肝细胞相关标志分子基因的表达。
统计学分析：以上实验均重复3次，统计结果以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计软件，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对数据进行统计分析。统计结果以 P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肝炎、肝硬化在中国为常见肝脏疾病，且发病率逐年升高，每年中国因为肝炎相关肝硬化引发终末期肝病新增病例数超过500万例，死亡率达到20%-50%，终末期肝病已经成为中国高死亡率的疾病。目前原位肝移植技术仍然是终末期肝病最有效的治疗方式和最后手段，但是由于肝源不足、手术风险大、治疗费用较高、免疫排斥反应、免疫抑制剂的终身服用等问题，制约了肝移植的广泛应用。近年来，干细胞移植的出现为肝病的治疗提供了新的思路。相对于肝移植干细胞移植具有细胞来源广泛、移植技术相对简单有效、安全性高、排斥反应较低、相对成本较低等优势。因此，干细胞移植治疗肝病已成为国内外干细胞的研究热点^[9-12]。

间充质干细胞为来源于中胚层间充质的成体干细胞，主要存在于骨髓、脐血、脐带、外周血及肝脏等器官间质和结缔组织中。现阶段人们对骨髓间充质干细胞研究的较多^[13-15]，但骨髓间充质干细胞存在取材时患者痛苦，病毒等污染率高，随年龄增大细胞量逐渐减少等缺点^[16-17]；人脐带间充质干细胞作为“医疗废物”，不存在社会伦理道德等问题，以其独特的的优点，逐渐成为干细胞中最具有应用前景的种子细胞。

多项动物实验结果表明：干细胞注入动物体内后可分化为具有肝细胞特征和部分功能的肝样细胞，改善肝损伤的情况，替代部分肝脏功能^[18-20]。但其机制不清，而且细胞分化率较低。因此，如果能在体外诱导干细胞分化为具有肝细胞特征和功能的细胞再进行移植，势必会提高移植的成活率，提高治疗效果；寻找一种合适的干细胞体外定向诱导方式具有重要的临床应用价值。

目前国内外学者在干细胞向肝细胞定向分化的研究中，主要集中在细胞因子诱导和共培养两个方面。干细胞的诱导可能是多种因子共同作用的结果，研究者们选取了不同细胞因子的组合和诱导时间来进行实验。研究发现肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和致瘤素M等均对干细胞的分化有明显的调节作用^[21-24]；参与共培养诱导的细胞有肝细胞和非肝实质细胞，如肝细胞和肝星状细胞^[25-27]，但普遍存在的问题是诱导时间长，一般在3周以上，诱导的效率较低。肝组织匀浆上清液中包含多种生长因子和促进细胞分化的物质，相当于模拟肝脏组织的微环境，实验选用肝组织匀浆上清液作为诱导培养基，对人脐带间充质干细胞进行体外诱导，研究结果发现肝组织匀浆上清液对人脐带间充质干细胞向干细胞定向分化具有显著的促进作用。同时，避免了机体免疫系统的影响，减少了吞噬细胞和炎症细胞对干细胞的围杀，使得转化率显著提高。在肝匀浆的制备过程中作者发现150 g/L诱导效果最好，3 d即出现细胞形态的改变和肝细胞特异性标志物表达水平的升高。质量体积比太高或太低都不利于干细胞的分化。在匀浆液的选择上，作者这次研究尝试过不同的培养基和PBS，发现单用PBS，干细胞的分化率极低，最终选择DMEM/F12培养基。在诱导分化的过程中发现，加入肝匀浆诱导后，会在细胞表面形成一层均质物，这些物质可能为部分细胞器和蛋白的沉淀，因此在分组上设计了不加细胞的纯诱导培养基阴性对照组，Western-blot结果显示阴性对照组没有所测目标蛋白，所以排除了其影响；抽提总RNA时纯诱导培养基阴性对照组未提出核酸，因此对RT-PCR也没有影响。

诱导分化后细胞的鉴定，实验选取甲胎蛋白、细胞角蛋白18和色氨酸2，3-加双氧酶为评价指标，从RNA和蛋白水平分别进行检测。甲胎蛋白是一种胞浆蛋白，由肝前体细胞分泌，随细胞成熟而逐渐消失，是未成熟肝细胞的一个特异性标志^[28]。细胞角蛋白18是一种角蛋白，在成熟肝细胞中持续表达，为成熟肝细胞特异性标志物之一^[26]；色氨酸2，3-加双氧酶又称吲哚胺2，3双加氧酶是必需氨基酸色氨酸分解代谢的胞内限速酶，在肝脏内持续表达，色氨酸2，3-加双氧酶的出现说明细胞可能具有肝细胞的功能；研究结果发现人脐带间充质干细胞低表达甲胎蛋白，这与文献报道相符^[23^，^29-30]，诱导3 d后，细胞出现高表达水平的甲胎蛋白，5 d后达到峰值，7 d时水平下降，这一现象与肝系细胞从幼稚到成熟分化过程甲胎蛋白的变化相一致。诱导后细胞角蛋白18和色氨酸2，3-加双氧酶的表达水平随诱导时间的延长而增强，RT-PCR结果与Western-blot结果高度一致，研究结果进一步提示在体外经肝组织匀浆上清液诱导后，人脐带间充质干细胞能够分化为具有肝细胞特异性标记的肝样细胞，并具有部分肝细胞功能。

实验建立了一种体外诱导人脐带间充质干细胞定向分化为肝样细胞的方法，且诱导效率高，所需时间短。研究结果表明：肝组织匀浆上清液在体外条件下能够诱导人脐带间充质干细胞定向分化为肝样细胞，具有肝细胞的特异性标志物甲胎蛋白和细胞角蛋白18，并具有肝脏功能蛋白色氨酸2，3-加双氧酶。肝组织匀浆上清液的成分复杂，其有效成分有待于进一步研究。

肝匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞

Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by liver homogenate supernatants

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