人脐带间充质干细胞与肝细胞共培养可分化为肝样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5772-5777.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.005

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人脐带间充质干细胞与肝细胞共培养可分化为肝样细胞

李华¹，文峰²，漆仲春¹，周进军¹，朱亚杰¹，程朋¹，魏东¹，苏晓妹¹，谭勇¹，彭晶晶¹，罗巧丽¹，李东¹，张涛¹

1解放军成都军区总医院肿瘤诊治中心，四川省成都市 610083
2成都医学院第一附属医院肿瘤科，四川省成都市 610513

收稿日期:2012-09-11 修回日期:2012-10-17 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 张涛，硕士，主任医师，解放军成都军区总医院肿瘤诊治中心，四川省成都市 610083 zhangtao269@126.com
作者简介:李华☆，女，1971年生，四川省成都市人，汉族，2009年解放军第三军医大学毕业，博士，副主任技师，主要从事肿瘤免疫的研究。 Huali99@gmail.com
基金资助:
四川省科技厅面上项目(2009JY0016，2012JY0031)；四川省科技支撑计划(2012SZ0058)。

Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells co-cultured with hepatocytes can differentiate into hepatocyte-like cells

Li Hua¹, Wen Feng², Qi Zhong-chun¹, Zhou Jin-jun¹, Zhu Ya-jie¹, Cheng Peng¹, Wei Dong¹, Su Xiao-mei¹, Tan Yong¹, Peng Jing-jing¹, Luo Qiao-li¹, Li Dong¹, Zhang Tao¹

1Department of Oncology, General Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
2First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610513, Sichuan Province, China

Received:2012-09-11 Revised:2012-10-17 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Zhang Tao, Master, Chief physician, Department of Oncology, General Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610083, Sichuan Province, China zhangtao269@126.com
About author:Li Hua☆, M.D., Associate chief technician, Department of Oncology, General Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610083, Sichuan Province, China Huali99@gmail.com
Supported by:
General Project of Sichuan Science and Technology Deparment, No.2009JY0016*, 2012JY0031*; Key Technology Project of Sichuan Province, No. 2012SZ0058*

摘要/Abstract

摘要：

背景：文献报道，从骨髓与脐带中分离获得的间充质干细胞可在体外连续传代培养，仍保持干细胞的特性，并在多种细胞因子的“鸡尾酒式”诱导下分化为肝细胞样细胞。
目的：进一步验证人脐带间充质干细胞在体外正常人肝细胞共培养体系下是否可分化为肝细胞并探讨其分化方法。
方法：采用贴壁法，从脐带中分离培养间充质干细胞，流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标志。人肝细胞LO2细胞与人脐带间充质干细胞建立共培养体系，不添加外源诱导因子，分别于第7，14，21天，通过RT-PCR 法检测肝细胞特异标志物甲胎蛋白、白蛋白、人细胞角蛋白19 mRNA的表达，糖原染色进行功能鉴定。
结果与结论：从人脐带中可分离得到贴壁生长的间充质干细胞，其中CD29⁺细胞比例为96.02%，CD105⁺细胞比例为96.6%，CD34^-细胞比例为99.65%，CD105⁺CD29⁺双阳性细胞比例为94.84%。与LO2细胞共培养后第7天仅有甲胎蛋白阳性表达；第14天表达白蛋白、人细胞角蛋白19，第21天时，LO2与人脐带间充质干细胞共培养组未出现甲胎蛋白表达；人细胞角蛋白19和白蛋白的表达比第14天略有增强。共培养21 d后，糖原染色呈阳性。结果证实，无需额外添加外源诱导因子，脐带间充质干细胞可在人正常肝细胞共培养的微环境中，向正常肝细胞分化。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 肝细胞, 共培养, 细胞分化, 细胞培养, 肝样细胞, 甲胎蛋白, 白蛋白, 人细胞角蛋白19, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The studies have shown that the mesenchymal stem cells derived from bone marrow and umbilical cord can be continuously cultured in vitro, and maintain the characteristics of stem cells. The mesenchymal stem cells can differentiate into hepatocyte-like cells after “cocktail” induction by various cytokines.
OBJECTIVE: To further identify whether umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in vitro co-cultured with normal hepatocytes can differentiate into hepatocyte-like cells, and to investigate the differentiation method.
METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from human umbilical cord with adherent method, and the surface markers of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were detected with flow cytometry. The umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were co-cultured with liver LO2 cells without adding exogenous inducers. The expressions of alpha-fetoprotein, albumin and human cytokeratin 19 mRNA of hepatocyte specific markers were detected with reverse transcription PCR at 7, 14 and 21 days after culture, and periodic acid-Schiff staining was used to identify the functions.
RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells could isolated from human umbilical cord successfully, showing fibroblastic morphology and adherent cell characterization. Among these cells, 96.02% cells were CD29 positive cells and 96.6% cells were CD105 positive cells. The percentage of CD34 negative cells was 99.65%. The percentage of CD105⁺CD29⁺ double positive cells was 94.84%. The mRNA of alpha-fetoprotein was found on the 7th day after co-cultured with LO2 cells, and the mRNA of albumin and human cytokeratin 19 were found on the 14th day. After co-cultured for 21 days, the alpha-fetoprotein mRNA could not be observed in the co-culture group. The expressions of albumin and human cytokeratin 19 were increased at 14 days. After co-cultured for 21 days, the glycogen staining was positive. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can differentiate into hepatocyte-like cells after co-cultured with normal hepatocytes.

Key words: stem cells, umbilical cord/umbilical blood stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hepatocytes, co-culture, cell differentiation, cell culture, hepatocyte-like cells, alpha-fetoprotein, albumin, human cytokeratin 19, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

李华，文峰，漆仲春，周进军，朱亚杰，程朋，魏东，苏晓妹，谭勇，彭晶晶，罗巧丽，李东，张涛. 人脐带间充质干细胞与肝细胞共培养可分化为肝样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5772-5777.

Li Hua, Wen Feng, Qi Zhong-chun, Zhou Jin-jun, Zhu Ya-jie, Cheng Peng, Wei Dong, Su Xiao-mei, Tan Yong, Peng Jing-jing, Luo Qiao-li, Li Dong, Zhang Tao. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells co-cultured with hepatocytes can differentiate into hepatocyte-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5772-5777.

图/表（结果） 4

2.1 人脐带间充质干细胞的形态特征 采用胶原酶Ⅱ消化和密度梯度离心收集的细胞接种培养，3 d后可见有少量纺锤形贴壁细胞，细胞形态为圆形、梭形和多角形，见图1A。通过换液，培养至14 d左右，悬浮细胞集渐减少，贴壁细胞落逐渐增多，占50%左右，见图1B。待细胞生长至80%-90%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，继续扩增细胞。第2代细胞形态见图1C，至第4代生长细胞形态更为均一，见图1D。

2.2 流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞的表面标志 取第4代培养的细胞，通过流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志。结果显示96.02%的细胞高表达CD29，96.6%的细胞表达CD105，表达CD34细胞仅占0.35%，几乎没有表达CD34的细胞，说明所获得的细胞群不是造血干细胞来源的细胞。进一步对细胞进行CD34⁺CD29⁺、CD34⁺105⁺、CD105⁺CD2⁺9联合标记后经流式检测，发现所获得的细胞有95.57% CD34⁺CD29⁺双阳性细胞；96.09% CD34⁺CD105⁺双阳性细胞；94.84% CD105⁺CD29⁺双阳性细胞，说明从人脐带中分离培养的第4代贴壁细胞绝大部分为间充质干细胞。见图2。

2.3 人脐带间充质干细胞-肝细胞LO2共培养PAS糖原染色结果 显示人脐带间充质干细胞-肝细胞LO2共培养组21 d时，部分细胞可检测到糖原染色阳性细胞,即胞浆呈桃红色，见图3。阴性对照组细胞胞浆未见明显红色颗粒。
2.4 RT-PCR检测具体的肝细胞基因结果 通过RT-PCR分析肝细胞甲胎蛋白、白蛋白、人细胞角蛋白19 mRNA的表达，共培养实验组第7天，仅有甲胎蛋白mRNA的表达；第14天时白蛋白、人细胞角蛋白19 mRNA出现表达，随时间延长表达更明显；阴性对照组在上述时间点均未检测到阳性表达，见图4-6。

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引言

材料方法

设计：对比观察细胞学实验。

时间及地点：实验于2010年9月至2012年2月在解放军成都军区总医院肿瘤诊治中心完成。

材料：脐带取自解放军成都军区总医院住院的健康足月产妇，均征得父母授权同意及伦理委员会批准。

人脐带间充质干细胞与肝细胞共培养实验应用的试剂及仪器：

实验方法：

人脐带间充质干细胞的分离、扩增：无菌收集脐带，浸没于含1%双抗(青链霉素)PBS内。超净台上剪取约2 cm长的脐带，剖开动静脉，用PBS洗净血污；将脐带剪碎成肉糜状，加入4 mL的消化液(含400 U/mL胶原酶Ⅱ的PBS)，37 ℃消化1 h。经完全消化后，吸取上清，离心收集细胞，接种到含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基的T25培养瓶内，置孵箱培养。第3天半量换液，第7天全量换液，待细胞生长至80%融合时，以含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化，根据细胞数量按1∶2-1∶3传代。

人脐带间充质干细胞形态学观察：细胞接种后在倒置相差显微镜下随时观察细胞生长情况、形态变化并于第3，14天及第2，4代细胞的形态变化，并作摄像记录。

人脐带间充质干细胞流式细胞仪检测：取第4代扩增后培养板中的人脐带间充质干细胞，用含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶液于37 ℃消化、收集细胞。调整为4×10⁸ L^-¹每管的单细胞悬液，每管中分别加入抗人CD34-FITC，CD29-PE，CD105-APC单抗各5 µL，对照组加抗鼠IgG1-FITC单抗10 μL，室温孵育30 min，进行流式细胞仪检测。

共培养体系的建立：用6孔细胞培养板与6孔悬挂式细胞培养皿建立共培养模型；取第4代人脐带间充质干细胞，用含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶液消化细胞，经离心、收集、调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，取1 mL接种于6孔板内。待细胞贴壁后，放入具有微孔滤膜的悬挂式细胞培养皿。按照如下进行分组：阴性对照组及阳性对照组，按上下二层均接种相同数量人脐带间充质干细胞及LO2细胞；共培养实验组，取复苏后生长状态良好的P3-P5代正常人肝细胞株LO2以相同的细胞密度接种到上层培养皿中。上下二层各补加L-DMEM完全培养基至3 mL，放入37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱培养，每周2次换液，取7，14，21 d进行后续实验。

RT-PCR检测APF、人细胞角蛋白19、白蛋白mRNA的表达水平：收集各个时间点的细胞，Trizol法提取总RNA，并反转录为cDNA。根据从NCBI检索到的β-Actin、白蛋白、甲胎蛋白和人细胞角蛋白19的核苷酸序列，运用Primer软件设计特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，-20 ℃保存备用。引物和退火温度见表1，采用RT-PCR法，扩增反应条件为95 ℃ 30 s，退火60 s，72 ℃延长45 s，共30个循环。将PCR的产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像分析系统分析结果。

PAS糖原染色：取各个时间点共培养后6孔板细胞，去除培养液，先用40 g/L多聚甲醛固定30 min，再按每孔加入400 μL清理液A(上海杰美基因科技公司)，清洗细胞、共2次，5 min/次；吸尽清理液A，每孔加入400 μL氧化液B，在室温下孵育10 min，再加清理液A，清洗细胞、共2次，5 min/次；小心加上400 μL G染色液，室温密封避光下孵育30 min或直至可见深红色；每孔加入400 μL清理液A ，清洗细胞、共3次，5 min/次；继以苏木精染色液染色3 min，自来水冲洗去多余的染色液，约10 min，蒸馏水再洗涤1遍(数秒钟)，体积分数95%乙醇5 s后直接显微镜下观察。

主要观察指标：①人脐带间充质干细胞的形态特征。②人脐带间充质干细胞的表面标志。③人脐带间充质干细胞-肝细胞LO2共培养PAS糖原染色结果。④RT-PCR检测具体的肝细胞基因结果。

统计学分析：计量资料均以x(_)±s表示，采用SPSS17.0进行均数t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于间充质干细胞有多向分化潜能，人脐带间充质干细胞有望成为移植治疗的理想来源。近来体外经肝细胞生长因子等诱导人脐带间充质干细胞分化成为肝样细胞并表达肝细胞的功能和相关的基因^[8]，这一结果显示了人脐带间充质干细胞有分化潜能并能够分化为肝细胞，但机制目前不是很清楚。在肝细胞再生过程中，细胞间相互作用、分泌的因子和细胞与胞外基质间相互作用，是邻近细胞生长、迁移、分化必不可少的前提条件^[9-10]。间充质干细胞在体内主要局部环境调节，因此，肝细胞微环境可能与间充质干细胞向肝细胞分化紧密相关^[11]。

实验证明了人脐带间充质干细胞与肝细胞间接共培养后，长梭形的间充质干细胞逐渐转变成类圆形贴壁细胞，并检测到了肝细胞相关基因和蛋白的表达，这一结果也显示了细胞与细胞间相互作用是诱导间充质干细胞向肝细胞分化的重要因素。

然而，有研究人员用生长因子诱导间充质干细胞向肝细胞分化研究^[12]，肝细胞生长因子是肝细胞再生的重要成分，但是如果肝细胞生长因子应用于临床诱导间充质干细胞的分化，可能存在着高风险，包括不可控制的分化或激活体内其他细胞，造成弊大于利。因此，实验设计选择无外加生长因子的共培养体系，以更能模拟体内微环境。

目前研究结果显示在共培养的微环境下，2周左右就可通过相差显微镜观察到卵圆形态的细胞及通过RT-PCR分析间充质干细胞基因表达。间充质干细胞是否分化为肝细胞是通过检测肝细胞的一系列相关标志分分子来鉴别，例如：成熟肝细胞的典型标志白蛋白、未成熟肝细胞的标志甲胎蛋白、以及胆管上皮细胞的标志物人细胞角蛋白19。

实验通过共培养后，在第7天通过RT-PCR发现了未成熟肝细胞的标志甲胎蛋白的表达(图4)，在肝细胞与人脐带间充质干细胞组甲胎蛋白表达在14 d时达高峰， 21 d时未检测到。此外，在共培养体系中通过PAS也检测到了阳性表达(图3)。而在共培养第14天的人细胞角蛋白19有微弱的表达，似乎在说明共培养实验组细胞在向肝祖细胞分化，而不是直接向成熟肝细胞分化。

实验从人脐带中成功的分离扩增出了间充质干细胞，并通过无生长因子间接共培养微环境体系，显示了人脐带间充质干细胞可以向肝细胞分化。虽然精确的信号通路机制尚不清楚，但有研究提示可能与noth信号通路有关^[13]。

该实验尚未进行人脐带间充质干细胞和共培养后间充质干细胞裸鼠体内移植实验，检测间充质干细胞的归巢、增殖分化、再生修复功能及对肿瘤生长影响等。随着不断的深入研究，相信间充干细胞终将会应用临床，给患者带来重生的希望。

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