佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (46): 6885-6892.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.006

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佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响

丁燕1，傅友1，单兰兰1，奈文青1，吴洪渊1，唐亮2，陈顺枝1，戴萌1

1南方医科大学南方医院健康管理科，广东省广州市 510515；2中南大学湘雅二医院，湖南省长沙市 410000

收稿日期:2016-08-22 出版日期:2016-11-11 发布日期:2016-11-11
通讯作者: 戴萌，博士，教授，硕士生导师，研究员，南方医科大学南方医院健康管理科，广东省广州市 510515
作者简介:丁燕，女，1990年生，湖南省怀化市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事心血管疾病早筛和慢病体检工作。
基金资助:
广州市科技计划项目(2013J4500040)；广东省产学研项目(2012B091100155)

Effects of Bergapten on the aging of human umbilical vein endothelial cells induced by hydrogen peroxide

Ding Yan1, Fu You1, Shan Lan-lan1, Nai Wen-qing1, Wu Hong-yuan1, Tang Liang2, Chen Shun-zhi1, Dai Meng1

1Department of Health Management, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 2Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410000, Hunan Province, China

Received:2016-08-22 Online:2016-11-11 Published:2016-11-11
Contact: Dai Meng, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Health Management, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Ding Yan, Studying for master’s degree, Department of Health Management, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
the Scientific and Technology Planning Project of Guangzhou, No. 2013J4500040; the Industry-University-Research Project of Guangdong Province, No. 2012B091100155

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
佛手柑内酯：是一种新型的抗炎、降脂的药物，原料佛手为生物学学科香豆素类的一味中药，主治肝气郁结之胁痛、胸闷；肝胃不和、脾胃气滞之脘腹胀痛、嗳气，价格便宜，提取方便，具有显著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低胆固醇、抑制血管平滑肌增殖、改善胰岛素抵抗、抗血小板及抗炎等作用。
人脐静脉内皮细胞衰老模型：成功复制建立了60 μmol/L的双氧水诱导的人脐静脉内皮细胞的衰老模型，可以显著地由不同浓度的佛手柑内酯缓解，其延缓内皮细胞的衰老与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路密切相关。

摘要
背景：有效的中医药治疗可以缓解内皮细胞的衰老，传统的中医药提取较困难，佛手柑内酯提纯简练，价格经济，关于佛手柑内酯在延缓内皮细胞衰老的研究中尚未见报道。
目的：观察佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响。
方法：将人脐静脉内皮细胞采用过氧化氢处理建立衰老细胞模型，并用0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理。通过Western blot法检测各处理组pRb，pAmpk，pS6，LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白，β-半乳糖甘酶染色确定各组衰老细胞数，细胞免疫荧光检测pS6阳性细胞数。
结果与结论：①Western blot结果、β-半乳糖苷酶染色法和免疫荧光检测结果：采用佛手柑内酯后预处理的衰老细胞模型中，pS6，pRb蛋白表达降低，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数和免疫荧光pS6阳性细胞数减少，pAmpk，Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白表达升高(P < 0.05)；②结果说明，佛手柑内酯预处理对双氧水诱导的人脐静脉内皮细胞有一定抗衰老作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-0494-9494(戴萌)

关键词: 组织构建, 血管内皮细胞, 佛手柑内酯, pAmpk, mTOR, 自噬, 衰老, 血管内皮细胞, H2O2, β-半乳糖苷酶染色, pS6, Beclin-1, LC3-Ⅱ

Abstract:

BACKGROUND: The effective treatment of traditional Chinese medicine can alleviate the aging of endothelial cells. Traditional Chinese medicine is difficult to extract, and in contrast, Bergapten is cheap and easily purified, but its antisenescence is little reported.
OBJECTIVE: To explore the effect of Bergapten on H2O2-induced senescence of human umbilical vein endothelial cells.
METHODS: Human umbilical vein cell aging model was induced by H2O2, and pretreated with 0.1, 1 and 10 μmol/L Bergapten, respectively. Expressions of pRb, pAmpk, pS6, LC3-II, and Beclin-1 protein in each group were detected by western blot assay, and the number of aging cells and pS6-positive cells was determined by β-galactosidase staining and immunofluorescence, respectively.
ESULTS AND CONCLUSION: After Bergapten pretreatment, pS6 and pRb protein expressions were significantly downregulated, and the number of cells positive for β-galactosidase and pS6 was significantly decreased, while protein expressions of pAmpk, Beclin-1and LC3-II were significantly increased (P < 0.05). These findings suggest that Bergapten is able to delay the H2O2-induced aging of human umbilical vein endothelial cells

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Cell Aging, Endothelial Cells

中图分类号:

R318

丁燕，傅友，单兰兰，奈文青，吴洪渊，唐亮，陈顺枝，戴萌. 佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(46): 6885-6892.

Ding Yan, Fu You, Shan Lan-lan, Nai Wen-qing, Wu Hong-yuan, Tang Liang, Chen Shun-zhi, Dai Meng. Effects of Bergapten on the aging of human umbilical vein endothelial cells induced by hydrogen peroxide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(46): 6885-6892.

图/表（结果） 3

2.1 不同浓度佛手柑内酯对人脐静脉内皮细胞增殖存活的影响 CCK8法检测结果显示，佛手柑内酯浓度在0-10 μmol/L之间对人脐静脉内皮细胞的增殖存活无显著性意义(P > 0.05)。而100 μmol/L的佛手柑内酯对人脐静脉内皮细胞的增殖存活有显著性意义(P < 0.05)。因此，药物佛手柑内酯浓度在0-10 μmol/L是安全浓度，可以用于后续实验。详见表1。

2.2 各组人脐静脉内皮细胞对mTOR、衰老、自噬相关蛋白表达的影响 60 μmol/L的双氧水处理人脐静脉内皮细胞模型组与对照组相比，pS6，pRb蛋白条带表达显著增高，pAmpk，Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低(P < 0.05)。0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细胞24 h后再加60 μmol/L H₂O₂处理组，与模型组比较，pS6，pRb蛋白表达显著下降，pAmpk，Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白表达显著增高(P > 0.05)。具体结果见图1，表2。

2.3 各组人脐静脉内皮细胞 β-半乳糖苷酶染色结果 β-半乳糖苷酶染色显示，60 μmol/L的双氧水处理人脐静脉内皮细胞的模型组与对照组比较，蓝染的衰老细胞明显增多(P < 0.05)，分别用0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细胞24 h后，与模型组相比较，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率明显下降，具有剂量依赖性(P < 0.05)。具体结果见图2，表3。

2.4 人脐静脉内皮细胞的pS6免疫荧光检测分别用0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细胞 24 h后，与H₂O₂模型组相比较，细胞pS6阳性细胞数(100×)均有下降，随着佛手柑内酯浓度增加，细胞pS6荧光强度和阳性细胞数依次减少，10 μmol/L佛手柑内酯预处理人脐静脉内皮细胞，细胞pS6免疫荧光强度最低，阳性染色细胞数量最少(P < 0.05)。具体结果见图3，表3。

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引言

血管衰老首先发生在血管内皮上，血管内皮细胞组成血管的内壁^[1-2]，参与人体凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等重要的生命活动^[3-4]。内皮细胞衰老是指在细胞生命活动中增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程^[5]。氧化应激也参与内皮细胞衰老， 60 μmol/L的双氧水作用人脐静脉内皮细胞48 h可以建立内皮细胞衰老模型^[6]。活血化瘀中药如白藜芦醇及人参三七川芎对过氧化氢损伤人脐静脉血管内皮细胞的有保护作用^[7]，但是在延缓内皮细胞衰老的机制还知之甚少。

内皮细胞衰老后，mTOR信号通路在调节内皮细胞的衰老中可发挥关键作用，在细胞的生长、增殖、分化、凋亡及衰老等方面都发挥着重要作用^[8]。其由mTORC1/2两个复合物组成^[9-10]，与营养、代谢及衰老密切相关^[11]。其中AMPK的激活介导了TSC1/2的活化作用，抑制了GTP联合蛋白 Ras，从而进一步抑制了mTOR的生物功能^[12-13]，表明AMPK可以通过mTORC1的磷酸化作用加强对mTOR的功能的抑制作用^[14]。

内皮细胞的衰老与mTOR信号通路、自噬及炎症存在密切相关性^[15]，研究发现mTOR信号激活，可以抑制自噬，促进衰老^[16]。自噬是指细胞利用溶酶体途径来实现过多或衰亡的细胞器及损伤蛋白的降解现象^[17-18]，自噬途径的激活是细胞衰老早期的一种潜在保护机制。自噬在真核生物体内广泛存在，在清除细胞长寿命和异常聚集的蛋白以及老化的细胞器方面起着重要的作用^[19]，当细胞缺乏能量时，可以通过自噬降解部分氨基酸等小分子，重新进入到细胞结构的再循环之中，此时自噬可以增加细胞的和生长存活。但是自噬过度也可以导致细胞程序性死亡。炎症也与内皮细胞衰老存在密切相关^[20]，细胞衰老促进炎症因子的分泌和释放。

佛手柑内酯作为一种新型的具有抗炎、降脂的药物^[21]，具有较强的抗癌作用^[22]。现代药理研究表明，佛手柑内酯具有很强的药理活性，可以扩张冠状动脉、钙拮抗和解痉镇痛^[23]，在中药羌活中容易提取^[24]。临床用于辅助治疗动脉硬化性心脏病、冠心病等血管狭窄痉挛症状，但与血管内皮细胞衰老的关系尚不清楚，与抗衰老的研究报道甚少^[25]。因此，研究佛手柑内酯与人脐静脉内皮细胞衰老的关系有着重要的研究意义。佛手柑内酯是否通过与mTOR信号通路调控自噬发挥在人脐静脉内皮细胞抗衰老方面的功效。活血化瘀中医药发挥一定的抗衰老作用机制仍然不清楚，因此，寻找新的抗自由基和保护血管内皮细胞的药物对于防治心血管、衰老相关疾病有着重要意义。

实验以此观察验证佛手柑内酯对H₂O₂诱导的人脐静脉内皮细胞衰老的影响，首次探讨其延缓衰老的初步机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2015年3月至2016年5月在南方医科大学细胞生物学实验室完成。

1.3 材料

细胞：人脐静脉内皮细胞为南方医科大学基础医学院保存细胞株，人脐静脉内皮细胞是用胶原酶消化脐带静脉所得的血管内皮胞。经流式细胞仪检测细胞表面标记CD31，CD45，细胞纯度和活性分别达到95%和90%以上。实验在细胞生物教研室完成，属于基础科研试验设计。

佛手柑内酯：一种化学物质，分子式为C₁₂H₈O₄，中文别名5-甲氧基补骨脂素。购买于中国药品检验所，质量合格，颜色为白色结晶粉末，使用时溶于生理盐水。

1.4 方法

1.4.1 人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定将在含体积分数10%胎牛血清高糖DMEM(美国Gibco 公司)培养液的人脐静脉内皮细胞置于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱培养(日本三洋公司)，当细胞长至80%时，以体积分数0.25%胰酶(美国Gibco公司)消化传代^[26]。倒掉培养基，用无菌的PBS清洗3次，加入2.0-3.0 mL的体积分数0.25%胰酶消化细胞，在显微镜下观察细胞变圆，即加入3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到1个15 mL无菌离心管中，1 000 r/min，离心5 min。倒掉上清，加入4 mL新鲜培养液，以后照此传代培养。实验取第2-4代对数期细胞。细胞鉴定可采用第Ⅷ因子相关抗原检测法鉴定所培养细胞为是人脐静脉内皮细胞^[27-28]。

1.4.2 H₂O₂诱导的人脐静脉内皮细胞衰老模型的建立将此人脐静脉内皮细胞系暴露在60 μmol/L H₂O₂的含体积分数10%胎牛血清(美国Gibco公司)高糖DMEM培养液^[29]，吹散细胞，将所有液体转入的培养皿中，37 ℃培养，以后每隔2 d换1次培养基。取对数生长期细胞，调整细胞数为1×10⁵个，每孔100 μL接种于96孔培养板，每组设6个平行孔。选取过氧化氢诱导后的24，48 h动态观察，用普通显微镜观察细胞形态的变化，采用SA-β-半乳糖苷酶(南京建成生物工程研究所)染色鉴定衰老的细胞^[30]。

1.4.3 CCK8法检测佛手柑内酯对人脐静脉内皮细胞增殖的影响利用CCK-8(南京建成生物工程研究所)检测评价细胞的增殖能力^[31]。将细胞悬液按每孔1×10⁵个细胞接种于96孔细胞培养板，在37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养数小时使细胞贴壁。培养细胞待细胞贴壁且状态良好，生长至70%-80%融合时，换含不同浓度梯度(0.1，1，10，100 μmol/L)佛手柑内酯培养液，根据实验设计进行分组，每组设6个平行孔，每孔加培养液100 μL，置于CO₂培养箱中，37 ℃继续培养12 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，37 ℃继续孵育4 h，用酶标仪测定450 nm波长时的吸光度值，取其平均值，每项实验重复3次^[32]。

1.4.4 Western blot法检测细胞中pRb，pAmpk，pS6，β-actin，LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白的表达提取各组人脐静脉内皮细胞总蛋白，调整各样品上样量为10 μL，在10%的SDS-PAGE 凝胶电泳(美国Bio-Rad公司)后转到PVDF膜上^[33]。体积分数5%的脱脂奶粉室温封闭1 h后，剪下相应条带的PVDF膜，分别加入兔抗pRb抗体(1∶ 1 000)、兔抗pS6抗体(Ser235/236)(1∶2 000)、兔抗p-Ampk抗体(1∶1 000；美国Cell Signaling Technology公司)、兔抗LC3-Ⅱ抗体(1∶1 000)、兔抗Beclin-1抗体(1∶1 000)和兔抗β-actin(1∶3 000；美国Sigma公司) 抗体，4 ℃摇床过夜。第2天用1×TBST洗膜3次后，在辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(美国Cell Signaling Technology公司)中室温孵育1 h，1×TBST洗涤3次后进行暗室曝光显影。

1.4.5 β-半乳糖苷酶染色法检测人脐静脉内皮细胞的衰老情况 β-半乳糖苷酶染色法是一种基于衰老SA-β- Gal活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法^[34]。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。

实验分5组，依次为对照组、60 μmol/L的过氧化氢处理组(模型组)、0.1，1，10 μmol/L佛手柑内酯预处理+过氧化氢处理组，各给药组给药保护24 h后加入 60 μmol/L H₂O₂作用48 h。各组细胞药物作用时间结束后，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1 mL的β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。

吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液。37 ℃孵育过夜，用保鲜膜封住6孔板防止蒸发，实验重复6次。普通倒置光学显微镜下观察^[35-36]。

1.4.6 细胞pS6免疫荧光检测人脐静脉内皮细胞的衰老情况将人脐静脉内皮细胞进行传代，以1x10⁶的浓度均匀种板到6孔板的5个孔，贴壁后换培养基，实验分5组，分组干预措施同上。处理时间结束后，用PBS浸洗6孔板3次，用40 g/L的多聚甲醛固定6孔板15 min，PBS浸洗3次，每次3 min；体积分数0.5% Triton X-100室温通透20 min；PBS浸洗3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在6孔板上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，不清洗，每孔里滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；第2天加荧光标记的二抗：PBST浸洗3次，每次3 min，吸尽孔里多余液体后滴加稀释好的荧光标记二抗，避光37 ℃孵箱孵育1 h，PBST浸洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，对6孔板进行染核，在荧光显微镜(日本Olympus公司)拍照计数^[37]。

1.5 主要观察指标 ①不同浓度佛手柑内酯对人脐静脉内皮细胞增殖存活的影响；②不同分组处理的人脐静脉内皮细胞中mTOR、衰老、自噬相关蛋白表达的影响；③不同分组处理的人脐静脉内皮细胞 β-半乳糖苷酶染色结果；④不同分组处理的人脐静脉内皮细胞的pS6免疫荧光检测结果。

1.6 统计学分析采用统计软件SPSS 19.0进行数据统计分析处理，各组数据均符合正态分布，计量资料以 x(_)±s表示，多组间数据的比较方差分析采用单因素方差分析法方法，若方差齐行LSD检验，若方差不齐行Games-Howell检验。P < 0.05有为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

实验发现佛手柑内酯有一定抗衰老作用，可能通过激活pAMPK-mTOR信号通路增强自噬延缓了内皮细胞的衰老。文章发现内皮细胞衰老模型可以显著地由不同浓度的佛手柑内酯缓解，延缓内皮细胞的衰老与mTOR信号通路密切相关^[38]。衰老模型组中，pRb和pS6蛋白表达升高，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性数增多，细胞免疫荧光pS6阳性细胞数增多，pAmpk，LC3-Ⅱ，Beclin-1表达下降；加佛手柑内酯后，pRb，pS6蛋白表达下降，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性数下降，细胞免疫荧光pS6阳性个数表达下降，pAmpk、LC3-Ⅱ，Beclin-1表达上升，延缓了细胞衰老。说明佛手柑内酯有一定抗衰老作用，可能通过激活pAmpk-mTOR信号通路增强自噬延缓衰老。

实验成功复制了内皮细胞衰老造模，且首次将佛手柑内酯这一中药与血管内皮衰老相联系，具有创新性。内皮细胞衰老是心脑血管疾病的独立危险因素^[39]，如高血压、糖尿病、冠心病等均与内皮细胞衰老相关^[40]。内皮细胞功能障碍被认为是动脉粥样硬化的始发事件^[41]，研究延缓血管内皮细胞衰老机制的有助于减少心脑血管疾病的发生发展^[42]。实验用稳定的双氧水造模方法成功建立了人脐静脉内皮细胞衰老模型^[43]，造模方法规范、经典，具有可复制性。创造性采用具有显著的抑菌抗炎、降低胆固醇、抑制血管平滑肌增殖等作用的佛手柑内酯作用于衰老模型的内皮细胞^[44-45]，首次探讨其与内皮细胞衰老的关系，实验方案可实施性强，结果可信度大。

mTOR信号通路与衰老的关系十分密切，在佛手柑内酯延缓内皮细胞衰老中发挥重要作用。mTOR信号通路在延缓真核生物衰老方面的发挥了关键作用，有最新研究发现mTOR信号受抑制，可以显著延长哺乳动物小鼠寿命^[46]，且与Ampk有密切关系^[47]。实验成功验证了衰老的血管内皮细胞模型中，mTOR信号通路激活，上游抑制性蛋白pAmpk下降、下游蛋白指标pS6上升；加入目标药物佛手柑内酯后，mTOR信号通路受抑制，内皮细胞衰老指标下降，一定程度上延缓了内皮细胞的衰老，但是mTOR与衰老的机制十分复杂，除了pAmpk- mTOR通路外，不排除其他信号通路参与佛手柑内酯延缓衰老的可能。

实验初步发现佛手柑内酯可以延缓内皮细胞衰老可能与pAmpk-mTOR信号通路激活自噬相关^[48]。自噬在细胞衰老反应过程中，往往发生分子伴侣介导的自噬过程，保存必须的组成细胞结构的蛋白和其他材料，自噬增强，有效延缓衰老^[49]，在维持细胞内环境的稳态中发挥重要作用。LC3-Ⅱ，Beclin-1 蛋白对自噬调节起着相当突出的作用，能够间接的反映自噬活动的状态，可作为检测自噬活动的标记蛋白^[50]，在维持细胞正常生长中发挥重要作用。实验成功验证了衰老的血管内皮细胞模型中，LC3-Ⅱ，Beclin-1表达下降，自噬表达减弱；加入目标药物佛手柑内酯后，LC3-Ⅱ，Beclin-1表达上升，自噬表达增强，延缓了内皮细胞的衰老。自噬与mTOR信号密切相关，mTOR信号通路的激活一定程度上可以抑制自噬的活化，当加入佛手柑内酯后，mTOR信号通路受到抑制，同时自噬活化加强，一定程度说明了佛手柑内酯可以延缓内皮细胞衰老可能与Ampk-mTOR信号通路激活自噬相关。

但是实验存在实验条件的局限性和不足，可能细胞计数会有些许偏差，药品使用较为单一，也许可以发现较佛手柑内酯更为有效的缓解人脐静脉内皮细胞衰老的中成药。在后续下一步研究中可能使用为有效的中成药物来进行研究。

综上所述，实验初步认为佛手柑内酯有一定的抗衰老作用。佛手柑内酯作为一种新型的具有抗炎、降脂的药物^[51-57]，可以通过激活pAmpk-mTOR信号通路激活自噬从而延缓衰老，实验结果有助于扩展佛手柑内酯在治疗老年性疾病中的用途，开发新的人体细胞组织衰老抑制物，更好的将人体组织变化和细胞水平代谢机制联系起来，具有较高的临床应用价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响

Effects of Bergapten on the aging of human umbilical vein endothelial cells induced by hydrogen peroxide

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