富血小板血浆促进牵拉成骨的矿化过程

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.005

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (46): 6878-6884.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.005

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富血小板血浆促进牵拉成骨的矿化过程

石博文1，李大伟2，宫先斌3，计国旗4，冯元超4，蔡成阔4，舒衡生1

1天津市天津医院创伤骨科，天津市 300211；2邯郸市中医院骨伤科，河北省邯郸市 056002；3济宁市第一人民医院骨科，山东省济宁市 272011；4天津医科大学研究生院，天津市 300380

出版日期:2016-11-11 发布日期:2016-11-11
通讯作者: 舒衡生，主任医师，硕士生导师，天津市天津医院创伤骨科，天津市 300211
作者简介:石博文，1985年生，河北省邯郸市人，回族，2013年天津医科大学硕士毕业，医师，主要从事肢体延长与畸形矫正的研究。
基金资助:
天津市卫生局重点学科攻关项目(10KG112)

Platelet-rich plasma promotes bone mineralization during distraction osteogenesis

Shi Bo-wen1, Li Da-wei2, Gong Xian-bin3, Ji Guo-qi4, Feng Yuan-chao4, Cai Cheng-kuo4, Shu Heng-sheng1

1Department of Traumatic Orthopaedics, Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China; 2Department of Orthopaedics, Handan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Handan 056002, Hebei Province, China; 3Department of Orthopaedics, Jining NO.1 People’s Hospital, Jining 272011, Shandong Province, China; 4Graduate School, Tianjin Medical University, Tianjin 300380, China

Online:2016-11-11 Published:2016-11-11
Contact: Shu Heng-sheng, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Traumatic Orthopaedics, Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China
About author:Shi Bo-wen, Master, Physician, Department of Traumatic Orthopaedics, Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China
Supported by:
the Key Research Project of Tianjin Health Bureau, No. 10KG112

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
富血小板血浆：是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物。富血小板血浆中含有大量生长因子及蛋白质。1993年Hood等首先提出富血小板血浆概念，并发现富血小板血浆含有丰富的血小板，其数目比全血中数目高3倍以上。血小板中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子，转化生长因子β，类胰岛素生长因子，表皮生长因子，血管内皮生长因子等。目前，在口腔科及骨科领域，富血小板血浆研究很热门。
富血小板血浆的制备：为新鲜血液经低速离心制备而成。将采集的全血在室温下于4-6 h内以27.5- 37.5 r/min低速离心15-20 min(或1 220 r/min离心5 min)，使红细胞、白细胞基本下沉，由于血小板密度轻，大部分保留在上层血浆中，分离出上层血浆，即为富血小板血浆，可获得全血中70%以上血小板。

摘要
背景：富血小板血浆富含多种生长因子，可以促进某些组织的再生。
目的：提取兔自体富血小板血浆，将其注射在牵拉间隙内，通过影像学及组织学评价富血小板血浆对兔牵拉成骨矿化过程的作用。
方法：32只成年日本大耳白兔，分为4组，每组8只。取兔后肢行胫骨上1/3线锯截骨，制作肢体延长动物模型，分别在建模后5，15，25 d局部注射富血小板血浆500 μL 1次，对照组只进行肢体延长，不注射富血小板血浆，术侧肢体完成1 cm胫骨延长。在建模后第35天，处死实验动物，对牵拉新生骨痂进行取材和苏木精-伊红染色，并拍摄兔胫骨正位X射线片。
结果与结论：①按照Lane-SandhuX线评价标准评分：建模后15 d注射组、建模后25 d注射组评分明显优于对照组和建模后5 d注射组；②按照Lane-Sandhuz组织学评价标准评分：建模后15 d注射组、建模后25 d注射组组织学评分明显优于对照组和建模后5 d注射组(P < 0.05)，而建模后25 d注射组的组织学平均评分最高；③结果说明，在兔肢体延长的过程中，提取自体富血小板血浆能够促进骨的矿化成熟，并且在稳定期的中段局部注射，作用最强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID:0000-0002-3488-6327(石博文)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 牵拉成骨, 骨延长, 外固定, 富血小板血浆, 骨矿化

Abstract:

BACKGROUND: The platelet-rich plasma contains various growth factors that could enhance the regeneration of certain tissues.
OBJECTIVE: To observe the effect of platelet-rich plasma on the mineralization process during distraction osteogenesis in rabbits.
METHODS: Thirty-two adult Japanese white rabbits were randomly divided into four groups (n=8 per group). The upper 1/3 tibial osteotomy at the posterior limb was performed in all rabbits, and the 1 cm limb lengthening models were prepared, followed by the local injection of 500 μL platelet-rich plasma at 5, 15 and 25 days. The controls received no treatment. At 37 days after modeling, the rabbits were killed and newly formed callus was removed to undergo hematoxylin-eosin staining, and the frontal X-ray film of tibia was obtained.
RESULTS AND CONCLUSION: Lane-Sandhu radiographic scoring showed that the scores in the injection groups at 15 and 25 days after modeling were obviously better than those in the control group and the injection at 5 days after modeling. Lane-Sandhu histological scoring revealed that the scores in the injected groups at 15 and 25 days after modeling were significantly higher than those in the control group and group at 5 days after modeling (P < 0.05), which highest at 25 days. These results suggest that local injection of platelet-rich plasma can promote bone mineralization during distraction osteogenesis effectively, especially in the middle period of distraction osteogenesis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Platelet-Rich Plasma, Bone Lengthening, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

石博文，李大伟，宫先斌，计国旗，冯元超，蔡成阔，舒衡生. 富血小板血浆促进牵拉成骨的矿化过程[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(46): 6878-6884.

Shi Bo-wen, Li Da-wei, Gong Xian-bin, Ji Guo-qi, Feng Yuan-chao, Cai Cheng-kuo, Shu Heng-sheng. Platelet-rich plasma promotes bone mineralization during distraction osteogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(46): 6878-6884.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰大白兔32只，分为4组，全部进入结果分析。

2.2 一般观察实验过程中发生1只实验动物造模失败，在实验第2天发现胫骨骨折，断裂部位位于远端半针处，分析原因可能实验动物骨骼细，在麻醉恢复后剧烈活动肢体导致骨折，再次补充1只实验动物，其余各组均顺利完成模型建立及预期实验。6只实验兔发生浅表伤口感染，通过局部涂抹红霉素眼膏，感染范围未扩大，顺利完成实验过程，所有实验动物全部完成1 cm的肢体延长。

2.3 X射线检查术后第0天，胫骨上端骨质断裂，断端接触良好，断端无成角畸形，胫骨对位对线良好，外固定半针长度合适；术后第15天，延长区的中央未见明显骨痂生长，各组均完成延长10 mm，各组近端截骨部位可见少量骨痂影像，但未见明显差异；术后第25天，各组新生骨区域均可见低密度的骨痂影像，且密度较 10 d前有所增高，其中建模后15 d注射组再生骨痂的密

度高于其他各组；术后第35天，各组新生骨密度较第25天明显增高，其中以建模后15 d注射组、建模后25 d注射组牵拉成骨区出现大量纵行排列的条索状或片状的影像，骨痂密度较高，而对照组、建模后5 d注射组延长区仍存在少量透光区域(图2)。

按照Lane-Sandhu X射线评价标准评分，各组评分结果及统计结果见表1，2。统计结果显示，建模后15 d注射组、建模后25 d注射组Lane-SandhuX线评分明显高于对照组、建模后5 d注射组(P < 0.05)，差异有显著性意义；建模后25 d注射组平均得分16.0高于建模后15 d注射组(11.25)，且二者之间差异有显著性意义(P < 0.05)；对照组、建模后5 d注射组两两比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 组织学观察空白对照组组织肿胀明显，视野中存在较多纤维组织，骨小梁结构少，未出现哈弗斯管系统及软骨化骨。建模后5 d注射组软骨化骨不活跃，成骨细胞数目较少，骨小梁密度也较低，大量纤维组织填充间隙；建模后15 d注射组软骨化骨不活跃，成骨细胞明显增多，视野中出现低成熟度的骨小梁，但结构致密；建模后25 d注射组成骨行为活跃，出现多个软骨化骨中心，并出现成熟度较高的哈弗斯管系统，骨重塑活跃，骨小梁排列致密，成骨细胞数目丰富，骨陷窝细胞较多(图3，4)。

按照Lane-Sandhu组织学评价标准评分，各组评分及统计结果见表3，4。结果显示，建模后15 d注射组、建模后25 d注射组Lane-Sandhu组织学评分明显优于对照组、建模后5 d注射组，差异有显著性意义(P < 0.05)；建模后25 d注射组组织学评分平均分值最高(12.38)，与建模后15 d注射组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；对照组、建模后5 d注射组之间两两比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3至10月在天津市中西医结合骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选用32只健康新西兰大白兔，体质量2.6-3.2 kg(体质量差异无显着性意义，P > 0.05)，3-5个月龄，在室内恒温条件下，采光通风条件相同，自由饮水，分笼饲养，饲料是统一配制的营养颗粒饲料。

1.3.2 仪器和设备手术器械(天津市中西医结合骨科研究所提供)；X射线机(GE公司)；单臂外固定器(北京骨外固定研究所)；病理切片机及显微镜(天津市中西医结合骨科研究所提供)。

1.4 实验方法

1.4.1 富血小板血浆的制备无菌操作下，从兔耳中央动脉抽取动脉血5 mL，注意注射器应先吸取10%枸橼酸钠0.5 mL，以防血液凝固。

按照Landesberg法^[22]离心2次，第1次200×g力离心10 min，将上层清亮的液体去除，保留下层颜色较深的液体，对其进行相同离心的2次离心，离心过程10 min。离心后，在上层的是贫血小板血浆(platele t-poor plasma，PPP)，去除上层75%的较为清亮的液体，下层即是富血小板血浆。

1.4.2 实验分组将32只成年兔随机分为4组，每组8只。

分组处理：
组别	处理
对照组	只延长不使用富血小板血浆
建模后5 d注射组	术后5 d即在延长刚开始时，在牵拉间隙内局部注射富血小板血浆500 μL 1次(862.00±45.32)×10⁹L^-1
建模后15 d注射组	术后15 d即牵拉结束后，在牵拉间隙内局部注射富血小板血浆500 μL 1次(874.12±44.88)×10⁹ L^-1
建模后25 d注射组	术后25 d即稳定期的中段，在牵拉间隙内局部注射富血小板血浆500 μL 1次(851.00±62.75)×10⁹ L^-1

1.4.3 制作肢体延长动物模型氯胺酮和速眠新Ⅱ按照1∶1的比例进行混合，使用混合液进行兔肌肉注射，注射剂量一般为0.1-0.2 mL/kg(2-4 mg/kg)。当麻醉满意后，对兔的后肢用自制脱毛剂脱毛，手术区域备皮，再用碘伏消毒，将兔的足部用无菌巾包裹，铺无菌洞巾。取侧卧位，在膝关节下1.5 cm，小腿的前外侧纵行切开皮肤、皮下组织，显露胫骨前肌，并将其向前方牵拉，充分暴露胫骨骨干，注意在操作的过程中保护横穿胫骨干表面的滋养血管。

在胫骨结节水平，垂直于胫骨骨干，穿透两侧骨皮质，拧入一根直径2 mm半针，固定在单臂外固定支架针夹上，再通过远端针夹，同样垂直于胫骨干，拧入1枚直径1.8 mm半针。在切口的外侧，寻找到腓骨，并将其小心切断，再将线锯穿过胫骨，缓解截断胫骨，松开钉夹，直视下将截骨两端解剖对位(图1A)，再将钉夹拧紧，生理盐水冲洗创面，关闭伤口。注意调整外固定高度，距离皮肤1个手指的宽度。高度调整好后，确认外固定支架的每个螺丝牢固后，将实验动物放回饲养笼内(图1B)。

1.4.4 术后处理术后室内温度及光照条件和术前一致，使用统一配制的营养颗粒饲料喂养。实验兔可在笼内自由活动。术后第5天开始，调整支架进行肢体延长，延长速度为1 mm/d，1 d 2次调整支架，0.5 mm/次，共延长10 d，总共延长胫骨1 cm。

1.4.5 取材在手术后第35天，用50 mL注射器由兔耳缘静脉注射空气的方法，将全部实验动物处死，对胫骨骨延长新生骨进行取材，置入体积分数4%甲醛中固定，并制作石蜡切片进行光镜观察。

1.4.6 评分标准 X射线检查采用Lane-Sandhu X射线评价标准评分；组织学观察采用Lane-Sandhu组织学评价标准评分^[23]。

1.5 主要观察指标

1.5.1 X射线检查在手术后拍摄实验动物的胫骨正位X射线片，时间分别为：第0，15，25，35天的同一时刻。拍摄前，将实验兔麻醉，拍摄条件为50 kV、30 mA、 0.2 s，投照距离为80 cm，拍摄范围需包括膝、踝关节。

1.5.2 光镜观察将切取的标本置入体积分数4%甲醛中两三天，制作石蜡切片，对制备的切片进行苏木精-伊红染色。

1.6 统计学分析对实验数据采用 SPSS17.0统计软件进行分析和处理，行方差分析，如组间差异有统计学意义，则采用SNK-q检验行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

牵拉成骨技术已被广泛应用于治疗各种骨骼肌肉系统的疑难疾病，如骨缺损、假关节、慢性骨髓炎、肢体不等长及肢体畸形。但此技术主要的缺点之一就是治疗时间较长。Ilizarov教授通过大量动物实验研究，向人们揭示了对于牵张成骨新骨形成的最佳延长频率是每天1 mm。延长速度过快不仅骨形成较差而且会出现严重的软组织挛缩和神经刺激症状。延长速度无法加快的情况下，只有通过缩短新骨的矿化期来减少治疗时间。一些研究从机械和生物学的方法来缩短肢体延长的矿化时间^[24-25]。机械学的方法包括使用内外固定结合的方法。生物学的方法包括低强度的脉冲超声、电刺激、高压氧、重组人骨形态蛋白等^[26-28]。

血小板在止血和伤口愈合过程起重要作用，处于活化时，可释放出多种生物活性因子^[29]。通过离心、浓缩而获得富血小板血浆，可能将得到高水平的生长因子。Marx等^[30]报道富血小板血浆能加速骨修复的原因是有高浓度的血小板衍生生长因子、转化生长因子β和其他生长因子。

Ali等^[31]报道对36只新西兰大白兔使用环形外固定支架进行肢体延长，每天4次，每次延长0.25 mm，共延长20 d。对实验动物进行随机分组，对照度为空白对照，实验组在牵拉结束后，对牵拉区域局部注射富血小板血浆。在牵拉技术后的第10，20，30，40，50天进行放射学检查。牵拉结束后第50天将所有实验动物处死，外固定支架去除，每组又分为2个亚组，分别进行病理学和机械力学研究。结果显示实验组在第40，50天的放射学评分较高，且组织学评分较对照组显着学增高。富血小板血浆注射组的力学性能明显增高。作者认为富血小板血浆能够显著促进牵拉成骨新骨的形成。

根据本研究Lane-Sandhu X射线评价标准和组织学评价标准评分，实验结果表明在牵拉成骨的中晚期阶段使用富血小板血浆可加速牵拉成骨的骨矿化成熟。组织学观察的统计结果显示，建模后25 d注射组(术后25 d)骨小梁的密度最高，提示在矿化中期注射富血小板血浆，对骨再生矿化过程促进作用最强。而建模后5 d注射组X射线评分和组织学评分结果与空白对照组无统计学差异，作者认为，在骨延长的早期可能存在有较多的炎性反应，局部注射富血小板血浆可能被动员参与炎性反应，对后期的骨矿化成熟无明显作用。

Hernandez-Fernandez等^[32]报道对20只4岁山羊实施股骨干截骨骨延长手术，20只山羊分为2组，每组10只，其中1组接受3次富血小板血浆注射，分别在实验开始的第0，10，20天注射，而另一组不接受注射，通过CT和组织学观察，评价富血小板血浆对牵拉成骨的作用。影像学和组织学评价结果均显示，在牵拉成骨早期反复使用富血小板血浆没有促进骨的再生。

已有文献报道将富血小板血浆已应用于人体，来缩短肢体延长的进程。Latalski等^[33]回顾性分析19例肢体延长的患者，将其分为2组，其中10例不接受富血小板血浆注射治疗，9例接受富血小板血浆注射治疗，比较治疗过程中的外固定支架固定时间、外固定指数、并发症，结果显示富血小板血浆组显著性的缩短了治疗时间，作者认为在新生骨区域注射富血小板血浆可有效的缩短肢体延长的治疗时间，从而获得更好地功能结果、改善患者满意度。

综上所述，实验的结果显示富血小板血浆局部注射于牵拉间隙内，能有效的促进矿化期新生骨的成熟，而在矿化中期使用，作用最佳。本课题的下一步研究重点，将是各种生长因子是如何调控及相互作用的，以及更大数量的实验数据揭示富血小板血浆注射于牵拉间隙的准确时间与最终实验结果的相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富血小板血浆促进牵拉成骨的矿化过程

Platelet-rich plasma promotes bone mineralization during distraction osteogenesis

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