骨髓间充质干细胞移植治疗骨关节炎

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
CD4⁺CD25⁺调节性T细胞：是一类最近才被人们认识的免疫调节细胞，起源于胸腺，发挥抑制性免疫调节作用，持续性表达IL-2Rα链(CD25)，具有免疫抑制性和免疫无能性两大特征，在自身免疫性疾病的治疗、肿瘤的免疫治疗以及移植耐受的诱导等方面具有潜在的应用价值。
白细胞介素17：是T 细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。白细胞介素17与受体结合后，可通过MAP 激酶途径和核转录因子κB途径发挥其生物学作用。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和分化能力，能够迁移到组织损伤部位进行组织修复，在多种疾病治疗中被广泛应用。
目的：探讨骨髓间充质干细胞移植对骨关节炎大鼠的治疗作用。
方法：将36只Wistar大鼠随机分为移植组、模型组和对照组，移植组在建立骨关节炎模型后经尾静脉注射骨髓间充质干细胞(5×10⁷/kg)，模型组在建模后经尾静脉注射等量的生理盐水，对照组不予任何处理。各组大鼠于移植治疗后4周评定关节炎指数、关节肿胀度，检测脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平以及血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1水平。
结果与结论：①模型组大鼠关节炎指数明显高于对照组(P < 0.05)，移植组大鼠关节炎指数明显低于模型组(P < 0.05)；②模型组大鼠后肢关节肿胀度明显高于对照组(P < 0.05)，移植组大鼠后肢关节肿胀度明显低于模型组(P < 0.05)；③模型组大鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平明显低于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平明显高于模型组和对照组(P < 0.05)；④模型组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平明显低于模型组(P < 0.05)，移植组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平高于对照组(P < 0.05)；⑤模型组大鼠血清转化生长因子β1水平明显低于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠血清转化生长因子β1水平明显高于模型组和对照组(P < 0.05)；⑥结果表明，骨髓间充质干细胞移植主要通过调节骨关节炎大鼠体内细胞因子水平和免疫功能发挥治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0050-3076(吴丽红)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 骨关节炎, 大鼠, 细胞因子, 调节性T细胞

Abstract:

BACKGROUND: As the ability of self-renewal, differentiation and migration into damaged tissues, bone marrow mesenchymal stem cells have been widely used in a variety of diseases.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on osteoarthritis in rats.
METHODS: Thirty-six Wistar rats were randomly assigned into transplantation, model or control group. osteoarthritis models were established in the transplantation and model groups, followed by tail vein injection of bone marrow mesenchymal stem cells (5×10⁷/kg) or the same volume of normal saline, respectively. Rats in the control group were subjected to no treatment. Four weeks after injection, levels of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells in the spleen, interleukin-17, tumor necrosis factor-α and transforming growth factor-β1 in serum were detected, and arthritis index and the degree of joint swelling were evaluated as well.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, both arthritis index and degree of joint swelling were increased significantly in the model group (P < 0.05), but these indicators exhibited a remarkable improvement after cell transplantation (P < 0.05). Levels of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells in the spleen in the three groups were ranked as follows: the transplantation group > the control group > the model group. The levels of interleukin-17 and tumor necrosis factor-α in serum in the transplantation group were lower than those in the model group but higher than those in the control group (P < 0.05). Highest level of transforming growth factor-β1 was obtained in the transplantation group, followed by the control group and model group (P < 0.05). To conclude, these findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation exert therapeutic effects in osteoarthritis rats by immune and cytokine regulation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Osteoarthritis, Interleukin-17, Tumor Necrosis Factor-alpha, Transforming Growth Factor beta1, T-Lymphocytes, Regulatory, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

吴丽红，陈涛，王瑞. 骨髓间充质干细胞移植治疗骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6782-6787.

Wu Li-hong, Chen Tao, Wang Rui. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6782-6787.

图/表（结果） 1

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态 培养24 h后出现部分细胞贴壁生长(图1A)，培养48 h时细胞呈圆形、多角形或者短棒形，培养第3天时可见部分细胞集落形成，细胞增殖变快，呈纺锤形或者梭形，培养第7天细胞增殖更快，出现大小不等的细胞集落，细胞以纺锤形和多角形为主，集落出现融合，折光性好，培养第12天时，细胞达90%左右融合，基本铺满瓶底(图1B)。传代培养24 h内出现完全贴壁生长，细胞多呈梭形，分布比较均匀，第3代细胞融合呈辐射状或者漩涡状，形态比较均一。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定 流式细胞仪鉴定结果显示：CD29的阳性表达率为94.12%，CD44的阳性表达率为70.1%，CD45的阳性表达率为9.78%，CD90的阳性表达率为94.57%，表明分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。

2.3 各组大鼠的一般情况 各组大鼠在实验期间均存活，未出现死亡现象。

2.4 各组大鼠的关节炎指数和后肢的关节肿胀度 由表1可以看出：移植组、模型组和对照组大鼠的关节炎指数比较差异有显著性意义(P < 0.05)，其中模型组大鼠的关节炎指数明显高于对照组(P < 0.05)，表明关节炎模型制备成功；移植组大鼠关节炎指数明显低于模型组(P < 0.05)，表明骨髓间充质干细胞移植对大鼠骨关节炎有一定的治疗作用。

由表1可以看出：移植组、模型组和对照组大鼠的后肢关节肿胀度比较差异有显著性意义(P < 0.05)，其中模型组大鼠的后肢关节肿胀度明显高于对照组(P < 0.05)，表明关节炎模型制备成功；移植组大鼠的后肢关节肿胀度明显低于模型组(P < 0.05)，表明骨髓间充质干细胞移植对大鼠骨关节炎有一定的治疗作用。

2.5 各组脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平比较由表2可以看出：移植组、模型组和对照组大鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平比较差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组大鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平明显低于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平明显高于模型组(P < 0.05)，移植组大鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平明显高于对照组(P < 0.05)。

2.6 各组大鼠外周血白细胞介素17、肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1水平比较 由表3可以看出：移植组、模型组和对照组大鼠血清白细胞介素17水平比较差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组大鼠血清白细胞介素17水平明显高于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠血清白细胞介素17水平明显低于模型组(P < 0.05)，移植组大鼠血清白细胞介素17水平高于对照组(P < 0.05)。

移植组、模型组和对照组大鼠血清肿瘤坏死因子α水平比较差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组大鼠血清肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠血清肿瘤坏死因子α水平明显低于模型组(P < 0.05)，移植组大鼠血清肿瘤坏死因子α水平高于对照组(P < 0.05)。

移植组、模型组和对照组大鼠血清转化生长因子β1水平比较差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组大鼠血清转化生长因子β1水平明显低于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠血清转化生长因子β1水平明显高于模型组(P < 0.05)，移植组大鼠血清转化生长因子β1水平高于对照组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年3月至2014年9月在郑州大学附属第一医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 清洁级、6-8周龄、雌性健康Wistar大鼠5只，体质量110-130 g，用于分离和培养骨髓间充质干细胞；清洁级、8-12周龄、雌性健康Wistar大鼠36只，体质量150-180 g，用于动物体内实验研究。所有大鼠购自河南省实验动物中心。

实验前饲养于大鼠专用鼠笼，根据实验动物饲养标准进行饲养。实验大鼠经过动物伦理学委员会批准，符合卫生部一级动物标准。

1.3.2 主要试剂和仪器 胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胎牛血清、DMEM-LG培养基、碘乙酸钠(美国Hyclone公司)；PBS(北京中杉金桥生物技术有限公司)；青霉素、链霉素、淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)；APC标记抗小鼠/大鼠CD29单克隆抗体、FITC标记抗大鼠CD44单克隆抗体(美国BD公司)；PerCP/Cy5.5标记抗大鼠CD45单克隆抗体、PE标记抗大鼠CD90单克隆抗体、FITC标记抗大鼠CD4单抗、PE标记抗大鼠CD25单抗(美国 BioLegend公司)；超净工作台(北京半导体设备厂)；离心机(美国Beckman公司)；培养箱(德国Heraeus Biofuge Stratos公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养 将5只大鼠脱颈处死，乙醇浸泡消毒，剪开下肢皮肤，分离双侧股骨和胫骨，用DMEM-LG冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，滤网过滤，将细胞悬液加入离心管中离心，弃去上清液，用培养液重悬细胞，接种到含DMEM-LG培养液的培养皿中进行原代培养，第3天进行全量换液，以后每隔3 d进行1次换液，待细胞生长到90%融合时，用胰蛋白酶消化，加入培养液终止消化，轻轻吹打贴壁细胞，移入到离心管中离心，弃去上清液，加入培养液形成细胞悬液，接种到培养皿中进行传代培养，每天显微镜下观察细胞的生长情况，待细胞达到90%融合时重复传代。

1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定 取生长良好的第3代大鼠骨髓间充质干细胞，加入胰蛋白酶消化，移入离心管中离心，PBS洗涤，然后将细胞移入EP管中，分别加入CD29、CD44、CD45、CD90单克隆抗体及同型对照，室温避光孵育30 min，PBS洗涤，流式细胞仪检测。

1.4.3 制备骨关节炎大鼠模型 将实验大鼠麻醉成功后，右侧膝关节备皮，乙醇常规消毒，于右侧膝关节腔内注射50 μL碘乙酸钠溶液(含碘乙酸钠1 mg，溶于生理盐水50 μL)，对照组大鼠相同部位注射等量的生理盐水。

1.4.4 大鼠分组与处理 将36只大鼠随机分为移植组、模型组和对照组，每组12只。移植组在建模后2周经尾静脉注射骨髓间充质干细胞(5×10⁷/kg)，模型组在建模后2周经尾静脉注射等量的生理盐水，对照组不予任何处理。各组大鼠于移植后4周进行各项指标检查和测定。

1.4.5 关节炎指数评定 观察实验大鼠的后足踝关节，0分为正常；1分为仅限于部分关节轻度发红或者肿胀；2分为关节出现中度肿胀；3分为关节以下全部肿胀；4分为整个脚爪全部肿胀或者关节严重变形。4个后足踝关节共16分，若评分为6-8分则表示为严重关节炎。

1.4.6 排水法测量双后肢的足肿胀度 试管内加入 5 mL水，将待测后肢(包括整个足掌)，以胫骨下端内踝处为解剖标志点，深入液面下，观察并记录水面上升数值。

1.4.7 流式细胞术检测各组脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的变化 ①制备大鼠脾细胞悬液：将大鼠脱颈处死，乙醇浸泡消毒，打开腹腔，分离并摘除脾脏，用剪刀取其1/3置于EP管中，充分研磨后溶于PBS中，用滤网过滤，吹打均匀，取另一装有淋巴细胞分离液的试管，将脾细胞溶液加于分离液面上，离心后收集界面上层细胞，PBS洗涤，离心，弃去上清液，加入完全培养液制成细胞悬液；②染色：向细胞悬液中加入10 μL FITC标记抗大鼠CD4单抗和10 μL PE标记抗大鼠CD25单抗进行染色，PBS洗涤，流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平。

1.4.8 ELISA法检测各组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1水平 各组大鼠麻醉成功后，从眼眶下采集大鼠全血2.5 mL，离心，留取上清液，采用ELISA法检测血清中白细胞介素17、肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1水平。

1.5 主要观察指标 ①关节炎评分；②排水法测量双后肢的足肿胀度；③流式细胞术检测各组脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平；④ELISA法检测各组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1水平。

1.6 统计学分析 所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，方差齐性时多组间均数采用方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用DunnettT3法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是慢性关节疾病，主要临床特征为关节肿胀疼痛，并且逐渐加重，出现关节活动障碍和畸形^[1]，骨关节炎的病因不十分清楚，大多数认为多种细胞因子共同参与关节炎的发生。骨关节炎的诊断主要靠临床症状和体征以及影像学检查，这些方法对早期关节炎的诊断比较困难，随着分子学的发展，寻找能够反映关节炎病情状况的细胞因子尤为重要，对早期关节炎的诊治具有重要意义。参与骨关节炎发生的细胞因子主要有：①白细胞介素：骨关节炎的发病和白细胞介素因子有密切关系，白细胞介素17是由T淋巴细胞分泌的细胞因子，可以导致各种炎性递质的生成，在骨关节炎的关节破坏以及炎症反应中发挥重要作用，白细胞介素17能够诱导一氧化氮合酶基因表达，可以促进一氧化氮的产生，导致骨关节的病理损害^[2]；②肿瘤坏死因子α：肿瘤坏死因子α是主要的细胞因子，介导多种炎症反应，破坏软骨细胞，加重骨关节的炎症损伤，导致骨和软骨的破坏^[3]，肿瘤坏死因子α的表达随着关节炎病情的加重而增加^[4]；③转化生长因子β：转化生长因子β能够促进骨基质合成，有降低炎症反应和促进炎症发展的双重作用，在关节炎的发生中发挥重要作用，可以促进软骨细胞基质金属蛋白酶以及胶原酶的生成^[5]；④其他：包括胰岛素样生长因子^[6-7]、基质金属蛋白酶和骨桥骨蛋白^[8-12]，在关节炎的发生发展中也发挥重要作用。在骨关节炎的发生发展中，免疫调节机制也发挥重要作用，在骨关节炎的活动期，出现调节性T细胞数量的异常^[13]，B细胞可以分泌多种抗体，在关节炎的发生中也发挥重要作用^[14]。骨髓间充质干细胞具有多向分化和自我更新潜能，能够分化为成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等多种细胞，是组织工程领域比较有前景的种子细胞。

骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的机制可能与骨髓间充质干细胞具有免疫调节作用，能够降低炎症反应，促进损伤修复等有关。骨关节炎病变的基础是软骨的改变，有可能发展为软骨下骨坏死^[15]，软骨的功能改变和骨关节炎的发生相关^[16]，骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎具有抗炎和免疫调节作用^[17]，骨髓间充质干细胞可以分泌多种细胞因子对骨关节炎进行局部修复和免疫调节^[18]，骨髓间充质干细胞可以减轻关节肿胀，修复骨质破坏^[19]，自体骨髓间充质干细胞治疗软骨缺损可以明显改善临床症状^[20-21]。由此可见，骨髓间充质干细胞移植治疗骨关节炎可能通过多种途径进行修复和治疗^[22-26]。

实验建立大鼠骨关节炎模型，进行骨髓间充质干细胞移植治疗，结果发现：移植组大鼠的关节炎指数明显低于模型组(P < 0.05)。移植组大鼠的后肢关节肿胀度明显低于模型组(P < 0.05)。移植组大鼠的脾脏调节性T细胞明显高于模型组和对照组(P < 0.05)。移植组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平明显低于模型组(P < 0.05)，移植组大鼠血清转化生长因子β1水平明显高于模型组(P < 0.05)。由此可见，骨髓间充质干细胞具有免疫调节和损伤修复功能。