脑出血免疫抑制大鼠模型的构建及评估

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.002

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (40): 5939-5945.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.002

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脑出血免疫抑制大鼠模型的构建及评估

张建军，史焕昌

天津市第四中心医院神经外科，天津市 300070

修回日期:2016-07-08 出版日期:2016-09-30 发布日期:2016-09-30
通讯作者: 史焕昌，主任医师，天津市第四中心医院神经外科，天津市 300143
作者简介:张建军，男，1980年生，河北省沽源县人，汉族，2010年天津医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事神经损伤修复、神经外科相关研究。
基金资助:
天津市第四中心医院2014年硕博基金

Immunosuppressed rat model of cerebral hemorrhage: construction and assessment

Zhang Jian-jun, Shi Huan-chang

Department of Neurosurgery, Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300070, China

Revised:2016-07-08 Online:2016-09-30 Published:2016-09-30
Contact: Shi Huan-chang, Chief physician, Department of Neurosurgery, Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300070, China
About author:Zhang Jian-jun, Master, Attending physician, Department of Neurosurgery, Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300070, China
Supported by:
a grant from Tianjin Fourth Central Hospital for Masters and Doctors in 2014

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

脑出血后免疫抑制：在临床治疗过程中观察到，脑出血患者也存在着免疫抑制现象。当前的动物实验和部分临床研究局限于缺血性脑血管病，而对病死率和死亡率明显高于前者的脑出血相关研究罕见。由于脑出血发病机制、组织损伤程度、占位效应、手术麻醉干扰等方面不同于缺血性脑血管病，此类患者多见昏迷，免疫功能变化更复杂，所以对脑出血后免疫抑制现象研究更有必要。

急性脑出血免疫大鼠模型：建立急性脑出血大鼠模型，探其发病机制，寻找有效的治疗药物逐渐引起重视。大鼠在脑出血后先呈现免疫功能亢奋，随即96 h后出现免疫功能抑制。

摘要

背景：研究表明，大鼠脑出血后经治疗可以有效抑制其免疫功能。已有文献研究对缺血性脑卒中后免疫抑制现象进行详细研究，但脑出血后机体免疫功能研究鲜见报道。

目的：构建脑出血后免疫抑制大鼠模型并进行稳定性评估。

方法：将60只Wistar大鼠随机分为3组，即对照组、假手术组、脑出血组，每组20只。采用自身动脉血50 μL注入大鼠基底节方法建造急性脑出血模型；假手术模型注入50 μL 生理盐水，手术过程同脑出血模型；对照组不做任何处理。分别于造模后24，48，72，96 h用血液分析仪检测白细胞、淋巴细胞、淋巴细胞百分数；采用ELISA测定大鼠血清中促炎细胞因子白细胞介素6和抗炎细胞因子转化生长因子β的水平；剖取大鼠脾组织进行组织学及病理学检查；通过RT-PCR及Western blotting检测转化生长因子β、白细胞介素6基因和蛋白在脾组织中的表达变化。

结果与结论：①与假手术组及对照组相比，脑出血组大鼠于造模后24，48，72，96 h白细胞数明显升高，淋巴细胞百分数逐渐降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与假手术组及对照组相比，脑出血组大鼠血液、脾的白细胞介素6在24 h 时高表达，72 h 达高峰，96 h时表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③与假手术组及对照组相比，脑出血组大鼠血液、脾的转化生长因子β 于24 h时低表达，72 h 逐渐升高，96 h时高表达，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果提示，大鼠在脑出血后先呈现免疫功能亢奋，随即96 h后出现免疫功能抑制，说明脑出血后免疫抑制大鼠模型造模成功，并具有良好的稳定性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0003-2528-3644(张建军)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 脑出血, 大鼠, 急性期, 免疫功能, 抑制

Abstract:

BACKGROUND: Treatment after intracerebral hemorrhage can effectively suppress immune function. The immune suppression after ischemic stroke has been studied in detail.

OBJECTIVE: To construct an immunosuppressed rat model after cerebral hemorrhage, and assess its stability.

METHODS: Sixty Wistar rats were randomly divided into control group, sham group, and cerebral hemorrhage group, with 20 rats in each group. Rat models of acute cerebral hemorrhage were established by 50 μL arterial blood injection in the rat basal ganglia. Rats in the sham group were injected with 50 μL of saline, and the operation was identical to cerebral hemorrhage model. Rats in the control group received no treatment. At 24, 48, 72 and 96 hours after model establishment, leukocytes, lymphocytes, and lymphocyte percentage were analyzed by blood analyzer. Enzyme linked immunosorbent assay was used to determine the levels of serum proinflammatory cytokine interleukin-6 and anti-inflammatory cytokine transforming growth factor β in rats. Dissected rat spleen tissue was subjected to histological and histopathological detection. RT-PCR and western blotting were utilized to measure changes in transforming growth factor β, interleukin-6 gene and protein expression in the spleen.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham group and control group, leukocyte number was significantly higher, but lymphocyte percentage gradually reduced in the cerebral hemorrhage group at 24, 48, 72 and 96 hours (P < 0.05). (2) Compared with the sham group and control group, interleukin-6 levels in the blood and spleen were higher at 24 hours, peaked at 72 hours, and decreased at 96 hours in the cerebral hemorrhage group (P < 0.05). (3) Compared with the sham group and control group, transforming growth factor β expression was lower at 24 hours, gradually increased at 72 hours, and higher at 96 hours in the rat blood and spleen of the cerebral hemorrhage group (P < 0.05). (4) These findings indicate that immune function excitement first appeared after cerebral hemorrhage, and immune suppression appeared at 96 hours, indicating successful model establishment and good stability.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Models, Animal, Cerebral Hemorrhage, Leukocytes, Lymphocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张建军，史焕昌. 脑出血免疫抑制大鼠模型的构建及评估[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 5939-5945.

Zhang Jian-jun, Shi Huan-chang. Immunosuppressed rat model of cerebral hemorrhage: construction and assessment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(40): 5939-5945.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入60只Wistar大鼠，随机分为3组，即对照组、假手术组、脑出血组，每组20只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 模型创新性 实验重点为脑出血后周围免疫抑制的研究，故采用了目前国内外认证的经典方法，具有稳定性好，可重复性强，行为学和形态学和剂量的相关性都很一致，该模型更接近人类疾病模式，具有转化医学意义。

2.3 白细胞、淋巴细胞、淋巴细胞百分数表达 与假手术组及对照组相比，脑出血组大鼠于造模后24 h血液中白细胞数明显升高，48，72，96 h血液中白细胞数较前降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；血液中淋巴细胞及淋巴细胞百分数24，48，72，96 h均逐渐降低，差异有显著性意义(P < 0.005)，见表1。

2.4 组织学及病理学检查结果 与假手术组及对照组相比，脑出血组大鼠于造模后72 h淋巴结及脾脏组织可见炎性细胞浸润，但未见明显淋巴类细胞存在，说明淋巴结及脾脏组织脑出血后处于免疫抑制状态，见图1。

2.5 转化生长因子β、白细胞介素6的表达 采用双抗体夹心ELISA法测定大鼠血清促炎细胞因子白细胞介素6和抗炎细胞因子转化生长因子β的表达结果表明，与对照组及假手术组比较，脑出血组大鼠血液中的白细胞介素6于24 h时高表达，96 h时表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；血液中的转化生长因子β 24 h时低表达，96 h时高表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2及图2。

2.6 脾组织转化生长因子β、白细胞介素6 mRNA的表达 与假手术组及对照组相比，脑出血大鼠于造模后 24 h脾组织的白细胞介素6 mRNA高表达，96 h时表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；脾组织的转化生长因子β mRNA 24 h 时低表达，96 h时高表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，结果见图3及表3。

2.7 脾组织转化生长因子β、白细胞介素6蛋白的表达 与假手术组及对照组相比，脑出血大鼠于造模后24 h脾的白细胞介素6高表达，96 h时表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；脾的转化生长因子β 24 h时低表达，96 h时高表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，结果见图4及表4。

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引言

材料方法

1.1 实验材料 于2014年9月至2015年9月在天津医科大学实验动物中心完成。

1.1.1 实验动物及分组清洁级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量250-300 g，购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SCXK20070026，实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

按随机数字表法分为3组，对照组、假手术组、脑出血组各20只。对照组不做任何处理；脑出血组采用2次注射自体动脉血法构建大鼠脑出血模型；假手术组注入50 μL生理盐水，手术过程同脑出血模型。

1.1.2 试剂及仪器转化生长因子β、白细胞介素6单克隆抗体，SANTA公司；β-actin兔抗鼠多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体，美国Santa Cruz公司；超净工作台，苏州安泰空气技术公司；倒置显微镜，日本Nikon公司；凝胶成像系统，日本Kodak；Ⅰ型C大鼠脑立体定位仪，上海江湾；307- 6型牙科台钻，上海齿科医疗器械厂；水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司；BIO-RAD Model 680酶标仪，日本；KHB ST-36W全自动酶标洗板机，上海科华实验系统有限公司；转化生长因子β、白细胞介素6 ELISA，试剂盒，R&D，USA。

1.2 造模方法

1.2.1 制备脑出血大鼠模型参照文献[5]，大鼠适应性喂养1周后，以0.4%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，右侧腹股沟备皮，纵行切口，暴露并分离股动脉，用肝素化50 μL微量进样器穿刺股动脉抽取50 μL动脉血后缝合切口。将大鼠定于立体定向仪，切开额顶部中线皮肤，暴露颅骨，参照脑立体定向图谱，注射部位定位于前囟前0.2 cm，中线右侧旁3 cm，颅骨外表面下6 cm(尾壳核部位)，先用牙科钻钻直径约0.1 mm的骨窗，再以含50 μL股动脉血微量进样器垂直刺入到达注射部位，缓慢注射25 μL动脉血(10 μL/min)，静置5 min，再以同样的速度注射另一半，原位留置进样器30 min后缓慢起针，注射后医用骨蜡封闭骨窗，缝皮消毒。假手术模型注入50 μL生理盐水，手术过程同脑出血模型。

1.2.2 造模成功评估标准实验造模大鼠于术后2 h逐渐苏醒，至术后4 h，实验大鼠意识逐渐恢复，但自主活动减少，对刺激可做出反应，但均表现迟缓且易激惹，肢体活动缓慢及不同程度的偏瘫、站立不能、旋转爬行等神经功能缺损表现。依据Berderson评分标准在术后5 h左右对大鼠的行为表现进行评分，评分为2-4分表明造模成功，不达标准者弃之并且重新制作模型补充入组。

Berderson评分标准：①0分：提起尾部后，前爪伸直，无神经功能缺损；②1分：前肢出现任何屈曲表现(即提尾悬空试验阳性)，不伴其他不正常者；③2 分：上述体征+侧推抵抗力下降(即侧向推力实验阳性)，无自发性旋转行为；④3分：同2级行为，伴自发性旋转(自由活动时向瘫痪侧追尾)。评分越高，脑出血后的神经损伤越严重。

1.3 指标测定

1.3.1 血液分析仪检测各组大鼠随机取5只，分别于造模后24，48，72，96 h，用10%水合氯醛(30-50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，心脏穿刺取血1.5 mL，置于EDTA2K塑料采血管内，充分混匀，采用ADTGF- BIA2120 血液分析仪检测白细胞、淋巴细胞、淋巴细胞百分数。

1.3.2 血液转化生长因子β、白细胞介素6的测定各组大鼠随机取5只分别于造模后24，48，72，96 h同上法取血3 mL，收集的血液静置半小时，常温离心(3 700 r/min，10 min)，取血清，分装(100 μL/EP管)后置于-80 ℃深低温冰箱，备用。通过ELISA法检测血清细胞因子转化生长因子β、白细胞介素6的表达水平。严格按照ELISA试剂盒说明测定外周血转化生长因子β、白细胞介素6的水平(以转化生长因子β为例)。实验采用抗大鼠转化生长因子β单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的转化生长因子β与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠转化生长因子β，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Strepta-TGF-βidin与生物素结合，加入酶底物TMB，出现蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄，在450 nm处测吸光度值(A)，转化生长因子β质量浓度与A值成正比，根据标准曲线(0，50，100，200，500，800 μg/L转化生长因子β对应A值)得出实验组与对照组转化生长因子β的浓度。

1.3.3 周围淋巴器官形态观察及苏木精-伊红染色各组大鼠随机取5只分别于造模后24，48，72，96 h同上法麻醉后，称取大鼠体质量，剖取脾；剔出附着的脂肪，精密称取质量，计算脏器系数，脏器系数=脏器质量(g)/ 体质量(g)×100。脾置于体积分数4%甲醛固定液中，

固定24-48 h后，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色、透明和封固，于光学显微镜下观察各组织的病理变化。

1.3.4 RT-PCR检测转化生长因子β、白细胞介素6 mRNA 移植后2周，各组大鼠脑组织液氮冰冻，充分碾磨后，进行RT-PCR分析。采Trizol(Takara公司)试剂说明书介绍的方法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量，利用RT-PCR两步法试剂盒(TaKaRa公司)说明将mRNA反转录成cDNA，然后再将cDNA进行PCR扩增。按AMV反转录试剂盒(杭州博日)的操作说明将mRNA反转录为cDNA。用以下引物对转化生长因子β 及白细胞介素6的cDNA进行扩增：转化生长因子β (137 bp)引物序列：上游5’-CCA GCT CCA TTC ATA TCC AC-3’，下游5’-CTA ATG ACA ACA GGC TCC AG-3′；白细胞介素6引物序列：上游5’-CCA GCT GTG ATT CCA AAA CGG AC-3’，下游5’-TCT AGT CAT ACT GAA GAC AAT ACC TC-3’；β-actin(175 bp)引物序列：上游5’-CCA TCA TGA AGT GTG ACG TTG-3′，下游5’- ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA-4(305 bp)。取PCR扩增产物进行电泳，电泳结果用凝胶图像分析系统进行电泳条带吸光度分析，计算转化生长因子β、白细胞介素6产物与β-actin产物A值积分的比值，作为转化生长因子β、白细胞介素6 mRNA表达的指标。

1.3.5 Westem blotting检测转化生长因子β、白细胞介素6 移植后2周，将RT-PCR提取后剩余物以1 500 r/min离心30 min，取上清为粗体蛋白质，Bradford法测定蛋白浓度。60 μg总蛋白质在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PTGF-ΒDF 膜上，5%脱脂奶粉，37 ℃封闭2 h后加入1∶1 000稀释的转化生长因子β、白细胞介素6多克隆一抗与膜孵育1 h，TBST洗膜4次，每次15 min；加入1∶5 000 HRP标记的二抗和GAPDH，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤，ECL试剂盒进行化学发光检测。X射线片压片、显影、定影。UTGF-ΒI凝胶成像系统摄像Image-Pro Plus 7.0软件分析条带灰度值，用转化生长因子β、白细胞介素6/GAPDH比值代表转化生长因子β、白细胞介素6蛋白的相对表达量。

1.4 主要观察指标 观察血液分析仪检测结果；测定血液转化生长因子β、白细胞介素6的表达；对脾组织进行组织学及病理学检查；通过RT-PCR及Western blotting 检测转化生长因子β、白细胞介素6 mRNA和蛋白在脾组织中的表达变化。

1.5 统计学分析 所有实验数据均以x(_)±s表示，选用SPSS 15.0统计软件包处理，组间两两比较采用q 检验，检验水准取0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

临床观察发现在脑出血发病后数天内，患者开感染率增高，尤其是肺炎和尿路感染。脑出血后患者误吸或吞咽功能障碍以及留置胃管、气管插管、留置尿管等有可能造成肺部感染、泌尿道感染，但是仍不足以解释脑出血患者相关感染超高的发病率。近年来研究表明脑梗死后感染与免疫功能紊乱相关。早在1974年Howard等^[6-10]就提出创伤后免疫抑制概念。目前关于脑卒中后免疫抑制的研究多集中于脑梗死，在临床治疗过程中观察到，脑出血患者也存在着免疫抑制现象。当前的动物实验和部分临床研究局限于缺血性脑血管病，而对病死率和死亡率明显高于前者的脑出血相关研究罕见。由于脑出血发病机制、组织损伤程度、占位效应、手术麻醉干扰等方面不同于缺血性脑血管病，此类患者昏迷多见，平均入住ICU时间较长，免疫功能变化更复杂，所以对脑出血后免疫抑制现象研究更有必要。此次实验目的是观测大鼠脑出血后外周免疫组织的功能变化，文中采用的大鼠脑出血模型，为目前国内外认证的经典方法，稳定性好，可重复性强，行为学和形态学和剂量的相关性都很一致，该模型更接近人类疾病模式，具有转化医学意义^[11-17]，在该模型的基础上，探讨脑出血后的外周免疫状态，与临床的吻合度高，取得的结果对临床有指导性意义。在炎症过程中，促炎细胞因子和抗炎细胞因子同时存在，二者的消长决定着机体免疫反应的演变、发展及转归。在大鼠脑出血早期过度增加的炎症因子可能导致半暗带区炎症级联反应，进一步加重脑水肿和神经元的损伤。作者的研究主要关注脑出血大鼠外周血促炎细胞因子和抗炎细胞因子水平的动态变化，以评估脑出血后的外周免疫状态^[18-23]。结果显示，脑出血大鼠血清及脾促炎细胞因子白细胞介素6 24 h时升高，96 h降低。该病理机制推测可能和脑组织缺血坏死后产生了大量的抗原刺激免疫系统有关。毛新发等^[7^，^24-26]的研究表明，白细胞介素6参与了脑缺血损伤机制，且主要起破坏作用。文章结果显示，大鼠脑出血期患者血清白细胞介素6水平明显增加，提示大鼠脑出血期患者体内的淋巴细胞等处于激活状态。与此相反，抗炎细胞因子转化生长因子β水平在脑出血后先降低再升高。提示脑出血后24 h即出现细胞免疫功能的抑制，至96 h最为明显，随后的较长时间内机体一直处于免疫抑制状态。这可能是脑出血患者易于发生感染并发症的病理生理基础。白细胞介素6是脑梗死后炎症反应中重要的炎症细胞因子，其在血清中表达水平的增高反映了炎症的加重或病情预后较差^[7]。
文章对脑出血大鼠外周血液系统及周围淋巴组织的研究表明，脑出血后24 h时白细胞介素6高表达，随着时间延长表达逐渐降低；脑出血后24 h时转化生长因子β低表达，随着时间延长表达逐渐升高，二者的交汇点在72 h左右，提示脑出血后3 d之后外周血液及淋巴组织存在免疫抑制现象。

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