Mkx(Mohawk)在肌腱组织工程中的应用与作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.016

摘要/Abstract

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文题释义：
Mkx(Mohawk)：又被称为Irxl,是三氨基环酸超家族的成员之一。Mkx是肌腱发育过程中肌腱细胞所表达的非典型的同源异型盒基因，在许多组织器官发育过程中都是必要的，包括细胞的增殖、分化等过程。Mkx具有转录抑制活性，且包括了3个小阻遏域。Mkx作为一个转录抑制因子，是通过招募Sin3A / DHAC抑制复合物而发挥作用的。
掌板：也叫掌侧韧带，为一长方形的致密纤维软骨板，位于掌指关节及指间关节掌侧。其中掌指关节掌板其远端厚而坚韧，附于近节指骨底掌唇，近端薄而松弛，呈膜状附于掌骨颈掌侧，并与深筋膜交织，两侧与侧副韧带相连。远侧指间关节的掌板为远侧指间关节掌侧一长方形质地坚韧的致密纤维软骨扳，远端厚而坚韧。坚固地附于远节指骨底掌倒唇，构成关节囊的掌面，同时也构成屈肌腱的底面，近端薄而松弛为膜样结构，并与骨膜相延续。

摘要
背景：近年来研究证实转录因子Mkx(Mohawk)是肌腱形成、发育、分化的关键因子之一。
目的：总结Mkx的分子结构、分布、功能以及在肌腱分化过程中的信号通路等方面的研究进展。
方法：用计算机检索维普数据库(1990至2016年)、中国期刊全文数据库(1990至2016年)及Medline数据库(1990至2016年)，检索词分别为“Mkx；Mohawk；Irxl；肌腱；成肌腱分化；组织工程；转化生长因子β；干细胞；和“Mkx；Mohawk；Irxl；tendon；tendon differentiation；tissue engineering；TGFβ；stem cell”。检索有关转录因子Mkx(Mohawk)在肌腱组织工程中的研究进展，最终保留55篇文献。
结果与结论：转录因子Mkx在肌腱形成发育及组织工程肌腱的形成过程中发挥重要作用。Mkx在多种中胚层来源组织细胞中表达，Mkx发挥作用的途径虽不直接作用于Scx(Scleraxis)，但可间接调控转化生长因子β2信号通路来调控肌腱祖细胞的分化，而干细胞的物种来源和不同细胞系以及不同细胞因子均对Mkx在肌腱组织工程中发挥作用有不同的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-6210-0926(李丹)

关键词: 组织构建, 组织工程, 肌腱, Mohawk, Irxl, 成肌腱分化, 转化生长因子β, 干细胞, 间充质干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mkx (Mohawk, transcription factor) is one of the crucial factors in tendon formation, development and differentiation.
OBJECTIVE: To summarize the molecular structure, distribution and function of Mkx and its research process in the signaling pathways during tendon differentiation.
METHODS: The first author retrieved the databases of CqVip, CNKI and Medline from1990 to 2016 using the keywords of “Mkx, Mohawk, Irxl, tendon, tendon differentiation, tissue engineering, TGFβ, stem cell” in Chinese and English, respectively. The articles related to research process of Mkx in tendon tissue engineering were retrieved, and a total of 55 literatures were enrolled finally.
RESULTS AND CONCLUSION: Mkx that expresses in various mesoderm-derived tissues plays an important role in the formation and development of tendon and tissue-engineered tendon formation. Although Mkx does not directly act on Scx (Scleraxis), it can regulate the differentiation of tendon progenitor cells via transforming growth factor-β2 signaling pathway. Cells from different species and different cell lines as well as various cytokines for certain make different effects on Mkx involved in tendon tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tendons, Stem Cells, Transcription Factors

中图分类号:

R318

李丹，郭杏，谭美云. Mkx(Mohawk)在肌腱组织工程中的应用与作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(37): 5580-5587.

Li Dan, Guo Xing, Tan Mei-yun. Role of Mkx (Mohawk) in tendon tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(37): 5580-5587.

图/表（结果） 1

2.1 Mkx的结构、分布和功能

2.1.1 Mkx的结构 kx(Mohawk)又称为Irxl(Iroquois home0box-like，Irxl)^[18]，是三氨基环酸(three- amino-acid loop，TALE)超家族的成员之一。Mkx是肌腱发育过程中肌腱细胞所表达的非典型的同源异型盒基因，在许多组织器官发育过程中都是必要的，包括细胞的增殖、分化等过程^[19-23]。Mkx具有转录抑制活性^[24-25]，且包括了3个小阻遏域。Mkx作为一个转录抑制因子，是通过招募Sin3A /DHAC抑制复合物而发挥作用的^[24]。Mkx基因可编码353个氨基酸，它在多种中胚层来源的组织细胞中表达。Irxl1与Iroquois家族基因最相似，但在所有的Irx基因中缺乏典型的IRO盒^[26-27]。在许多脊椎动物和无脊椎动物物种中均发现了Mkx，Mkx与脊椎动物同源基因含有同源结构域的同源性为100%^[28]。

2.1.2 Mkx的分布与功能 Mkx在肌肉骨骼系统、肌肉、软骨、骨及肌腱中均有表达^[26-27]。Mkx基因突变小鼠并没有出现明显的软骨、骨或骨骼肌的缺失，反而肌腱发生了严重发育不全^[18^，^29-30]。Mkx-缺失的肌腱I型胶原生成减少，而细胞数目未发生改变。所以，Mkx基因的正常表达是轴向和四肢肌腱的形态和功能保持完整的必需条件。

研究发现，体节的生骨节的肌腱祖细胞于E9.5 d出现Scleraxis(Scx)，而在E12.5 d开始出现Mkx，Mkx的表达量较少，而肌腱祖细胞从聚集到分化(E13.5 d- E14.5 d)发现Mkx的表达量明显变多。然而，在出生以后Mkx的表达量明显比胚胎期减少。令人意外的是，Mkx在其四肢及尾部的肌腱鞘中表达量却相对较高^[18^，^30]。最近研究也得出相似结果，分别从胚胎期的整个胚胎、前肢及后肢中提取Mkx，从E10.5 d至E13.5 d发现其在前肢和后肢的肌腱祖细胞中Mkx的表达呈现稳定增长的趋势，而在大鼠出生后4-14 d期间跟腱中的Mkx呈高度表达^[17]。由此可以看出，Mkx在肌腱祖细胞的分化过程发挥重要作用，且Mkx参与肢体和肌腱发育的特定阶段。为研究Mkx在体内的功能，Ito等^[29]运用了Mkx-/-小鼠进行试验，研究发现小鼠体内形成了发育不全的肌腱，且在这些肌腱中Ⅰ型胶原的表达下调、胶原纤维直径变小。在Mkx基因过表达实验组中发现其肌腱胶原沉积更多、分化更成熟、平均直径更大、直径范围更广，且其力学性能更好^[17]。因此，可看出Mkx基因在肌腱的发育过程中是不可或缺的部分，且是肌腱维持其弹性的重要成分。

Onizuka等^[31]通过对基因靶向作用的小鼠的研究发现Mkx不仅可调节肌腱分化，而且对腱周组织掌板的发育和平衡也起着重要作用。掌板有胶原纤维束的具体定位，研究者认为其能够抵抗过伸和扭转应变产生的紧张^[32]。Onizuka等^[31]研究结果发现，在Mkx-裸鼠的掌板中发现杂乱无章排列的纤维，且掌板过伸和侧扭应变时容易受伤，从而引起指骨背侧脱位或大关节不稳。掌板示意图见图2。

2.2 Mkx与肌腱组织工程

2.2.1 Mkx调控肌腱分化成熟过程的途径转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)信号是结缔组织增殖分化的主要调解因子之一。近来研究证实，Mkx在肌腱分化中发挥作用主要是通过调控转化生长因子β信号通路来实现。Liu等^[17]以表达HA‐标记MKX cDNA的慢病毒载体或空载体转染小鼠间充质干细胞，进行染色质免疫沉淀(CHIP)测序分析，没有在Scx的启动子上发现直接的结合位点，却发现Mkx蛋白结合了转化生长因子b2基因的特定区域(654 bp)，表明Mkx对Scx不存在直接调控的作用，而Mkx直接激活的是转化生长因子b2的表达。这个结果有些出人意料，因为Mkx已经被描述为一个有效的DNA结合转录抑制因子^[24^，^33]。然而，可以推测Mkx还可以结合不同位点，这可能将改变其转录活性。

Smad3是一个转录激活因子。Smad3基因缺失的小鼠在肌腱损伤后表现出机械强度降低和不规则的胶原沉积，说明Smad3信号在肌腱力学性能的维护和肌腱愈合过程中发挥作用^[34]。Berthet等^[35]在评估Smad3与SCX和MKX相互作用的能力，发现Smad3能够与Scx相结合，且能够以相似的方式与Mkx结合。从而验证了这种说法的可靠性。

转录因子Egr1在小鼠肌腱中也结合转化生长因子b2特定区域^[36]。但是，Mkx和Egr1结合是的小鼠转化生长因子b2基因的不同调节区域^[17^，^36]。而且，转化生长因子β2无法激活Tenomodulin(Tnmd)的表达，但Egr1和Mkx能，所以转化生长因子β2仅能部分调节Egr1和Mkx在MSCs中肌腱相关基因的表达^[17^，^36]。说明在基因调控肌腱再生中Mkx和Egr1均在上游转化生长因子b2水平发挥作用，而抑制转化生长因子β通路并没有完全抑制Mkx和Scx在肌腱再生中的效应。因此，推测Mkx调控肌腱形成主要通过转化生长因子β信号通路。

Kayama等^[37]通过体内、体外实验证实了Mkx是肌腱形成的必须转录因子。Mkx可调控下游ECM基因(如Ⅰ型胶原酶)、蛋白聚糖(如纤维调节素)，在相同的机械刺激下，WT小鼠的胶原纤维直径和密度增加，而Mkx^-^/^-小鼠的肌腱胶原则未出现相应的改变。在Mkx启动区的功能筛选实验中确定了几个调节Mkx的上游转录因子，特别是在肌腱细胞中表达的Gtf2ird1，易位至细胞核，在机械拉伸作用下通过染色质调控启动子激活Mkx。证实了Gtf2ird1为Mkx转录所需，同时也和机械力与Mkx介导的肌腱平衡、再生有关。

2.2.2 Mkx与组织工程肌腱再生

Mkx在组织工程肌腱再生过程中的作用：Mkx也许不仅在肌腱形成发育过程中发挥重要作用^[18^，^29]，而且能够调控骨髓间充质干细胞的成肌腱分化过程。Otabe等^[13]以腺病毒为载体Mkx转染骨髓间充质干细胞形成Mkx基因过表达，结果发现外源性Mkx在MSCs成肌腱分化过程中能够促进肌腱形成相关基因，如Tnc、Tnxb、Tnmd 和相关蛋白(Coll1a1)的表达。骨髓间充质干细胞在成肌腱分化时Mkx基因表达都增加，以腺病毒为载体的Mkx基因过表达提高了肌腱细胞外基质基因表达和蛋白质生成。因此，Mkx可能是骨髓间充质干细胞成肌腱分化的一个关键因素。

通过免疫组织化学染色和基因表达数据库的数据分析评估，Mkx表达在人类肌腱病的组织样本中比明显低于正常肌腱组织。在TDSCs中Mkx和Scx的表达高于脂肪干细胞和胚胎干细胞源性间充质干细胞。Guo等^[38]实验发现，Mkx、Scx、Egr1和Ega1在肌腱干细胞自发成肌腱分化中表达上调，但仍明显比肌腱组织中的表达水平低。Liu等^[17]比较了人肌腱干/祖细胞、脂肪干细胞、人胚胎干细胞源性间充质干细胞之中Mkx、Scx的表达情况，结果发现Mkx和Scx在人肌腱干/祖细胞中的表达明显高于其他类型干细胞。为了进一步确定缺乏Mkx是否会影响人肌腱干/祖细胞的生物学特性，Dunkman等^[39]通过沉默Mkx基因的表达，后发现Mkx水平降低导致了某些肌腱形成的关键基因下调，特别是Scx、Dcn及Tnmd，其中Dcn在肌腱形成过程中扮演着重要的角色，Dcn基因缺陷小鼠在髌腱损伤后其机械强度明显降低。然而，在跟腱损伤之后Dcn的表达水平有所提高^[40]。由此可看出，Mkx可能是维持人肌腱干/祖细胞特性至关重要的因子。

干细胞的物种来源和不同细胞系对Mkx在肌腱组织工程中作用的影响：不同物种来源的细胞和不同细胞系均可能导致细胞因子的作用发生改变。Liu等^[17^]研究发现在小鼠C₃H₁OT1/2细胞和尾部人肌腱干/祖细胞中Mkx能够诱导Scx表达。在小鼠间充质干细胞中Mkx诱导Scx表达结果与Otabe等^[13]的研究结果并不相同，Mkx在人骨髓间充质干细胞中并不激活Scx的表达。由此看来，Mkx诱导Scx或其他因子表达能力可能与干细胞的种属来源和细胞类型有关。同样，Mkx诱导Scx的能力在肌腱发育过程中也有所不同，在Mkx突变小鼠中Scx表达正常^[18^，^30]。在人骨髓间充质干细胞中Egr1的表达水平并没有通过Mkx而提高^[13]，而小鼠C₃H₁₀1/2细胞中Mkx转录同样没有增加Egr1的表达^[17]，这表明转录因子Egr1和Mkx在促肌腱效应中有着独立的通路。小鼠Scx-C3H10T1/2细胞与Mkx- C₃H₁₀T1/2细胞相比在模拟肌腱样结构的细胞片系统中的胶原纤维直径更小，且Tnmd活力缺失，从而发现Mkx的成肌腱分化效应比Scx更有效^[17]。然而，已经有研究证明了在人骨髓间充质干细胞中Scx能够促进Tnmd的表达^[13]。同样，这种差异的存在可能是由于不同物种使用了不同细胞系所引起的。总的来说，这些结果表明除了正常肌腱形成所需，Mkx在MSCs中促进肌腱再生来源于不同物种。

2.2.3 细胞因子对Mkx表达的调控骨形态发生蛋白属于转化生长因子β超家族成员^[41]，主要参与细胞的增殖分化，还对新生血管形成、细胞聚集和迁移具有重要作用。骨形态发生蛋白缺陷会引起肌腱延迟愈合。在正常肌腱腱鞘内膜和血管周围组织都能够检测到骨形态发生蛋白12，骨形态发生蛋白12在体内和体外均能促进肌腱形成和分化^[42-44]。体外研究表明，在生长培养基中添加骨形态发生蛋白12促进肌腱细胞分化，发现从马脐血分离的间充质干细胞和骨髓间充质干细胞中Mkx及肌腱相关基因Scx、Collal和Dcn的表达均升高^[13^，^45]。Mohanty等^[45]在常规培养基中加入不同浓度骨形态发生蛋白12，诱导UCB-MSCs成肌腱分化，诱导10 d后通过RT-PCR检测肌腱特异性基因，结果显示，与未添加骨形态发生蛋白12诱导的UCB-MSCs相比Mkx、Col1a1、Scx基因表达均上升，证明了UCB-MSCs能够作为马肌腱损伤细胞治疗的种子细胞。骨形态发生蛋白2能在组织修复程序中使胶原纤维直径和Ⅰ型胶原纤维前体的表达明显增加，增加肌腱的生物力学性能，促进损伤肌腱修复。临床前研究已经报道，以慢病毒为载体将骨形态发生蛋白2导入骨髓间充质干细胞中促进前交叉韧带的重建，而利于腱-骨愈合^[46]。Schwarting等^[47]在骨形态发生蛋白2对腱-骨愈合影响的实验研究发现，骨形态发生蛋白2促进Mkx的表达。说明骨形态发生蛋白12和骨形态发生蛋白2对Mkx的表达水平有正向调节作用。

转化生长因子β是成肌腱分化的有效诱导因子之一^[48]。转化生长因子β2能够引起Scx和Col1a1的mRNA表达水平明显上调^[36]。同样，转化生长因子β3能够刺激Scx，Col1a1，Tnmd和Dcn基因表达^[49]。Guo等^[38]为进一步证实TDSCs自然地分化为肌腱细胞，通过是否在培养基中添加转化生长因子β1比较了TDSCs在不同条件下的成肌腱分化能力，对照组为常规培养基，实验组则在培养基中添加10 μg/L 转化生长因子β1，诱导10 d后进行PCR分析，发现两组的肌腱标志物Col1a1、Tnmd、Dcn、Fmod，及肌腱转录因子Scx、Mkx、Egr1和Ega1的基因表达均升高，但除了Tnmd，转化生长因子β1组的成肌腱标志物和肌腱转录因子的表达均显著高于自然分化组。同样，在小鼠屈肌腱细胞中发现，转化生长因子β1以剂量依赖的方式上调Scx，Mkx，Bgn，Col5a1，Col12a^[50]。由此可以推测，转化生长因子β1对Mkx的表达具有一定的正向调节作用。

2.2.4 甲基化转移酶G9a对Mkx表达的调控 G9a，又被称为染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2 (euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2， EHMT2)。G9a是体内广泛存在的甲基化转移酶，属于Suv39h亚群成员，能够催化组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)进行一甲基化和二甲基化^[51]。在体内多种组织中均可检测到G9a。研究发现，G9a的表达水平在脑、肌肉和心脏等组织中较其在脂肪和肺组织远低。而且，在同一组织的不同类型细胞的表达水平也相差甚远。G9a在体内的调控基因机制主要通过2方面发挥作用：①促进基因启动子区域的组蛋白或DNA进行甲基化来抑制基因转录；②以脚手架蛋白的作用结合转录激活因子来激活基因转录。因G9a在体内对基因的广泛调控作用，因此其在机体的生长发育过程中起着不可忽视的作用。G9a对肌腱细胞在体外的分化和生长同样具有非常重要的作用，并对Mkx的表达具有调控作用。研究发现，敲除G9a的小鼠出现了严重的生长发育缺陷，且最终了出现小鼠胚胎死亡现象^[52-53]。G9a基因敲除主要通过降低H3K9的甲基化修饰而使得正常的减数分裂无法进行^[54]。Wada等^[55]发现G9a基因敲除裸鼠肌腱细胞的增殖能力显著降低，且Western-blot检测发现肌腱转录因子Mkx、Egr1、Scx、Tnmd、Six1、Six2表达的水平均下降。因此，G9a可能在Mkx基因的表达中起着重要的作用，但其具体机制仍然不详，需要进一步的研究来检验这一假设。

2.2.5 基因转染技术联合Mkx在肌腱组织工程中的应用基因转染技术是通过病毒载体或非病毒载体持续表达外源性基因而维持局部生长因子浓度以达到修复组织损伤的目的。在小鼠跟腱缺损体内模型中，Liu等^[17]运用基因转染技术将Mkx基因导入间充质干细胞片中，形成Mkx基因过表达的间充质干细胞，将其植入实验组左跟腱缺损处，而对照组细胞片植入右跟腱缺损处，用DiI标记植入的细胞。细胞追踪显示移植术后4周可在跟腱里检测到组织工程肌腱，组织学检查可发现在Mkx实验组修复位点处再生肌腱有成熟肌腱典型的结构形成，Mkx实验组与对照组相比胶原沉积更多，更成熟，平均直径更高，直径范围更广^[17]。Otabe等^[13]为了探讨Mkx在骨髓间充质干细胞成肌腱分化中的作用，对骨髓间充质干细胞分别进行了不同的处理，运用腺病毒为载体分别将Mkx和Scx基因导入骨髓间充质干细胞，将处理后的骨髓间充质干细胞种植于胶原支架中后移植到大鼠跟腱缺损模型中，分别在第3周获取肌腱组织，进行基因表达和蛋白产生量检测分析。结果也证实了Mkx在骨髓间充质干细胞成肌腱分化过程中是一个较强的诱导者。

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引言

肌腱是连接骨骼和肌肉的重要组织，对肌肉骨骼系统的力学传递起着不可替代的作用。由于肌腱血供较差和自我修复能力有限，损伤的肌腱组织愈合缓慢，易形成瘢痕组织，影响肌腱的韧性和力学性能，且经过修复后的肌腱常常易发生二次损伤。目前治疗肌腱损伤的方法分为非手术和手术治疗。非手术治疗主要包括口服非类固醇抗炎药^[1-2]、理疗^[3-4]、低强度的脉冲超声刺激和冰冻疗法等^[5-8]，这些措施能缓解疼痛症状，但未从根本上恢复肌腱的完整性和机械强度。而手术方法现多采用端端吻合、自体肌腱移植、人工肌腱移植、异种肌腱移植或同种异体肌腱移植，但仍然面临着一些问题。端端吻合方式修复的肌腱因术后长时间制动易造成粘连，后期松解粘连增加了患者的痛苦和经济负担；自体肌腱移植受到取材的限制；人工肌腱移植近期效果尚可，但远期出现降解、异物反应等问题；异种肌腱或同种异体肌腱移植存在着一定的排异反应。

为解决这一难题，必须寻找一种更加理想的且符合肌腱生理结构的肌腱替代品。近年来很多组织工程产品不仅解决了术后粘连的问题，而且解决了肌腱修复替代材料不足的难题，肌腱损伤的治疗有了很大突破。在肌腱组织工程技术应用过程中，如何构建出更符合人类解剖生理的肌腱组织是目前面临的严峻挑战。肌腱组织工程是基于正常肌腱的生理结构和力学性能，通过组织工程技术所构建出人工肌腱用于修复肌腱损伤/缺损。

肌腱组织工程所研究的重点内容主要包括3个方面：种子细胞、与肌腱再生相关的生物活性因子及支架材料。通过对这3方面的研究，进一步构建出理想的组织工程肌腱。已有研究者对肌腱干细胞^[9]、胚胎间充质干细胞^[10]、脂肪间充质干细胞^[11-12]、骨髓间充质干细胞及牙周膜或牙龈组织源性间充质干细胞等通过细胞治疗方式或联合支架构建组织工程肌腱对损伤肌腱进行修复^[13-16]，并取得了显著效果。虽然种子细胞和支架材料对于肌腱组织工程的作用至关重要，但值得注意的是，生物活性因子在肌腱组织工程中的地位也是不容忽视的。到目前为止，对于肌腱各个发育阶段标志物的了解还不完全清楚，但许多研究已经发现了一些关键的转录因子。近年来研究证实Mkx是肌腱形成、发育、分化的关键因子之一，对于诱导干细胞成肌腱分化构建组织工程肌腱，在体外和体内都起着十分重要的作用^[13^，^17]。

文章通过Mkx的分子结构、分布、功能以及在肌腱分化过程中的信号通路等方面进行总结，并对干细胞的物种来源和不同细胞系以及不同细胞因子对Mkx在肌腱组织工程中的不同影响等方面的研究新进展进行综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程