体外震波对骨微血管内皮细胞生理功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.005

摘要/Abstract

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文题释义：
能流密度：是在一定空间范围内，单位面积(如平方米)所能取得的或单位质量(如kg)能源所能产生的某种能源的能量或功率，是评价能源的主要指标之一。
体外震波：作为一种特殊类型的外源性物理作用信号，通过刺激、激活内皮细胞上机械力学信号感受器，继而进一步激活细胞内特殊信号传导系统，调控内皮细胞基因表达，而对内皮细胞生理功能产生影响。

摘要
背景：体外震波作为一种特殊类型的外源性物理作用信号，通过刺激、激活内皮细胞上机械力学信号感受器，激活细胞内特殊信号传导系统，调控内皮细胞基因表达，对内皮细胞生理功能产生影响。
目的：观察不同能流密度及作用次数体外震波对股骨头骨微血管内皮细胞成血管能力、迁移能力及抗凋亡作用的影响。
方法：从关节置换患者股骨头获取股骨头骨松质，分离、培养、传代培养股骨头骨微血管内皮细胞。通过血管性血友病因子、CD31血管内皮细胞标记物抗体进行免疫荧光鉴定。根据体外震波不同能流密度(低0.03 mJ/mm2，高0.11 mJ/mm2)及不同作用次数(400次，800次)对细胞进行分组。通过细胞3D培养实验观察内皮细胞成血管能力，划痕实验观察内皮迁移能力，流式细胞仪检测内皮细胞凋亡情况。
结果与结论：①从股骨头松质骨中分离、培养出的细胞均能表达血管性血友病因子、CD31，表明这些细胞具有血管内皮细胞的特征，阳性率接近100%；②体外震波作用于股骨头骨微血管内皮细胞提高其体外成血管能力及迁移能力，低能流密度组促进成血管能力和细胞迁移能力显著优于高能流密度组，高能流密度组内随着作用次数的增加促成血管能力下降；③对于激素诱导股骨头骨微血管内皮细胞凋亡有保护作用；④结果说明，体外震波对股骨头骨微血管内皮细胞生理功能的影响与作用能流密度及作用次数相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-1483-1302(左伟)

关键词: 组织构建, 血管内皮细胞, 体外震波, 骨微血管内皮细胞, 成管实验, 划痕实验, 流式细胞凋亡实验

Abstract:

BACKGROUND: Extracorporeal shock wave has been shown to influence the physiological function of endothelial cells via the activation of mechanoreceptors and specific signal transduction system, and gene expression regulation.
OBJECTIVE: To explore the impact of different energy flow densities and numbers of shots of extracorporeal shock waves on the new vessel formation ability, migration capability and apoptosis of bone microvascular endothelial cells.
METHODS: Bone microvascular endothelial cells isolated from the femoral head of patients undergoing arthroplasty were subcultured in vitro, and then were immunofluorescently evaluated with endothelial cell marker antibodies to CD31 and von Willebrand factor (vWF), and grouped according to different energy flow densities (low, 0.03 mJ/mm2; high, 0.11 mJ/mm2) and numbers of shots (400 and 800). Capillary-like tube formation, migration capability and apoptosis of bone microvascular endothelial cells were determined by 3-D culture in vitro, scratch test, and flow cytometry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: vWF and CD31 were positively expressed in approximately 100% of bone microvascular endothelial cells, which indicates the cultured cells had characterization of microvascular endothelial cells. Extracorporeal shock wave enhanced angiogenesis and migration capability of bone microvascular endothelial cells derived from the femoral head, and especially low-energy flow density of extracorporeal shock wave exerted more superior effects. Angiogenesis of bone microvascular endothelial cells was decreased with the increased shot number in the low-energy flow density group. In addition, extracorporeal shock wave inhibited bone microvascular endothelial cell apoptosis induced by steroids. Our results suggest that energy flow density and number of shots of extracorporeal shock waves impact the physiological function of bone microvascular endothelial cells derived from the femoral head.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Physical Therapy Modalities, Microvessels, Endothelial Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

左伟，高福强，李配瑶，孙伟，李子荣，时令军. 体外震波对骨微血管内皮细胞生理功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(37): 5504-5510.

Zuo Wei, Gao Fu-qiang, Li Pei-yao, Sun Wei, Li Zi-rong, Shi Ling-jun. Impact of extracorporeal shock waves on physiological function of bone microvascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(37): 5504-5510.

图/表（结果） 3

2.1 细胞培养结果培养1周后呈现典型的“铺路石”状(图1)。此时可行传代培养，传代培养细胞形态相对一致，呈现长条、多角状。使用免疫组织化学染色法检测细胞血管性血友病因子及CD31表达情况，在荧光显微镜下观察见细胞表达血管性血友病因子及CD31接近100%，表明这些细胞为内皮细胞。

2.2 体外成管实验结果 5组细胞成管数量比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。组间两两相比较，E1 400次组、E1 800次组及E2 400次组成管数量明显高于对照组(P < 0.05)。E2 800次组与对照组相比成管数差异无显著性意义(P > 0.05)。E1 400次组与E1 800次组间差异无显著性意义(P > 0.05)。E2 400次组与E2 800次组间差异有显著性意义(P < 0.05)。E1 400次组及E1 800次组均与E2 400次和E2 800次组间差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图2和图3。

2.3 划痕检测体外震波对于骨微血管内皮细胞迁移能力的影响在0 h时5组镜下均显示边缘整齐的划痕。 24 h时5组细胞迁移能力比较，差异有显著性意义(F=45.48，P < 0.05)。组间两两相比，E1 400次组与E1 800次组与对照组相比，细胞迁移能力增强，差异有显著性意义(P < 0.05)。E2 400次组与E2 800次组与对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1和图4。

2.4 激素诱导损伤后细胞凋亡比例和存活比例激素诱导前使用E1 400次组作用于细胞，早期凋亡细胞比例下降(P < 0.05)，晚期凋亡及坏死比例下降(P < 0.05)，活细胞比例上升(P < 0.05)；激素诱导前使用E1 800次组作用于细胞，早期凋亡细胞比例为与对照组比较差异

无显著性意义(P > 0.05)，晚期凋亡比例显著下降(P < 0.05)，活细胞比例上升(P < 0.05)。

E2 400次组早期凋亡及活细胞比例与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，晚期凋亡及坏死显著下降(P < 0.05)；E2 800次组早期凋亡、晚期凋亡及坏死以及活细胞比例与对照组比较差异均无显著性意义 (P > 0.05)，见表2，图5。

参考文献

引言

材料方法

1.1 设计细胞功能学观察实验。

1.2 时间及地点于2015年3至8月在中日友好医院临床研究所完成。

1.3 材料股骨头骨松质取自于2015年3至5月于中日友好医院行关节置换患者股骨头。

取材纳入标准：外伤性股骨颈及转子部骨折、髋关节骨性关节炎、先天性髋关节发育不良继发骨性关节病。

取材排除标准：股骨头无菌性坏死、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、累及髋关节的、血友病髋关节病变、髋关节结核、化脓性感染、以及髋关节周围肿瘤等患者。

共取股骨头标本10例，其中股骨颈骨折6例，股骨转子间骨折3例，1例先天性髋关节发育不良继发骨性关节炎。所有患者对实验知情同意，并签署知情同意书。

体外震波实验用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
体外震波仪	德国多尼尔公司
CO₂培养箱	GalaxyR，Eppendorf
倒置相差显微镜	Olympus IX71
3K3O型低温高速离心机	美国Sigma- Aldrich公司
胎牛血清	浙江天杭生物
M199 内皮细胞培养基	美国Hyclone
BD Matrigel基质胶	美国BD公司

1.4 实验方法

1.4.1 股骨头骨微血管内皮细胞的分离与传代培养在无菌条件下将用咬骨钳将股骨头标本松质咬成碎骨，然后将碎骨放入肝素化的内皮细胞培养管中，使用预热的HBSS液反复多次冲洗，去除油脂及细碎骨质。向冲洗干净的松质骨中加入培养基及Ⅰ型胶原酶(浓度至1.5%-2%)，放入37 ℃水浴中静置6-8 h后向其中加入胰蛋白酶(0.25%)-EDTA(0.53 mmol/L)消化液(终浓度至胰蛋白酶为0.1%，EDTA终浓度为0.2 mmol/L)，放入37 ℃水浴中10 min。用过滤筛滤除油脂及骨渣并收集细胞液。

将收集得到细胞悬液置于20 ℃ 2 000 r/ min中离心10 min。将离心得到沉底细胞混匀于10 mL配置好的完全性内皮细胞培养基中(配比成分：M199 培养基， 100 U/ mL青霉素，含100 mg/L链霉素，体积分数20%胎牛血清，40 U/ mL肝素，10 μg/ L血管内皮细胞生长因子)，得到悬液接种于2%明胶包被的培养皿当中，置于37 ℃和体积分数5%CO₂环境培养箱中。进行传代培养时须再次加入胰蛋白酶(终浓度0.1%)和EDTA(终浓度0.2 mmol/L)进行消化处理5 min，加入M199内皮细胞培养基并收集细胞液置于离心10 min，接种至2%明胶包被的细胞培养皿内传代。方法参照文献[14]。

1.4.2 股骨头骨微血管内皮细胞的鉴定选取血小板- 内皮细胞黏附分子1(PECAM-1/CD31)和血管性血友病因子作为作为生化标记物^[15-16]。取3代细胞接种于明胶包被的6孔板内，培养孔内放置有无菌盖玻片，待盖玻片上细胞覆盖率达50%以上时取出，使用磷酸盐缓冲液清洗后使用40 g/L多聚甲醛固定，使用0.1%三重氢核(Triton)孵育后体积分数10%胎牛血清封闭1 h，加入一抗4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液冲洗后加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的Ⅱ抗和Hoechst33342。以同型抗体的一抗作为阴性对照。

1.4.3 实验分组和样品处理选择上述原代培养的骨微血管内皮细胞，传代3次后平均分到5个直径6 cm培养皿内，在37 ℃，体积分数5%CO₂的培养环境中生长至70%-80%细胞融合，随机分为实验组和对照组。

实验组根据不同能流密度：低0.03 mJ/mm²(E1)、高 0.11 mJ/mm²(E2)，及不同作用次数：400次、800次，分为4小组，分次进行细胞体外成管能力实验及细胞迁移实验。当行凋亡保护实验时细胞平均分为6组，对照组当中增加激素对照组。

1.4.4 体外成管实验在经设定参数体外震波作用后，将细胞铺于铺有Matrigel(BDBiosciences)的24孔板上，每孔铺胶60 μL，每孔接种的细胞数为5×10⁴。后将其放入37 ℃、体积分数5%CO₂环境的培养箱中培养，后分别在2，4，8，12 h于共聚焦显微镜下观察成管情况，并于12 h拍照记录成管像。

1.4.5 细胞迁移实验在经设定参数体外震波作用后，内皮细胞行划痕实验。用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，每隔0.5-1.0 cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37 ℃体积分数5% CO₂培养箱培养。24 h后取样拍照。

1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡原代培养的骨微血管内皮细胞培养传代3次，在经设定参数体外震波作用后，继续培养72 h后加入低剂量(0.1 g/L)氢化可的松^[17]，再培养24 h诱导骨微血管内皮细胞损伤。收获细胞后以4 ℃预冷的流式细胞液(含体积分数2%牛血清白蛋白的PBS)洗细胞2次制成单细胞悬液。调整细胞浓度至 5×10⁹ L^-1，取100 μL细胞悬液加入5 μL的Annexin-FITC (eBioscience)和10 μL的20 ng/L碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，混匀后室温避光孵育15 min，用流式细胞液洗3次后再加入500 μL流式细胞液，流式细胞仪检测荧光强度。

用Coulter的流式分析软件分析活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡和坏死细胞比例并进行分析。

1.5 主要观察指标 ①细胞培养结果；②体外成管实验结果；③骨微血管内皮细胞迁移能力；④激素诱导损伤后细胞凋亡比例和存活比例。

1.6 统计学分析采用SPSSl9.0软件进行统计分析。均数比较采用非配对t 检验或者方差分析。当P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

内皮细胞生理功能不仅受到复杂的生化内环境的影响，且持续受到血流动力所带来的持续力学刺激调控^[18-21]。体外震波作为一种特殊类型的外源性物理作用信号，通过刺激、激活内皮细胞上机械力学信号感受器，继而进一步激活细胞内特殊信号传导系统，调控内皮细胞基因表达，而对内皮细胞生理功能产生影响^[22-24]。

3.1 体外震波促进股骨头骨微血管内皮细胞体外成管能力国内外诸多报道表明，体外震波可促进内皮细胞的体外成管能力。然而对于不同能流密度及不同作用次数对于体外成管能力的影响尚未有统一认识。Zhang 等^[25]报道利用低能量(0.012 mJ/mm²)1 000次体外震波作用于人脐静脉内皮细胞，可显著促进其体外成管能力，并提出其可能与体外震波激活内皮细胞的特异机械感受器，从而促进了成血管因子分泌增加相关。Nishida等^[26]提出使用高能量(0.09 mJ/mm²)500次作用于人脐静脉内皮细胞，可显著促进细胞体外成管能力。但上述研究并未做不同能流密度及不同作用次数的对照研究。而Sansone等^[27]首次比较了不同能流密度及作用对成管能力的影响，其结果表明，当使用低能流密度 (0.012 mJ/mm²) 200次时体外震波促进体外成管能力最为明显，且随着作用次数的增加并未进一步促进体外成管。

作者研究表明，在使用低能流密度(0.03 mJ/mm²)体外震波作用于可显著促进股骨头骨微血管内皮细胞的体外成管能力，而不同作用次数组(400次、800次)之间促进成管能力并无统计学差异。并且研究表明低能流密度组(0.03 mJ/mm²)促进成管能力显著优于高能流密度组(0.11 mJ/mm²)，在高能流密度组内随着作用次数的增加促成管能力下降。

3.2 体外震波促进股骨头骨微血管内皮细胞迁移能力此次实验使用划痕实验验证体外震波对股骨头骨微血管内皮细胞迁移能力的影响。结果表明低能流密度 (0.03 mJ/mm²)400次组及800次组显著促进细胞迁移能力，但组间结果并无统计学差异。且低能流密度组(0.03 mJ/mm²)促进细胞迁移能力明显优于高能流密度组(0.11 mJ/mm²)。并且高能流密度组(0.11 mJ/mm²)组与对照组相比未有统计学差异，表明高能流密度组并不能促进体外细胞的迁移能力。此前Zhang等^[25]研究结果表明在使用高能流密体外震波可显著促进体外脐静脉内皮细胞的迁移能力，此间差异可能与所用细胞不同有关，有待进一步相关试验验证。

3.3 体外震波保护细胞凋亡作用当前诸多研究显示股骨头微循环障碍是股骨头坏死发病的主要机制。其中股骨头骨微血管内皮细胞损伤和凋亡被认为是激素性股骨头血液循环障碍的始动因素和关键环节^[28]。此前研究建立了低剂量激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡模型^[29]。通过使用低剂量激素诱导骨微血管内皮细胞模型，结果表明当使用E1(0.03 mJ/mm²)400次组体外震波干预时细胞早期、晚期及总凋亡细胞数量减少，活细胞增多，提示此能流密度及作用次数的体外震波干预能够保护激素诱导的骨微血管内皮细胞凋亡，且与E1(0.03 mJ/mm²) 800次组结果并无统计学差异，提示在此能流密度等级体外震波作用下，其作用次数的增加对内皮细胞的生理功能影响无正相关作用。而E2(0.11 mJ/mm²)400次组与800次组结果与激素对照组结果并于统计学差异，提示使用高能流密度体外震波干预无保护内皮细胞凋亡作用。

综上实验结果表明，E1(0.03 mJ/mm²)体外震波能够显著提高股骨头骨微血管内皮细胞的成管及迁移能力，并且能够有效保护激素诱导所致的细胞凋亡，且E1(0.03 mJ/mm²)体外震波对骨微血管内皮细胞生理功能的影响与其作用次数无正相关性。而在研究中E2组(0.11 mJ/mm²)体外震波并未表现出对股骨头骨微血管内皮细胞生理功能的影响，推测可能与高能流密度的机械刺激对内皮细胞的损伤作用相关，其具体原因有待进一步研究。

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