雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.001

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (29): 4261-4268.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.001

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雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响

邓盎，张宏其，郭超峰，王昱翔，高琪乐，唐明星，刘少华，刘金洋

中南大学湘雅医院脊柱外科，湘雅脊柱外科中心，湖南省长沙市 410008

收稿日期:2016-04-24 出版日期:2016-07-08 发布日期:2016-07-08
通讯作者: 张宏其，博士，主任医师，博士生导师，中南大学湘雅医院脊柱外科，湘雅脊柱外科中心，湖南省长沙市 410008
作者简介:邓盎，男，1983年生，湖南省长沙市人，2011年中南大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱外科临床及相关基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81271940，81472145)

Silencing of estrogen receptor beta gene influences the expressions of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2 in human osteoblasts

Deng Ang, Zhang Hong-qi, Guo Chao-feng, Wang Yu-xiang, Gao Qi-le, Tang Ming-xing, Liu Shao-hua, Liu Jin-yang

Department of Spinal Surgery, the Affiliated Xiangya Hospital of Central South University, Xiangya Spinal Surgery Center, Changsha 410008, Hunan Province, China

Received:2016-04-24 Online:2016-07-08 Published:2016-07-08
Contact: Zhang Hong-qi, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spinal Surgery, the Affiliated Xiangya Hospital of Central South University, Xiangya Spinal Surgery Center, Changsha 410008, Hunan Province, China
About author:Deng Ang, M.D., Attending physician, Department of Spinal Surgery, the Affiliated Xiangya Hospital of Central South University, Xiangya Spinal Surgery Center, Changsha 410008, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81271940, 81472145

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
雌激素受体：是一种蛋白质分子，较多地存在于靶器官的细胞内，可与激素发生特异性结合而形成激素-受体复合物，使激素发挥其生物学效应。雌激素受体包括两大类，一是经典的核受体，包括ERα和ERβ，它们位于细胞核内，介导雌激素的基因型效应，即通过调节特异性靶基因的转录而发挥“基因型”调节效应；二是膜性受体，包括经典核受体的膜性成分以及属于G蛋白偶联受体家族的GPER1(GPR30)、Gaq-ER和ER-X，它们介导快速的非基因型效应，通过第二信使系统发挥间接的转录调控功能，其中一些似乎只在脑局部起作用。
基因沉默：是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。以前“基因沉寂”被理解为是真核生物染色体形成异染色质的过程，最近的研究表明“基因沉寂”与“异染色质”存在差异，尽管被沉寂的基因区段也呈高浓缩状态，但“基因沉寂”所形成的染色体构象并不完全等同与“异染色质”构象。两者还存在着基因表达调控程度上的差异，一般认为处于“基因沉寂”的染色质区的基因表达被“彻底”关闭，而“异染色质”状态的基因可能依然进行低水平的表达(转录)。

背景：雌激素受体β基因参与骨代谢的研究较少，其对骨代谢的具体调节机制仍不清楚。
目的：分析雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。
方法：实验分3组：空白对照组(即hFOB 1.19，未感染任何反转录病毒)、阴性对照组(即含无效干扰片断雌激素受体β-shRNA-nc)、最佳RNAi组(即ERβ-shRNA-3)。将前期最佳RNAi组的雌激素受体β-shRNA反转录病毒载体感染人成骨细胞，通过抗性筛选并扩大培养，利用MTT法检测雌激素受体β稳定抑制后对细胞增殖的影响；随后在雌激素干预下，通过Western blot技术检测雌激素受体β蛋白表达的稳定抑制效率，并使用半定量RT-PCR和Western blot技术检测雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。
结果与结论：①成功筛选出稳定感染ERβ-shRNA-3反转录病毒载体的人成骨细胞，MTT法检测显示雌激素受体β稳定抑制后对细胞的增殖没有明显影响(P > 0.05)；②在雌激素干预下，雌激素受体β蛋白的抑制率为(93.11±0.57)% (P < 0.05)，且雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1 mRNA和蛋白的上调率分别为(26.65±3.81)%和(23.79±3.76)%，骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的上调率分别为(16.62±1.71)%和(18.08±3.20)% (均P < 0.05)；③结果提示雌激素受体β可能通过调控转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达在骨代谢中发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9260-620X(邓盎)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 雌激素受体β, 人成骨细胞, RNA干扰, 转化生长因子β1, 骨形态发生蛋白2, 基因沉默, 骨代谢, 雌激素, 反转录病毒, 细胞模型, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are few studies concerning estrogen receptor β gene, and its mechanism of regulating the bone metabolism is still unclear now.
OBJECTIVE: To analyze the effect of estrogen receptor β (ER β) silencing on the expressions of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in human osteoblasts
METHODS: There were three groups: blank control group (hFOB 1.19 uninfected with any retrovirus); negative control group (containing invalid interference fragment ER β-shRNA-nc); optimal RNAi group (ER β-shRNA-3). ER β-shRNA retroviral vectors in the optimal RNAi group were used to transfect human osteoblasts followed by resistance screening and cell expansion. MTT assay was used to detect the proliferative activity of ER β-silenced osteoblasts. Then under estrogen intervention, the stable inhibition rate of ER β was determined using western blot assay, and the expressions of TGF-β1 and BMP-2 in human osteoblasts after ER β silencing were detected by RT-PCR technology and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Human osteoblasts that were stably transfected by ER β-shRNA-3 retroviral vector was selected successfully, and ER β silencing had no significant influence on the cell proliferation (P > 0.05). Under the interference of estrogen, the silencing efficiency of ER β protein was (93.11±0.57)% (P < 0.05), and after ER β silencing, the expressions of TGF-β1 and BMP-2 were increased by (26.65±3.81)% and (16.62±1.71)% at mRNA level, and increased by (23.79±3.76)% and (18.08±3.20)% at protein level (both P < 0.05). In conclusion, ER β may play an important role in bone metabolism by regulating the expressions of TGF-β1 and BMP-2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Estrogen receptor beta, Osteoblasts, Transforming Growth Factor beta 1, Bone Morphogenetic Protein 2

中图分类号:

R318

邓盎，张宏其，郭超峰，王昱翔，高琪乐，唐明星，刘少华，刘金洋. 雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4261-4268.

Deng Ang, Zhang Hong-qi, Guo Chao-feng, Wang Yu-xiang, Gao Qi-le, Tang Ming-xing, Liu Shao-hua, Liu Jin-yang. Silencing of estrogen receptor beta gene influences the expressions of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2 in human osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4261-4268.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Windahl SH, Norgard M, Kuiper GG, et al.Cellular distribution of estrogen rece ptor beta in neonatal rat bone. Bone.2000;26(2): 117-121.
[2] Shoukry A, Shalaby SM, Etewa RL, et al.Association of estrogen receptor β and estrogen-related receptor α gene polymorphisms with bone mineral density in postmenopausal women. Mol Cell Biochem.2015；405(1-2):23-31.
[3] Claros S, Rico-Llanos GA, Becerra J, et al. A novel human TGF-β1 fusion protein in combination with rhBMP-2 increases chondro-osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Mol Sci. 2014;15(7):11255-11274.
[4] 邓盎, 张宏其, 郭超峰, 等.利用RNAi技术稳定抑制ERβ表达的人成骨细胞株hFOB 1.19细胞模型的建立[J].中国脊柱脊髓杂志, 2012, 22(8): 722-728.
[5] Nelson ER, Habibi HR.Estrogen receptor function and regulation in fish and other vertebrates. Gen Comp Endocrinol.2013;192:15-24.
[6] Vivar OI, Zhao X, Saunier EF, et al. Estrogen receptor beta binds to and regulates three distinct classes of target genes. J Biol Chem.2010;285(29): 22059-22066.
[7] Nott SL, Huang Y,Fluharty BR,et al.Do Estrogen Receptor beta Polymorphisms Play A Role in the Pharmacogenetics of Estrogen Signaling? Curr Pharmacogenomics Person Med.2008;6(4): 239-259.
[8] Zhao C, Dahlman-Wright K, Gustafsson JA. Estrogen receptor beta: an overview and update. Nucl Recept Signal.2008;6: e003.
[9] Syed FA,Fraser DG,Monroe DG,et al.Distinct effects of loss of classical estrogen receptor signaling versus complete deletion of estrogen receptor alpha on bone. Bone.2011;49(2):208-216.
[10] Spelsberg TC, Subramaniam M, Riggs BL, et al. The actions and interactions of sex steroids and growth factors/cytokines on the skeleton. Mol Endocrinol, 1999,13(6): 819-828.
[11] Syed FA, Mödder UI, Fraser DG, et al. Skeletal effects of estrogen are mediated by opposing actions of classical and nonclassical estrogen receptor pathways. J Bone Miner Res.2005;20(11):1992-2001.
[12] Vico L, Vanacker JM. Sex hormones and their receptors in bone homeostasis: insights from genetically modified mouse models. Osteoporos Int. 2010;21(3): 365-372.
[13] Windahl SH, Vidal O, Andersson G, et al. Increased cortical bone mineral content but unchanged trabecular bone mineral density in female ERbeta(-/-) mice. J Clin Invest.1999;104(7): 895-901.
[14] Lindberg MK, Alatalo SL, Halleen JM, et al.Estrogen receptor specificity in the regulation of the skeleton in female mice.J Endocrinol,2001;171(2): 229-236.
[15] Sims NA, Dupont S, Krust A, et al. Deletion of estrogen receptors reveals a regulatory role for estrogen receptors-beta in bone remodeling in females but not in males. Bone.2002;30(1):18-25.
[16] Sims NA, Clément-Lacroix P, Minet D, et al. A functional androgen receptor is not sufficient to allow estradiol to protect bone after gonadectomy in estradiol receptor-deficient mice. J Clin Invest.2003;111(9): 1319-1327.
[17] Chagin AS, Lindberg MK, Andersson N, et al. Estrogen receptor-beta inhibits skeletal growth and has the capacity to mediate growth plate fusion in female mice. J Bone Miner Res.2004;19(1): 72-77.
[18] Delaisse JM. The reversal phase of the bone-r emodeling cycle: cellular prerequisites for coupling resorption and formation. Bonekey Rep, 2014, 3:561.
[19] Soltanoff CS, Yang S, Chen W, et al. Signaling networks that control the lineage commitment and differentiation of bone cells. Crit Rev Eukaryot Gene Expr.2009; 19(1): 1-46.
[20] Gingery A, Bradley EW, Pederson L, et al.TGF-beta coordinately activates TAK1/MEK/AKT/NFkB and SMAD pathways to promote osteoclast survival.Exp Cell Res.2008;314(15): 2725-2738.
[21] Yamada Y, Miyauchi A, Goto J, et al.Association of a polymorphism of the transforming growth factor-beta1 gene with genetic susceptibility to osteoporosis in postmenopausal Japanese women. J Bone Miner Res.1998;13(10): 1569-1576.
[22] Bosetti M, Boccafoschi F, Leigheb M, et al. Effect of different growth factors on human osteoblasts activities: a possible application in bone regeneration for tissue engineering. Biomol Eng.2007;24(6): 613-618.
[23] Jenner JM, van Eijk F, Saris DB, et al.Effect of transforming growth factor-beta and growth differentiation factor-5 on proliferation and matrix production by human bone marrow stromal cells cultured on braided poly lactic-co-glycolic acid scaffolds for ligament tissue engineering. Tissue Eng. 2007;13(7): 1573-1582.
[24] Xu Y, James AW, Longaker MT.Transforming growth factor-beta1 stimulates chondrogenic differentiation of posterofrontal suture-derived mesenchymal cells in vitro. Plast Reconstr Surg.2008;122(6): 1649-1659.
[25] Slater M, Patava J, Kingham K, et al. Modulation of growth factor incorporation into ECM of human osteoblast-like cells in vitro by 17 beta-estradiol.Am J Physiol.1994;267(6 Pt 1): E990-1001.
[26] Hughes DE, Dai A, Tiffee JC, et al.Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nat Med.1996;2(10): 1132-1136.
[27] Zhu S, Zhang T, Sun C, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combined with calcium alginate gel modified by hTGF-β1 for the construction of tissue-engineered cartilage in three-dimensional conditions. Exp Ther Med. 2013;5(1):95-101.
[28] DeLong WG Jr, Einhorn TA, Koval K, et al. Bone grafts and bone graft substitutes in orthopaedic trauma surgery. A critical analysis. J Bone Joint Surg Am.2007; 89(3): 649-658.
[29] Luu HH, Song WX, Luo X, et al. Distinct roles of bone morphogenetic proteins in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J Orthop Res.2007; 25(5): 665-677.
[30] Hsu YL, Liang HL, Hung CH, et al. Syringetin, a flavonoid derivative in grape and wine, induces human osteoblast differentiation through bone morphogenetic protein-2/extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway. Mol Nutr Food Res. 2009;53(11): 1452-1461.
[31] Zoricic S, Maric I, Bobinac D, et al. Expression of bone morphogenetic proteins and cartilage-derived morphogenetic proteins during osteophyte formation in humans. J Anat.2003;202(Pt 3): 269-277.
[32] Huang W,Rudkin GH,Carlsen B,et al.Overexpression of BMP-2 modulates morphology, growth, and gene expression in osteoblastic cells. Exp Cell Res. 2002; 274(2):226-234.
[33] Sun J, Li J, Li C, et al. Role of bone morphogenetic protein-2 in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Mol Med Rep.2015;12(3):4230-4237.
[34] Hertrampf T, Gruca MJ, Seibel J, et al.The bone-protective effect of the phytoestrogen genistein is mediated via ER alpha-dependent mechanisms and strongly enhanced by physical activity. Bone.2007; 40(6):1529-1535.
[35] Lindberg MK,Movérare S,Eriksson AL,et al. Identification of estrogen-regulated genes of potential importance for the regulation of trabecular bone mineral density.J Bone Miner Res.2002;17(12): 2183-2195.
[36] Monroe DG, Getz BJ, Johnsen SA, et al. Estrogen receptor isoform-specific regulation of endogenous gene expression in human osteoblastic cell lines expressing either ERalpha or ERbeta.J Cell Biochem. 2003;90(2):315-326.
[37] 王昱翔,张宏其,郭超峰,等. 雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41):7188-7198.
[38] 王昱翔,张宏其,郭超峰,等.人雌激素β受体RNAi反转录病毒载体在人成骨样MG63细胞中的表达[J].中国组织工程研究, 2012,16(42):7830-7836.
[39] 鲁世金,张宏其,高其乐,等. 雌激素受体基因ERβ与小鼠成骨细胞的增殖和分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(28):5157-5160.
[40] 白旭华.雌激素受体与绝经后骨质疏松症[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(37):7398-7400.

引言

材料方法

1.1 设计基因学体外实验。

1.2 时间及地点于2011年3月至2014年5月在中南大学医学遗传学国家重点实验室完成。

1.3 材料

雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响实验细胞、质粒及试剂：
细胞、质粒及试剂	来源
人成骨细胞株hFOB 1.19	中国科学院细胞库
反转录病毒质粒pRNAT-H1.4/Retro (Catalogue No.:SD1253)及GP2-293包装细胞	南京金斯瑞
兔抗人转化生长因子β1一抗、羊抗人骨形态发生蛋白2一抗、兔抗人雌激素受体β一抗	Santa Cruz公司
鼠抗人β-actin一抗	Sigma公司
辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗、辣根过氧化物酶标记鼠抗羊二抗、辣根过氧化物酶标记鼠抗兔二抗	Jackson公司
17β-雌二醇	Sigma-Aldrich公司
DMEM/F-12培养液(无酚红)	Gibco公司
反转录试剂盒	Promega公司
PVDF 膜	Pierce Chemical公司
ECL试剂盒	Lumigen公司
所有引物	由上海生物工程公司合成

1.4 实验方法

1.4.1 雌激素受体β基因沉默的人成骨细胞株hFOB 1.19细胞模型的建立根据前期研究结果^[4]，实验分3组：空白对照组(即hFOB 1.19，未感染任何反转录病毒)、阴性对照组(即含无效干扰片断雌激素受体β-shRNA-nc)、最佳RNAi组(即ERβ-shRNA-3)。取对数生长期的hFOB 1.19细胞，接种于12孔板，于34 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养12 h，将收集的反转录病毒加polybrene至5 mg/L，0.45 μm微型滤器过滤，分别加入上述细胞中，24 h后更换为新鲜无酚红DMEM/F-12完全培养基，恢复培养24 h后，观察荧光表达情况。

将感染后的hFOB 1.19细胞，换新鲜完全培养基恢复培养24 h后，以2×10⁵/皿传入内径60 mm培养皿，移入34 ℃、含体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养48 h；加入终浓度为100 mg/L的潮霉素进行筛选，每3 d换液，直至未感染细胞全部死亡，继续培养至14 d；24孔板中加入维持培养基(潮霉素较原筛选浓度减半，50 mg/L)，每孔0.5 mL；然后将培养皿随机放于倒置显微镜下，选取待挑克隆，克隆被选取的条件为在4倍目镜下大于半个显微镜视野，随机的方法为镜下观察培养皿后见到的第一个克隆，在镜下直接用灭菌中Tip小心撮取细胞克隆，边撮边吸，将吸取的细胞吹打到24孔板中，注意Tip头要完全在克隆内部操作，不要接触与吸到其他克隆；因反转录病毒载体感染的高效和稳定性，抗性克隆数目很多，每个培养皿按上述步骤挑取五六个克隆；24孔板中的单克隆细胞在24 h后换维持培养基；将稳定感染克隆传代、扩大培养2个月(扩大培养中及时冻存部分细胞)，以用于后续的研究。

1.4.2 四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖取对数生长期的各实验组细胞，以1 000细胞/孔接种于96孔板中，每组设3复孔，于34 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养；分别于1，2，3，4，5，6，7 d进行检测。每孔加入MTT (5 g/L) 20 μL，继续培养4 h；吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜150 μL，室温振荡10 min，同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，酶标仪上490 nm测定各孔吸光度A值，以A值表示细胞增殖能力大小，各组取3孔平均值，相同条件下实验重复3次，绘制生长曲线。

1.4.3 半定量RT-PCR检测雌激素受体β基因沉默对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2 mRNA表达的影响各实验组细胞加入终浓度为10^-8 mol/L的17β-雌二醇继续培养48 h后，消化计数，置于Eppendorf管中，以 12 000×.3g、4 ℃离心1 min；加Trizol细胞裂解液抽提各实验组细胞的总RNA，根据反转录试剂盒(Promega公司)操作说明进行RT反应，然后通过PCR反应扩增转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2目的基因。登陆GeneBank网，获得转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2和β-actin mRNA序列后，在Primer Premier 6.0软件设计引物。

扩增条件为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，以上35个循环，然后72 ℃ 10 min；反应完成后通过凝胶成像测灰度行数据分析，测定转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2与β-actin扩增产物条带的吸光度值，并算出二者比值，即各实验组转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的相对表达量；转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的相对表达率=实验组转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的相对表达量/空白对照组的相对表达量，反之，上调率=相对表达率-1。每组设置3复孔，实验在相同条件下重复3次。

1.4.4 Western blot检测雌激素受体β基因沉默对雌激素受体β、转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2蛋白表达的影响各实验组加入终浓度为10^-⁸mol/L的17β-雌二醇继续培养48 h后，加入细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，经12% SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，封闭后与特异性一抗(兔抗人雌激素受体β抗体，兔抗人转化生长因子β1抗体，羊抗人骨形态发生蛋白2抗体，鼠抗人β-actin抗体)置于转轱上，100 r/min，室温下孵育 1 h。洗一抗后再加二抗，室温下孵育1 h，加入ECL液，暗室中曝光2 min，X射线片显影，再通过凝胶成像测灰

度行数据分析，分析方法与1.4.3半定量RT-PCR相同。

1.5 主要观察指标 ①雌激素受体β基因沉默的人成骨细胞株hFOB1.19细胞模型的建立；②半定量RT-PCR检测雌激素受体β基因沉默对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2 mRNA表达的影响；③Western blot检测雌激素受体β基因沉默对雌激素受体β、转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2蛋白表达的影响。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，方差齐性时采用SNK检验，方差不齐时采用Dunnett’C检验；以α=0.05为显著性检验水准，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

雌激素受体属于类固醇激素受体家族，是一种配体依赖的转录因子，与雌激素结合后雌激素受体被激活并发生构象改变，随后雌激素受体转移到细胞核内与靶基因上特异的雌激素反应元件(Estrogen responsive element，ERE)结合，从而调控靶基因的转录活动^[5-8]。

近些年研究表明雌激素可通过雌激素受体介导在骨骼生长和维持骨质方面起重要作用，而且骨组织对这些配体的反应性与雌激素受体表达水平相关^[9-12]。而成骨细胞中雌激素受体α与雌激素受体β mRNA表达的不同比例可能与培养条件、细胞类型及细胞周期有关。雌激素受体α和雌激素受体β共表达提示在成骨细胞中可能具有相互调控的作用；但两者表达的差异又说明它们具有不同的功能，对成骨细胞的调节有差异性。

雌激素受体基因敲除鼠模型的建立对雌激素受体作用的研究有极大的推动作用。Windahl等^[13]研究表明雌激素受体α基因敲除(ERKO)小鼠的骨密度低于对照组，相反雌激素受体β基因敲除(BERKO)小鼠的骨密度高于对照组，原因可能是雌激素通过雌激素受体α的作用刺激成骨细胞的活性，而通过雌激素受体β抑制成骨细胞的活性。

另一些学者认为雌激素受体α和雌激素受体β在骨保护作用中可能存在既相互竞争又相互补充的关系^[14-15]。之后Sims等^[16]发现雌激素对去势后雌激素受体β基因敲除小鼠的骨保护作用略逊于野生型小鼠，而雌激素对去势后雌激素受体α基因敲除雌性小鼠弥补骨质丢失的程度非常低，推测雌激素主要通过雌激素受体α介导骨保护作用，雌激素受体β可能起辅助作用，在雌激素受体α受影响时，雌激素受体β自动上调来弥补不足。

最近又发现DERKO和雌激素受体β基因敲除小鼠的长骨生长板长期保持不闭和状态，而雌激素受体α基因敲除小鼠的长骨生长板却坚固闭和，并且雌激素受体β基因敲除小鼠的纵向骨和四肢骨均出现相对地快速增长，说明雌激素受体β可能存在抑制生长板软骨细胞增殖及促进生长板闭和的作用，从而抑制纵向骨和四肢骨的生长，但仍需进一步探索研究^[17]。

正常骨代谢周期中，成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收相互偶联，维持一种动态平衡，不断进行骨重建。当破骨细胞的骨吸收相对增强或成骨细胞的骨形成相对减弱，骨吸收大于骨形成导致骨质丢失时，将导致骨质疏松^[18]。多种骨生长因子在骨形成和骨改建过程通过调控细胞的活动起着十分重要的作用^[19-20]。其中，转化生长因子β1能直接刺激成骨细胞中DNA的合成与重组，从而促进成骨细胞的分裂、增殖、成熟^[3^，^21-24]。

Slater等^[25]发现17β-雌二醇能促进人成骨细胞的转化生长因子β1基因转录，培养液中转化生长因子β1生物活性升高。Hughes等^[26]认为转化生长因子β1可促进破骨细胞的凋亡，推测骨质疏松患者骨小梁中转化生长因子β1含量下降，如给予外源性转化生长因子β1，不但增强骨形成，还可减轻破骨细胞的骨吸收，有利于骨质疏松的防治。

转化生长因子β不仅调节成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞生长分化，还调节细胞外基质的合成与降解，调节骨组织中其他生长因子在骨、软骨组织中的表达和作用^[27]。而骨形态发生蛋白2是最主要的骨形成调控因子^[28-32]。

一些研究表明骨形态发生蛋白2对于大多数的骨基质蛋白都有着强烈的增殖和表达效应^[33]，并可矿化人成骨细胞；在体外，骨形态发生蛋白2可直接刺激成骨细胞的形成和成熟活性，是成骨细胞分化和人骨细胞形成的有效促进物。Hertrampf等^[34]认为去势小鼠的骨密度和骨形态发生蛋白2的表达明显下降，而补充雌二醇后可上调骨形态发生蛋白2，而起到骨保护作用。

关于雌激素受体β基因敲除(BERKO)鼠模型的研究中，Lindberg等^[35]认为雌激素受体β基因敲除小鼠相对于野生型小鼠的转化生长因子β1的表达水平有所提高，表明雌激素受体β可能参与调节转化生长因子β1基因的表达。此外，还有一些研究结果也表明，雌激素受体β可能通过协助雌激素受体α来调节转化生长因子β及骨形态发生蛋白基因的表达^[34^，^36]。但在这些动物模型中，雌激素受体β对骨代谢的具体调节机制仍不清楚。

因此，为了更详细地阐述雌激素受体β是如何调节人成骨细胞中转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达而影响骨代谢，研究中作者在成功建立了雌激素受体β基因沉默的hFOB 1.19细胞模型的基础上，在雌激素干预下，通过半定量RT-PCR和Western blot检测发现，雌激素受体β-shRNA-3组的转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达显著高于ERβ- shRNA-nc组及hFOB 1.19组。

这些结果提示雌激素可能通过雌激素受体β下调人成骨细胞株hFOB 1.19中转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达，从而在骨代谢中发挥作用。然而，人成骨细胞中雌激素受体β基因对骨代谢的调节是个复杂的过程^[37-40]，其还通过哪些具体分子信号通路调节骨代谢，有待进一步研究与探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响

Silencing of estrogen receptor beta gene influences the expressions of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2 in human osteoblasts

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[1]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[2]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[3]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[4]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[5]	郑小龙, 何晓铭, 龚水帝, 庞凤祥, 杨帆, 何伟, 刘少军, 魏秋实. 酒精性股骨头坏死患者的骨转换特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 657-661.
[6]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[7]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.
[8]	唐小凯, 李伟明. Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3914-3920.
[9]	杨彩会, 刘启成, 董明, 王丽娜, 左美娜, 陆颖, 牛卫东. 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶促进慢性根尖周炎模型小鼠的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3654-3659.
[10]	霍花, 程余婷, 周倩, 齐昱晗, 伍超, 石前会, 杨童景, 廖健, 洪伟. 种植体表面药物涂层对骨结合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3558-3564.
[11]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[12]	刘波, 陈祥和, 杨康, 孙昌亮, 余慧琳, 陆鹏程. 骨代谢紊乱的表观遗传重编程与运动调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3210-3218.
[13]	童洁, 廖瑛, 陈政宇, 孙光华. 骨关节炎软骨细胞自噬及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3246-3251.
[14]	余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.
[15]	马笃军, 彭力平, 陈锋, 蒋顺琬, 姜劲挺, 高坤, 林展鹏. 基因编辑技术在骨关节炎基因治疗中的作用与意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 298-303.